CN105198954B

CN105198954B - 通关藤中c21甾类化合物及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN105198954B
Application number: CN201510527923.7A
Authority: CN
Inventors: 袭荣刚; 王晓波; 白爽; 高慧媛; 王达
Original assignee: No210 Hospital Pla
Current assignee: No210 Hospital Pla
Priority date: 2015-08-25
Filing date: 2015-08-25
Publication date: 2017-08-25
Anticipated expiration: 2035-08-25
Also published as: CN105198954A

Abstract

本发明属于医药技术领域，涉及通关藤中C₂₁甾体类化合物的制备及其在防治骨质疏松领域中的应用。本发明公开了一种如式（I）和（II）的C₂₁甾类化合物及其盐，R₁‑R₅如说明书和权利要求书所述。本发明的化合物具有很好的防治骨质疏松作用，可以和药学上可接受的载体结合制备临床上可接受的药物，用于治疗骨质疏松。

Description

通关藤中C21甾类化合物及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于医药技术领域，涉及通关藤中C₂₁甾体类化合物的制备及其在防治骨质疏松领域中的应用。

背景技术

近年来，老年人群中骨质疏松症的发病率呈明显的上升趋势，严重影响了老年人的生活质量。骨质疏松症存在成骨细胞数量相对不足或功能下降，若能促进成骨细胞的增殖能力，提高细胞的总体功能，可增强成骨能力、改善骨代谢平衡，对骨质疏松的预防有重要作用。通过大量的研究报道，我们可知中药对骨代谢有综合的、整体调节作用，具有防治骨质疏松的功效，且副作用小，具有良好的应用前景。

通关藤为萝藦科牛奶菜属植物通关藤[Marsdenia tenacissima(Roxb.)Wight etArn.]的干燥藤茎，别名乌骨藤、奶浆藤、通天散等，广泛分布于亚洲的热带和亚热带地区，在我国云南、贵州、广东、福建、台湾等地也有分布。通关藤是我国常用的民族药材，其味苦、微寒，能清热解毒、止咳平喘、散结止痛，现代药理研究表明，通关藤中化学成分具有抗癌、平喘、降压、抑菌、免疫调节、保肝利尿等作用，药用价值开发潜力巨大。通关藤中含有大量的C₂₁甾体类成分，该类成分具有广泛的药理活性。我们对通关藤醇提取物中化学成分进行研究，并对所分得的成分进行体外抗骨质疏松活性筛选、考察。

近年来，很多研究人员对通关藤的化学成分及活性进行了深入的研究，发现通关藤中的C₂₁甾体类化合物具有很强的抗肿瘤活性。但目前国内外还未见有关于通关藤C₂₁甾体类化合物具有防治骨质疏松作用的文献报道和专利公开。

发明内容

本发明公开了一种如式(I)和(II)的C₂₁甾类化合物及其盐：

其中，母核由A、B、C、D四个环骈合而成，A/B、C/D分别有顺式或反式骈合两种方式，B/C环反式骈合，C_5，6位可有双键存在；C8、C14位可有羟基取代，或与氧形成含氧三元环；R₁为氢或糖基，糖数目n＝1～5(1，2，3，4，5)，所述糖基为阿洛糖、夹竹桃糖、磁麻糖、黄夹竹桃糖、洋地黄毒糖和葡萄糖及其衍生物中的一种或多种；R₂、R₃为C1-C10酰基，包括巴豆酰基、乙酰基、丙酰基、丁酰基、异丁酰基、苯甲酰基、对羟基苯甲、乙酰基；R₄为氢或羟基；R₅为氢或C1-C10酰基，所述酰基为巴豆酰基、乙酰基、丙酰基、丁酰基、异丁酰基、苯甲酰基、对羟基苯甲、乙酰基。

本发明优选具有如下结构的C₂₁甾类化合物:

其中，母核由A、B、C、D四个环骈合而成，A/B和C/D分别有顺式或反式两种骈合方式，B/C环反式骈合；

本发明优选具有如下结构的C₂₁甾类化合物:

其中，C8、C14位与氧形成含氧三元环。

本发明优选具有如下结构的C₂₁甾类化合物:

其中，R₄为氢。

本发明所说的对天然来源的C₂₁甾体类化合物开展的化学反应和结构修饰，是指本领域采用的常规化学方法，包括对天然来源的C₂₁甾体类化合物纯品或其混合物实施水解，断开糖链，除去原有酯基，得到含有多个羟基的衍生物或将多羟基的衍生物与酸酐、酰卤反应，将游离的羟基酯化，得到半合成C₂₁甾体类化合物的方法。

本发明所提供的11种化合物的结构、名称如下。

化合物1-11结构具体见表1。

表1化合物1-11结构

注：Glc为葡萄糖，All为3-O-甲基-6-脱氧-β-阿洛糖，Ole为夹竹桃糖。

化合物1～11的核磁谱数据如下：

化合物1：白色粉末(甲醇)，HR-ESI-MS:m/z 573.2817[M+Na]⁺(calcd.forC₃₃H₄₂O₇Na，573.2828)。¹H-NMR(CD₃OD，500MHz)，δ_H 1.08(3H，s，19-Me)，1.19(3H，s，18-Me)，1.48(3H，s，5′-Me)，1.50(3H，d，J＝7.0Hz，4′-Me)，2.22(3H，s，21-Me)，3.53(1H，m，3-Me)，5.57(1H，t，J＝10.0Hz，H-11)，5.27(1H，d，J＝10.0Hz，H-12)，6.60(1H，q，J＝7.0Hz，H-3′)，7.42(2H，t，J＝7.5Hz，H-4″，H-6″)，7.57(1H，dt，J＝7.5，1.5Hz，H-5″)，7.84(2H，dd，J＝8.5，1.5Hz，H-3″，H-7″)。¹³C-NMR(CD₃OD，125MHz)，δ_C 38.9(C-1)，31.9(C-2)，71.0(C-3)，39.1(C-4)，45.3(C-5)，27.9(C-6)，26.0(C-7)，68.4(C-8)，52.8(C-9)，40.1(C-10)，70.2(C-11)，76.6(C-12)，47.3(C-13)，73.1(C-14)，32.9(C-15)，27.7(C-16)，61.1(C-17)，17.1(C-18)，13.2(C-19)，213.3(C-20)，30.4(C-21)，168.9(C-1′)，129.7(C-2′)，139.8(C-3′)，14.2(C-4′)，11.7(C-5′)，167.5(C-1″)，129.7(C-2″)，130.7(C-3″，C-7″)，129.5(C-4″，C-6″)，134.5(C-5″)。

化合物2：白色粉末(甲醇)。¹H-NMR(CD₃OD，500MHz)，δ_H 1.05(3H， s，19-Me)，1.11(3H，s，18-Me)，2.17(3H，s，21-Me)，3.52(1H，m，3-Me)，5.45(1H，t，J＝10.0Hz，H-11)，5.07(1H，d，J＝10.5Hz，H-12)，6.69，6.72(each 1H，dq，J＝6.5，1.0Hz，H-3′，3″)。¹³C-NMR(CD₃OD，125MHz)，δ_C 38.8(C-1)，31.9(C-2)，71.0(C-3)，39.1(C-4)，45.3(C-5)，27.9(C-6)，32.9(C-7)，68.3(C-8)，52.8(C-9)，40.1(C-10)，70.2(C-11)，75.8(C-12)，47.3(C-13)，73.1(C-14)，27.8(C-15)，26.0(C-16)，61.1(C-17)，17.1(C-18)，13.2(C-19)，213.2(C-20)，30.5(C-21)，129.1(C-2′)，129.9(C-2″)，139.5(C-3′)，139.9(C-3″)，168.8(C-1′)，168.9(C-1″)。

