CN111440157B - 同时分离夏佛塔苷、维采宁-2和蜕皮激素的方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于植物化学技术领域，公开了一种同时分离夏佛塔苷、维采宁‑2和蜕皮激素的方法及应用，以漆姑草为提取原料，90％的乙醇为提取溶剂，提取液经减压浓缩后依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇进行萃取，对浓缩后的正丁醇萃取部位用AB‑8大孔树脂进行粗分得50％的乙醇洗脱部分，所述洗脱部分经过ODS柱层析分离可得蜕皮激素单体、含杂质的夏佛塔苷和含杂质的维采宁‑2，含杂质的夏佛塔苷和含杂质的维采宁‑2分别进一步经硅胶柱层析分离纯化，即可分别得到夏佛塔苷单体和维采宁‑2单体。本发明分离提纯流程较短，操作简单易于实现，大大节约植物资源及提取分离成本；能够产生较大的经济效益，将带动相关领域产业的发展。

Description

同时分离夏佛塔苷、维采宁-2和蜕皮激素的方法及应用

技术领域

本发明属于植物化学技术领域，尤其涉及一种同时分离夏佛塔苷、维采宁-2和蜕皮激素的方法及应用。

背景技术

目前，夏佛塔苷是从广金钱草提取的一种黄酮类成分，并作为广金钱草质量检测的指标性成分，夏佛塔苷具有利胆、抑菌、抗炎的作用。夏佛塔苷在临床上主要用于肝炎、胆囊炎、胆结石、泌尿系统感染等疾病。有研究探讨夏佛塔苷对高脂饮食诱导的小鼠非酒精性脂肪肝(NAFLD)的保护作用。蜕皮激素作用于人体有促进胶元蛋白合成、排除体内的胆固醇，降血脂，抑制血糖上升、抗心律不齐、通经活络、除湿镇痛等生理活性，是天然的抗癌制剂，民间常用于风湿性关节炎等症的治疗。其次蜕皮激素在在蚕业、养殖业、化妆品及农业当中应用也非常广泛，如在在蚕业上，用于促使桑蚕龄期缩短，促进吐丝结茧；蜕皮激素加入化妆品中，可防止皮肤干燥，使皮肤更加细嫩，目前蜕皮激素在市场上需求量大，应用前景广泛。维采宁-2又称为新西兰牡荆苷2，目前国内对其药理活性的研究报道非常少，国外则比较关注，已报道其具有多种药理活性。包括对多种炎症细胞和动物模型发挥有效的抗炎作用，特别是对血管性炎症有很好的治疗效果；抗血栓和抗血小板活性；治疗糖尿病；解痉作用；联合多烯紫杉醇发挥抗前列腺癌的作用及诱导肝癌HepG2细胞的凋亡、抗氧化等作用。

目前这三种化合物的标准品价格较为昂贵(规格为20mg/支的夏佛塔苷和蜕皮激素的标准品价格大约在800元左右，10mg的维采宁-2价格大约在2000元左右)，相关的提取分离专利报道较少，且都是针对性的、单纯的从某植物资源中获得某单一成分，如：从广金钱草及忧遁草(从广金钱草分离夏佛塔苷的专利201210114776.7、201510347295.4、201510347295.4；从忧遁草分离夏佛塔苷的专利201910261971.4、【反相高效液相色谱法测定不同产地忧遁草中夏佛塔苷的含量，刘梦；林强；北京联合大学】、【基于忧遁草化学成分研究分析其抗肿瘤作用，王贤儿1＊，钟希文2#，张文霞2，汪亚飞1(1.广州中医药大学，广州510006；2.广州中医药大学附属中山中医院，广东中山528400)】)。

众所周知，植物资源中的化学成分成百上千种，有效成分或指标性成分对于某些植物资源来说并非只限于一种，对于这种含多种有效成分的植物资源或中草药，若只从其中提纯分离某单一成分，有可能对植物资源造成浪费，不能最大程度的有效利用该植物资源。

若能找到一种植物资源或中草药并从这种植物资源或中草药中同时获得这三种有效成分，则不仅扩大了该三种成分的植物来源范围，而且可以大大节约资源及提取分离成本，并且所分离得到的这三种有效成分由于其价格较昂贵将会产生不小的经济效益，并带动相关领域产业的发展。

通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：目前尚未见从漆姑草中综合进行这三种成分提取分离的专利报道，因此，亟需一种能够实现从漆姑草中同时提取分离夏佛塔苷、维采宁-2和蜕皮激素三种物质的方法，

解决以上问题及缺陷的难度为：如何实现通过简单的提取分离操作同时获得这三种成分。

解决以上问题及缺陷的意义为：能够应用于相关的领域产业，如制药、农业、化妆品等行业，则不仅可以节约资源及分离成本、且由于该三种成分药用价值高、价格较贵，能够产生较大的经济效益，并带动漆姑草种植业的发展，为人们增收创造效益开创一个新的思路和渠道。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种同时分离夏佛塔苷、维采宁-2和蜕皮激素的方法及应用。

本发明是这样实现的，一种同时分离夏佛塔苷、维采宁-2和蜕皮激素的方法，所述同时分离夏佛塔苷、维采宁-2和蜕皮激素的方法以漆姑草为提取原料，90％±5％乙醇为提取溶剂，提取液经减压浓缩后依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇分别进行萃取，对浓缩后的正丁醇萃取部位用AB-8大孔树脂进行粗分得50％乙醇洗脱部分；50％乙醇洗脱部分经ODS柱层析分离得到蜕皮激素单体、含杂质的夏佛塔苷和含杂质的维采宁-2，含杂质的夏佛塔苷和含杂质的维采宁-2分别再进一步经硅胶柱层析分离纯化，分别得到夏佛塔苷单体和维采宁-2单体。

进一步，提取原料是干燥后粉碎的漆姑草，提取溶剂为90％的乙醇。

进一步，浓缩液分别用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇依次萃取后所得的正丁醇萃取部位。

进一步，将经过AB-8大孔树脂简单粗分所得的50％乙醇洗脱部分经过ODS柱层析分离，甲醇：水＝1：1.5进行洗脱，得蜕皮激素单体，含杂质的夏佛塔苷和含杂质的维采宁-2。

进一步，含杂质的夏佛塔苷和含杂质的维采宁-2进一步经过硅胶柱层析分离纯化可分别得到夏佛塔苷单体和维采宁-2单体，硅胶柱层析的洗脱系统为乙酸乙酯-甲醇-水，其洗脱比例为：乙酸乙酯：甲醇：水≈8：1：1。