化合物3：白色粉末(甲醇)。¹H-NMR(CD₃OD，500MHz)，δ_H 1.04(3H，s，19-Me)，1.10(3H，s，18-Me)，1.77(3H，d，J＝5.5Hz，4′-Me)，1.78(3H，s，5′-Me)，1.83(3H，s，2″-Me)，2.15(3H，s，21-Me)，3.51(1H，m，3-Me)，5.37(1H，t，J＝10.0Hz，H-11)，5.02(1H，d，J＝10.5Hz，H-12)，6.78(1H，q，J＝5.5Hz，H-3′)。¹³C-NMR(CD₃OD，125MHz)，δ_C 38.7(C-1)，31.9(C-2)，70.9(C-3)，39.0(C-4)，45.2(C-5)，27.8(C-6)，32.9(C-7)，68.1(C-8)，52.7(C-9)，40.0(C-10)，70.1(C-11)，75.9(C-12)，47.0(C-13)，72.9(C-14)，27.7(C-15)，25.9(C-16)，60.8(C-17)，17.0(C-18)，13.2(C-19)，212.9(C-20)，30.4(C-21)，129.8(C-2′)，139.7(C-3′)，168.6(C-1′)，172.1(C-1″)。

化合物4：白色粉末(甲醇)。¹H-NMR(CD₃OD，500MHz)，δ_H 1.10(3H，s，19-Me)，1.14(3H，s，18-Me)，1.58(3H，s，2″-Me)，2.16(3H，s，21-Me)，3.50(1H，m，3-Me)，5.57(1H，t，J＝10.0Hz，H-11)，5.14(1H，d，J＝10.0Hz，12-H)，7.47(2H，t，J＝8.0Hz，H-4′，H-6′)，7.61(1H，dt，J＝8.0，1.5Hz，H-5′)，7.94(2H，dd，J＝8.0，1.0Hz，H-3′，H-7′)。¹³C-NMR(CD₃OD，125MHz)，δ_C 39.0(C-1)，31.8(C-2)，70.9(C-3)，38.9(C-4)，45.3(C-5)，27.8(C-6)，32.9(C-7)，68.3(C-8)，52.9(C-9)，40.1(C-10)，70.9(C-11)，76.0(C-12)，47.1(C-13)，73.1(C-14)，27.7(C-15)，26.0(C-16)，60.9(C-17)，16.9(C-18)，13.3(C-19)，213.1(C-20)，30.3(C-21)，129.8(C-4′，C-6′)，130.6(C-3′，C-7′)，131.4(C-2′)，134.6(C-5′)，167.4(C-1′)，172.2(C-1″)。

化合物5：白色粉末(甲醇)。¹H-NMR(CD₃OD，500MHz)，δ_H 0.91(3H，t，J＝6.5Hz，H-4′)，1.03(3H，s，19-Me)，1.06(3H，d，J＝7.5Hz，H-5′)，1.07(3H， s，18-Me)，1.96(3H，s，2″-Me)，2.16(3H，s，21-Me)，3.50(1H，m，3-Me)，5.33(1H，t，J＝10.0Hz，H-11)，5.00(1H，d，J＝10.5Hz，12-H)。¹³C-NMR(CD₃OD，125MHz)，δ_C 39.1(C-1)，31.7(C-2)，70.9(C-3)，39.2(C-4)，45.3(C-5)，27.8(C-6)，32.9(C-7)，68.3(C-8)，52.7(C-9)，40.2(C-10)，70.0(C-11)，76.0(C-12)，47.1(C-13)，73.0(C-14)，27.6(C-15)，25.9(C-16)，61.3(C-17)，17.0(C-18)，13.3(C-19)，212.9(C-20)，29.9(C-21)，172.3(C-1″)，177.3(C-1′)。

化合物6：白色粉末(甲醇)。¹H-NMR(CD₃OD，500MHz)，δ_H 0.82(3H，t，J＝7.5Hz，H-4′)，1.04(3H，s，19-Me)，0.99(3H，d，J＝7.5Hz，H-5′)，1.05(3H，s，18-Me)，1.76(3H，d，J＝7.0Hz，4″-Me)，1.78(3H，s，5′-Me)，2.18(3H，s，21-Me)，3.53(1H，m，3-Me)，5.38(1H，t，J＝10.5Hz，11-H)，5.05(1H，d，J＝10.0Hz，H-12)，6.79(1H，q，J＝7.0Hz，H-3″)。¹³C-NMR(CD₃OD，125MHz)，δ_C 39.1(C-1)，31.7(C-2)，70.9(C-3)，39.2(C-4)，45.3(C-5)，27.8(C-6)，32.9(C-7)，68.3(C-8)，52.7(C-9)，40.2(C-10)，70.2(C-11)，75.8(C-12)，47.3(C-13)，73.0(C-14)，27.7(C-15)，25.9(C-16)，61.3(C-17)，17.2(C-18)，13.3(C-19)，213.0(C-20)，30.1(C-21)，168.7(C-1″)，177.3(C-1′)。

化合物7：白色粉末(甲醇)。¹H-NMR(CD₃OD，500MHz)，δ_H 0.57(3H，t，J＝7.5Hz，H-4′)，1.07(3H，s，19-Me)，0.87(3H，d，J＝7.0Hz，H-5′)，1.16(3H，s，18-Me)，2.17(3H，s，21-Me)，3.55(1H，m，3-Me)，5.52(1H，t，J＝10.0Hz，11-H)，5.24(1H，d，J＝10.0Hz，H-12)，7.47(2H，t，J＝7.5Hz，H-4′，H-6′)，7.61(1H，dt，J＝7.5，1.5Hz，H-5′)，7.93(2H，dd，J＝8.5，1.5Hz，H-3′，H-7′)。¹³C-NMR(CD₃OD，125MHz)，δ_C 39.1(C-1)，31.2(C-2)，70.9(C-3)，39.2(C-4)，45.3(C-5)，27.8(C-6)，32.9(C-7)，68.3(C-8)，52.7(C-9)，40.2(C-10)，70.1(C-11)，76.5(C-12)，47.4(C-13)，73.0(C-14)，27.6(C-15)，25.9(C-16)，61.4(C-17)，17.2(C-18)，13.3(C-19)，213.1(C-20)，30.1(C-21)，129.7(C-4″，C-6″)，130.9(C-3″，C-7″)，130.7(C-2″)，134.7(C-5″)，167.5(C-1″)，177.4(C-1′)。

化合物8：白色粉末(甲醇)，Molisch反应为阳性。¹H-NMR(CD₃OD，500MHz)， δ_H 1.04(3H，s，19-Me)，1.11(3H，s，18-Me)，1.68(6H，br s，5′-Me，5″-Me)，δ_H 1.72，1.73(each 3H，d，J＝7.0Hz，4′-Me，4″-Me)，2.17(3H，s，21-Me)，3.52(1H，m，3-Me)，5.43(1H，t，J＝10.0Hz，H-11)，5.06(1H，d，J＝10.0Hz，H-12)，6.69，6.71(each 1H，dq，J＝7.0，1.0Hz，3′-H，3″-H)，4.64(1H，d，J＝8.0Hz，Ole-H-1)，4.71(1H，d，J＝8.5Hz，Allo-H-1)，4.35(1H，d，J＝8.0Hz，Glc-H-1)，1.30，1.34(each 3H，d，J＝6.5Hz，H-6of sugar moiety)，3.40，3.60(each 3H，s，OCH₃-3of sugar moiety)。¹³C-NMR(CD₃OD，125MHz)，δ_C 37.9(C-1)，30.3(C-2)，78.0(C-3)，35.9(C-4)，45.1(C-5)，27.7(C-6)，25.9(C-7)，68.2(C-8)，52.8(C-9)，40.1(C-10)，70.2(C-11)，75.5(C-12)，47.3(C-13)，71.9(C-14)，32.9(C-15)，27.9(C-16)，61.0(C-17)，17.1(C-18)，13.2(C-19)，213.2(C-20)，30.4(C-21)，129.1(C-2′)，129.8(C-2″)，139.5(C-3′)，139.6(C-3″)，168.7(C-1′)，168.8(C-1″)，98.7(Ole-C-1)，102.1(Allo-C-1)，106.2(Glc-C-1)，57.5，62.0(OCH₃-3of sugar moiety)。