进一步，所述同时分离夏佛塔苷、维采宁-2和蜕皮激素的方法包括：

步骤一，将室温下干燥后粉碎的漆姑草用90％的乙醇采用浸渍法提取3次；

步骤二，合并3次提取液，减压浓缩提取液至无醇味；

步骤三，浓缩液依次用石油醚60-90℃、乙酸乙酯和正丁醇分别对其进行萃取3～5次，收集正丁醇萃取液，并减压浓缩得浸膏；

步骤四，将得到的浸膏上AB-8大孔树脂，采用纯水、30％、50％的乙醇溶液对其依次进行洗脱，收集50％的乙醇洗脱部分并减压浓缩；

步骤五中，将减压浓缩后的50％乙醇洗脱部分采用色谱分离法进行分离纯化，分别得到蜕皮激素、夏佛塔苷和维采宁-2的单体。

本发明的另一目的在于提供一种由所述同时分离夏佛塔苷、维采宁-2和蜕皮激素的方法分离得到的夏佛塔苷、维采宁-2和蜕皮激素。

本发明的另一目的在于提供一种利胆、抑菌、抗炎的药物，所述利胆、抑菌、抗炎的药物包含夏佛塔苷。

本发明的另一目的在于提供一种抗癌制剂，所述抗癌制剂包含蜕皮激素。

本发明的另一目的在于提供一种治疗血管性炎症的药物，所述治疗血管性炎症的药物包含的维采宁-2。

结合上述的所有技术方案，本发明所具备的优点及积极效果为：本发明为进一步开发利用漆姑草资源提供一个新的思路，并为三种目标成分(夏佛塔苷、维采宁-2和蜕皮激素)提供一个新的获得途径。本发明所提供的从漆姑草中分离夏佛塔苷、维采宁-2和蜕皮激素的方法，与现有技术中报道的同类型方法相比，一方面完成了从同一种植物资源或中草药中同时提取分离多种有效成分的目的，与提取分离单一物质相比，产生的经济效益较大，避免了植物资源在很大程度上的浪费；另一方面扩大了这三种化合物的植物来源途径，具有继续进行工艺分析并应用于工业化生产的可能性，并在医药、化妆品、农业等相关领域产业方面具有广阔的应用前景。

附图说明

为了更清楚地说明本申请实施例的技术方案，下面将对本申请实施例中所需要使用的附图做简单的介绍，显而易见地，下面所描述的附图仅仅是本申请的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是本发明实施例提供的同时分离夏佛塔苷、维采宁-2和蜕皮激素的方法流程图。

图2是本发明实施例提供的同时分离夏佛塔苷、维采宁-2和蜕皮激素的方法实现流程图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种同时分离夏佛塔苷、维采宁-2和蜕皮激素的方法，下面结合附图对本发明作详细的描述。

如图1所示，本发明提供的同时分离夏佛塔苷、维采宁-2和蜕皮激素的方法包括以下步骤：

S101：以漆姑草为提取原料，90％的乙醇为提取溶剂，提取液经减压浓缩后依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇进行萃取；

S102：对浓缩后的正丁醇萃取部位用AB-8大孔树脂进行粗分得50％的乙醇洗脱部分；

S103：50％乙醇洗脱部分经ODS柱层析分离得蜕皮激素单体、含杂质的夏佛塔苷和含杂质的维采宁-2，含杂质的夏佛塔苷和含杂质的维采宁-2分别再经硅胶柱层析分离纯化，即可分别得到夏佛塔苷单体和维采宁-2单体。

本发明提取原料是干燥后粉碎的漆姑草，提取溶剂为90％的乙醇，但不仅仅局限于这个浓度，可以在这个浓度附近波动约5％的浓度，提取液合并、减压浓缩至无醇味。

本发明的粗分方法其特征在于：浓缩液分别用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇依次萃取后所得的正丁醇萃取部位，其经过AB-8大孔树脂简单分离所得的50％的乙醇洗脱部分主要集中了我们所需分离的三种成分(夏佛塔苷、维采宁-2和蜕皮激素)。

本发明将经过AB-8大孔树脂简单粗分所得的50％乙醇洗脱部分经过ODS柱层析分离，甲醇：水＝1：1.5进行洗脱(但不仅限于此，可在此基础上根据TLC具体情况进行调节)，得蜕皮激素单体，含杂质的夏佛塔苷和含杂质的维采宁-2。

本发明含杂质的夏佛塔苷和含杂质的维采宁-2进一步经过硅胶柱层析分离纯化可分别得到夏佛塔苷单体和维采宁-2单体，硅胶柱层析的洗脱系统为乙酸乙酯-甲醇-水，其洗脱比例为：乙酸乙酯：甲醇：水≈8：1：1，可在此基础上根据TLC具体情况进行调节。

下面结合附图对本发明的技术方案作进一步的描述。

如图2所示，本发明提供的同时分离夏佛塔苷、维采宁-2和蜕皮激素的方法包括以下步骤：

步骤一，将室温下干燥后粉碎的漆姑草用90％的乙醇采用浸渍法提取3次；

步骤二，合并3次提取液，减压浓缩提取液至无醇味；

步骤三，浓缩液依次用石油醚(60-90℃)、乙酸乙酯和正丁醇分别对其进行萃取3～5次，收集正丁醇萃取液，并减压浓缩得浸膏；

步骤四，将得到的浸膏上AB-8大孔树脂，采用纯水、30％、50％的乙醇溶液对其依次进行洗脱，收集50％的乙醇洗脱部分并减压浓缩；

步骤五中，将减压浓缩后的50％乙醇洗脱部分采用色谱分离法进行分离纯化，分别得到蜕皮激素、夏佛塔苷和维采宁-2的单体。

进一步，步骤四中，所述50％的乙醇洗脱部分主要集中了我们所需要分离的目标成分(夏佛塔苷、维采宁-2和蜕皮激素)，其余还有少量杂质；

进一步，步骤五中，所述采用色谱分离法进行夏佛塔苷、维采宁-2和蜕皮激素分离包括：

将减压浓缩后的50％乙醇洗脱部分首先经过ODS柱层析分离，以甲醇：水＝1:1.5为洗脱溶剂进行洗脱可分离得到蜕皮激素单体、含杂质的夏佛塔苷和含杂质的维采宁-2，含杂质的夏佛塔苷和含杂质的维采宁-2进一步经硅胶柱层析分离纯化可得夏佛塔苷单体和维采宁-2单体。

进一步，所述硅胶柱层析的溶剂洗脱系统为乙酸乙酯-甲醇-水，洗脱比例为：乙酸乙酯:甲醇:水≈8:1:1，可在此基础上根据TLC具体情况进行调节。

下面结合具体实施例对本发明的技术方案作进一步的描述。

本发明提供的同时分离夏佛塔苷、维采宁-2和蜕皮激素的方法包括取干燥后粉碎的漆姑草约5kg，用90％(V/V)的乙醇采用浸渍法提取三次，每天一次，收集并合并提取液、减压浓缩至无醇味、稍粘稠状为止，浓缩液加少量水分散后依次用石油醚(60-90℃)、乙酸乙酯和正丁醇分别萃取5～6次，收集并合并正丁醇部位萃取液、减压浓缩得浸膏约270g。

所述正丁醇萃取部位浸膏分2次上AB-8大孔树脂，样品和AB-8大孔树脂的比例约为1：5(左右可以浮动)，样品用热水溶解后上AB-8大孔树脂树脂柱，采用纯水、30％、50％、70％的乙醇溶液依次进行洗脱，经TLC检测发现所需分离的目标成分(夏佛塔苷、维采宁-2和蜕皮激素)主要集中于50％的乙醇洗脱部分，收集50％的乙醇洗脱部分并减压浓缩得浸膏。

上述所得50％乙醇洗脱部分的浸膏用洗脱剂溶解后湿法上ODS反相层析柱，样品和ODS填料的比例约为1：80(左右可以浮动)，以甲醇：水＝1：1.5为洗脱溶剂进行洗脱(洗脱剂的比例可在此基础上根据TLC具体情况进行调节)，TLC检测并合并相同组分直至目标成分全部流出，得化合物A(蜕皮激素)、含杂质的化合物B(维采宁-2)和含杂质的化合物C(夏佛塔苷)。

含杂质的化合物B(维采宁-2)和含杂质的化合物C(夏佛塔苷)分别进一步上硅胶柱分离纯化，以乙酸乙酯-甲醇-水为洗脱系统，其比例为乙酸乙酯：甲醇：水≈8：1：1(可在此基础上根据TLC具体情况进行调节)，TLC检测并合并相同组分直至目标成分全部流出，得化合物B(维采宁-2)和化合物C(夏佛塔苷)。

所得化合物A、B和C经过核磁测试并解谱分析，验证所分离得到的化合物分别为蜕皮激素、维采宁-2和夏佛塔苷。其核磁数据如下：

化合物A：白色粉末。1H-NMR(600MHz，CD3OD)δ：2.40～1.32(16H，m，H-1，4，11，12，15，16，23，24)，3.84(1H，m，H-2)，3.97(1H，m，H-3)，2.41(2H，m，H-5，17)，5.83(1H，d，J＝2.3Hz，H-7)，3.17(1H，m，H-9)，0.91(3H，s，H-18)，0.98(3H，s，H-19)，1.22(9H，m，H-21，26，27)，3.35(1H，m，H-22)；13C-NMR(150MHz，CD3OD)δ：35.9(C-1)，67.1(C-2)，67.3(C-3)，31.5(C-4)，50.4(C-5)，205.1(C-6)，120.7(C-7)，166.6(C-8)，33.7(C-9)，37.9(C-10)，20.1(C-11，16)，30.4(C-12)，47.2(C-13)，83.8(C-14)，31.1(C-15)，49.1(C-17)，16.7(C-18)，23.0(C-19)，76.5(C-20)，19.6(C-21)，77.0(C-22)，25.9(C-23)，41.0(C-24)，69.9(C-25)，27.5(C-26)，28.3(C-27)。以上数据与蜕皮激素基本一致，故鉴定该化合物A为蜕皮激素。