化合物9：白色粉末(甲醇)，Molisch反应为阳性。¹H-NMR(CD₃OD，500MHz)，δ_H 0.82(3H，t，J＝7.5Hz，4′-Me)，0.99(3H，d，J＝7.0Hz，5′-Me)，1.03(3H，s，19-Me)，1.10(3H，s，18-Me)，1.77(3H，s，5″-Me)，1.80(3H，d，J＝7.0Hz，4″-Me)，2.15(3H，s，21-Me)，5.32(1H，t，J＝10.0Hz，H-11)，5.06(1H，d，J＝10.0Hz，H-12)，6.80(1H，q，J＝7.0Hz，H-3″)，4.65(1H，d，J＝8.0Hz，Ole-H-1)，4.71(1H，d，J＝8.5Hz，Allo-H-1)，4.35(1H，d，J＝8.0Hz，Glc-H-1)，1.30，1.35(each 3H，d，J＝6.5Hz，H-6of sugar moiety)，3.41，3.59(each 3H，s，OCH₃-3ofsugar moiety)。¹³C-NMR(CD₃OD，125MHz)，δ_C 37.9(C-1)，30.1(C-2)，77.8(C-3)，35.9(C-4)，45.1(C-5)，27.6(C-6)，25.9(C-7)，68.3(C-8)，52.6(C-9)，40.2(C-10)，70.1(C-11)，75.5(C-12)，47.3(C-13)，72.0(C-14)，32.9(C-15)，27.9(C-16)，61.3(C-17)，17.2(C-18)，13.3(C-19)，213.0(C-20)，30.1(C-21)，177.3(C-1′)，168.7(C-1″)，129.3(C-2″)，140.0(C-3″)，98.7(Ole-C-1)，102.1(Allo-C-1)，106.3(Glc-C-1)，57.4，63.1(OCH₃-3of sugarmoiety)。

化合物10：白色粉末(甲醇)，Molisch反应为阳性。¹H-NMR(CD₃OD，500MHz)，δ_H 1.04(3H，s，19-Me)，1.08(3H，s，18-Me)，1.77(3H，s，5′-Me)，1.80(3H， d，J＝7.0Hz，4′-Me)，1.83(3H，s，2″-Me)，2.18(3H，s，21-Me)，5.38(1H，t，J＝10.0Hz，H-11)，5.05(1H，d，J＝10.0Hz，H-12)，6.80(1H，q，J＝7.0Hz，H-3′)，4.64(1H，dd，J＝8.0，2.0Hz，Ole-H-1)，4.72(1H，d，J＝8.5Hz，Allo-H-1)，1.23，1.35(each 3H，d，J＝6.0，6.5Hz，H-6of sugarmoiety)，3.40，3.60(each 3H，s，OCH₃-3of sugar moiety)。¹³C-NMR(CD₃OD，125MHz)，δ_C37.9(C-1)，30.3(C-2)，78.0(C-3)，36.0(C-4)，45.2(C-5)，27.8(C-6)，26.0(C-7)，68.3(C-8)，52.8(C-9)，40.2(C-10)，70.2(C-11)，76.0(C-12)，47.1(C-13)，72.6(C-14)，32.9(C-15)，27.9(C-16)，61.0(C-17)，17.0(C-18)，13.2(C-19)，213.2(C-20)，30.4(C-21)，168.8(C-1′)，129.9(C-2′)，139.9(C-3′)，172.3(C-1″)，98.8(Ole-C-1)，102.2(Allo-C-1)，57.4，62.5(OCH₃-3of sugar moiety)。

化合物11：白色粉末(甲醇)，Molisch反应为阳性。¹H-NMR(CD₃OD，500MHz)，δ_H 0.81(3H，t，J＝7.5Hz，4′-Me)，0.99(3H，d，J＝7.0Hz，5′-Me)，1.04(3H，s，19-Me)，1.08(3H，s，18-Me)，1.76(3H，s，5″-Me)，1.77(3H，d，J＝7.0Hz，4″-Me)，2.18(3H，s，21-Me)，5.38(1H，t，J＝10.0Hz，H-11)，5.05(1H，d，J＝10.0Hz，H-12)，6.80(1H，q，J＝7.0Hz，H-3″)，4.65(1H，d，J＝7.0Hz，Ole-H-1)，4.72(1H，d，J＝8.0Hz，Allo-H-1)，1.23，1.35(each 3H，d，J＝6.0Hz，H-6of sugar moiety)，3.40，3.60(each 3H，s，OCH₃-3of sugar moiety)。 ¹³C-NMR(CD₃OD，125MHz)，δ_C 39.2(C-1)，30.1(C-2)，77.8(C-3)，35.9(C-4)，45.1(C-5)，27.9(C-6)，32.9(C-7)，68.2(C-8)，52.6(C-9)，40.2(C-10)，70.1(C-11)，75.7(C-12)，47.3(C-13)，72.5(C-14)，27.6(C-15)，25.9(C-16)，61.3(C-17)，17.2(C-18)，13.3(C-19)，212.9(C-20)，30.1(C-21)，177.2(C-1′)，168.6(C-1″)，129.3(C-2″)，139.9(C-3″)，98.7(Ole-C-1)，102.1(Allo-C-1)，57.4，62.5(OCH₃-3of sugar moiety)。

具有结构通式所示的化合物及其修饰得到的衍生物，具有很好的防治骨质疏松作用，可以和药学上可接受的载体结合制备临床上可接受的药物，用于治疗骨质疏松。

本发明的另一目的在于提供了所述化合物的制备方法。包括以下操作步骤，采用萝藦科牛奶菜属植物通关藤为原料，用有机溶剂或含水醇、盐溶液制备提取物，再进行对化合物的分离。

方法一：

(1)取选定的药材粗粉(牛奶菜属等中药饮片或植物)，利用超声或溶剂加热提取法，采用3～15倍量水煎煮或30％～100％乙醇或甲醇回流提取，减压回收水或醇溶剂，残渣挥至无醇味或醇度低于10％后，以水溶解后离心取上清液。

(2)上清液用大孔树脂处理，用水-醇溶液梯度洗脱，富集30％～80％醇洗脱部分，得到C₂₁甾体粗提物。

(3)上述粗提取物经硅胶柱色谱进行分离，采用石油醚、乙酸乙酯、二氯甲烷、三氯甲烷、丙酮、甲醇等组成的不同溶剂系统进行梯度洗脱，结合中低压制备分离色谱、高效液相色谱进行制备分离，以乙腈/水系统、甲醇/水系统进行分离，获得C₂₁甾体类化合物。

方法二：

(1)取选定的药材粗粉(牛奶菜属等中药饮片或植物)，利用超声或溶剂加热提取法，采用3～15倍量水煎煮或30％～100％乙醇或甲醇回流提取，减压回收水或醇溶剂，残渣挥至无醇味或醇度低于10％后，以水溶解，得混悬液。

(2)混悬液依此用乙酸乙酯、正丁醇进行萃取，萃取次数1-5次，萃取体积(1:1-1:8)获得各萃取部位，分别回收溶剂得浸膏，其中乙酸乙酯层浸膏为C₂₁甾体苷元组分；正丁醇层为总C₂₁甾体苷类。

(3)粗C₂₁甾体苷元或粗C₂₁甾体苷都可经硅胶柱色谱进行分离，采用石油醚、乙酸乙酯、二氯甲烷、三氯甲烷、丙酮、甲醇等组成的不同溶剂系统进行梯度洗脱，结合中低压制备分离色谱、高效液相色谱进行制备分离，以乙腈/水系统、甲醇/水系统进行分离，获得C₂₁甾体类化合物。

方法三：

(1)取选定的药材粗粉(牛奶菜属等中药饮片或植物)，利用超声或溶剂加热回流提取法，采用3～10倍量乙酸乙酯或丙酮回流提取，减压回收溶剂得浸膏，为C₂₁甾体粗提物。

(2)粗提物再经硅胶柱色谱进行分离，采用石油醚、乙酸乙酯、二氯甲烷、三氯甲烷、丙酮、甲醇等组成的不同溶剂系统进行梯度洗脱，结合中低压制备分离色谱、高效液相色谱进行制备分离，以乙腈/水系统、甲醇/水系统进行分离，获得C₂₁甾体类化合物。

本发明提供的C₂₁甾体类化合物的制备方法(一)方法(二)中提到的醇为甲醇或乙醇，浓度为10％-100％。

本发明提供的C₂₁甾体类化合物的制备方法(一)中，所提到的大孔树脂包括极性、非极性大孔树脂D-101、DM-301、HPD-100、AB-8等。

本发明提供的粗C₂₁甾类化合物经硅胶柱色谱制备单体成分方法，所提到的有机溶剂为石油醚、二氯甲烷、三氯甲烷、丙酮、乙酸乙酯、乙醇、甲醇中的一种、二种或多种混合溶剂。

本发明提供的粗C₂₁甾类化合物经中低压、高效液相色谱制备单体成分的方法，流动相为甲醇/水、或乙腈/水、或乙醇/水，混合比例为1:10-90:10，或甲醇/乙腈/水，混合比例为1:1:10-40:40:20。

具体实施方式

为了使本发明的目的及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1通关藤活性提取物的制备

取干燥通关藤15kg，用75％乙醇回流提取3次，料液比1:8，每次2h，减压回收溶剂，浓缩至10L。分别用等体积的乙酸乙酯和正丁醇萃取3次，得乙酸乙酯萃取物115g，正丁醇萃取物173g。

其中正丁醇层富含C₂₁甾体类化合物，经含量测定，其C₂₁甾体含量达到82％。

实施例2从通关藤中分离C₂₁甾体类化合物。

取实施例1中所得的乙酸乙酯层浸膏110g，采用硅胶开放柱色谱进行分离，流动相选用石油醚：乙酸乙酯(100:1-2:1)及二氯甲烷：甲醇(100：5-2:1)梯度洗脱，所得流份经过硅胶薄层色谱分析，合并相同流份后得10份洗脱物。

对石油醚：乙酸乙酯＝100:30流分11.0g进行分离，采用硅胶柱色谱法，石油醚：乙酸乙酯梯度洗脱，在100:40处，对黄色固体进行Sephadex LH-20分离，随后采用HPLC分离，重结晶得化合物1-3、5。

对石油醚：乙酸乙酯＝100:40流分8.9g进行分离，采用硅胶柱色谱法，二氯甲烷：甲醇梯度洗脱，在100:10处，对固体部分采用HPLC分离，得化合物4。

对石油醚：乙酸乙酯＝100:20流分9.1g进行分离，采用硅胶柱色谱法，石油醚：乙酸乙酯梯度洗脱，在100:50处，对固体进行Sephadex LH-20分离，随后采用HPLC分离，得化合物6、7。

对二氯甲烷：甲醇＝100:5流分17.5g进行分离，采用ODS开放柱色谱，甲醇：水(1:9-9:1)梯度洗脱，在9:1处，对固体采用HPLC分离，得化合物8-11。

对11个C₂₁甾体类化合物体外MC3T3-E1成骨细胞株增殖活性测定。

实施例3通过MTT检测11个化合物对MC3T3-E1成骨细胞株增殖活性测定。

实验操作

(1)细胞培养

MC3T3-E1细胞株，将其培养在含10％的胎牛血清、100μg·mL^-1青霉素、100μg·mL^-1链霉素的DMEM培养基中，细胞培养的环境为37℃、5％CO₂的恒温培养箱，令其孵育生长，用0.25％胰蛋白酶消化，隔天传代。

(2)样品的制备

取通关藤乙醇提取物的乙酸乙酯萃取物及分离得到的单体化合物，分别称取适量样品溶于DMSO溶液中配制成浓度为100μmol·L^-1的溶液，保存于4℃冰箱中备用。

(3)实验流程与分组

取生长状态良好的MC3T3-El细胞，消化后，用含10％胎牛血清的DMEM培养基稀释配成活细胞浓度为5×10⁴个·mL^-1，接种于96孔细胞培养板中，每孔100μL，培养24h，待细胞完全贴壁后，加入含不同测试样品的药液50μL(药液浓度100μmol·L^-1)，每个样品6个重复，同时设阴性对照组只加等体积的培养液。置于恒温CO₂孵箱中在37℃、5％CO₂条件下继续培养48h，在细胞培养终止之前每孔加MTT(5mg·mL^-1)10μL，在培养箱中相同条件下继续孵育4h后吸出孔内培养液，将板晾干，每孔加入150μLDMSO。

(4)细胞增殖的测定

采用酶标仪，于490nm处测定待测的96孔板上各孔光密度值(OD)。

(5)数据处理

采用统计软件SPSS19.0处理数据，结果均采用均数±标准差表示，组间差异比较采用T检验分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

结果见表3。

表3化合物1-11促进成骨细胞增殖实验数据表

^*P<0.05，^**P<0.01vs control。

Claims

1.一类C₂₁甾类化合物，具有式1所示结构：

2.如权利要求1所述的化合物的制备方法，其特征在于：

方法一：

(1)取选定的牛奶菜属中药饮片或植物药材粗粉，利用超声或溶剂加热提取法，采用3～15倍量水煎煮或30％～100％乙醇或甲醇回流提取，减压回收水或醇溶剂，残渣挥至无醇味或醇度低于10％后，以水溶解后离心取上清液；

(2)上清液用大孔树脂处理，用水-醇溶液梯度洗脱，富集30％～80％醇洗脱部分，得到C₂₁甾体粗提物；所述的大孔树脂选自极性、非极性大孔树脂D-101、DM-301、HPD-100、AB-8；

(3)上述粗提取物经硅胶柱色谱进行分离，采用石油醚、乙酸乙酯、二氯甲烷、三氯甲烷、丙酮、甲醇组成的不同溶剂系统进行梯度洗脱，结合中低压制备分离色谱、高效液相色谱进行制备分离，以乙腈/水系统、甲醇/水系统进行分离，获得C₂₁甾体类化合物；

方法二：

(1)取选定的牛奶菜属中药饮片或植物药材粗粉，利用超声或溶剂加热回流提取法，采用3～10倍量乙酸乙酯或丙酮回流提取，减压回收溶剂得浸膏，为C₂₁甾体粗提物；

(2)粗提物再经硅胶柱色谱进行分离，采用石油醚、乙酸乙酯、二氯甲烷、三氯甲烷、丙酮、甲醇组成的不同溶剂系统进行梯度洗脱，结合中低压制备分离色谱、高效液相色谱进行制备分离，以乙腈/水系统、甲醇/水系统进行分离，获得C₂₁甾体类化合物。

3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述的粗C₂₁甾类化合物经中低压、高效液相色谱制备单体成分的方法，流动相为甲醇/水或乙腈/水，混合比例为1:10-90:10。

4.一种药物组合物，其特征在于，包含权利要求1所述的C₂₁甾类化合物及其盐和药学上可接受的载体。

5.权利要求1所述的C₂₁甾类化合物及其盐或权利要求4所述的组合物在制备治疗骨质疏松药物中的应用。