化合物B：淡黄色粉末。1H-NMR(600MHz，DMSO-d6)δ13.72(1H，s，5-OH)，6.79(1H，s，3-H)，8.02(2H，d，J＝8.4Hz，H-2'andH-6')，6.91(2H，d，J＝8.7Hz，H-3'andH-5')，4.79(1H，brs，H-1”)，4.61(1H，brs，H-1”')，3.24-3.87(glc-H)，5.01-5.03(glc-OH)；13C-NMR(150MHz，DMSO-d6)δ：164.3(C-2)，102.9(C-3)，182.7(C-4)，159.2(C-5)，108.1(C-6)，161.7(C-7，C-4')，105.7(C-8)，155.6(C-9)，103.0(C-10)，122.0(C-1')，129.4(C-2')，116.3(C-3'，C-5')，161.7(C-4')，130.1(C-6')，74.6(C-1″)，72.3(C-2″)，78.4(C-3″)，71.1(C-4″)，81.3(C-5″)，60.3(C-6″)，73.9(C-1″′)，71.5(C-2″′)，79.3(C-3″′)，69.6(C-4″′)，82.3(C-5″′)，61.8(C-6″′)；以上数据与维采宁-2基本一致，故鉴定化合物B为维采宁-2。

化合物C：淡黄色粉末。1H-NMR(600MHz，DMSO-d6)δ：6.79(1H，s，H-3)，8.08(2H，d，J＝8.7Hz，H-2′，H-6′)，6.91(2H，d，J＝8.7Hz，H-3′，H-5′)，4.78(1H，d，J＝9.4Hz，H-1″ofglc)，4.71(1H，d，J＝9.8Hz，H-1″′ofara)，13.82(1H，s，5-OH)，3.24～3.87(m，H-2″，H-3″，H-4″，H-5″，H-6″ofGlcandH-2″′，H-3″′，H-4″′，H-5″′ofara)；13C-NMR(150MHz，DMSO-d6)δ164.3(C-2)，102.7(C-3)，182.6(C-4)，161.6(C-5，C-7，C-9)，108.6(C-6)，105.6(C-8)，103.1(C-10)，121.7(C-1′)，129.6(C-2′)，116.5(C-3′，C-5′)，161.6(C-4′)，129.4(C-6′)，73.9(C-1″)，71.5(C-2″)，79.4(C-3″)，70.6(C-4″)，82.3(C-5″)，61.7(C-6″)，74.4(C-1″′)，69.9(C-2″′)，75.5(C-3″′)，69.3(C-4″′)，71.2(C-5″′)。以上数据与夏佛塔苷基本一致，故鉴定该化合物C为夏佛塔苷。

在本发明的描述中，除非另有说明，“多个”的含义是两个或两个以上；术语“上”、“下”、“左”、“右”、“内”、“外”、“前端”、“后端”、“头部”、“尾部”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。此外，术语“第一”、“第二”、“第三”等仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性。

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (1)

1.一种同时分离夏佛塔苷、维采宁-2和蜕皮激素的方法，其特征在于，所述同时分离夏佛塔苷、维采宁-2和蜕皮激素的方法包括：

利用90％的乙醇对干燥后粉碎的漆姑草提取，获得提取液，所述提取液经减压浓缩后，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇进行萃取，对萃取后的正丁醇部位用AB-8大孔树脂进行粗分得50％乙醇洗脱部分；

所述50％乙醇洗脱部分经ODS柱层析分离，甲醇：水＝1：1.5进行洗脱，得到蜕皮激素单体、含杂质的夏佛塔苷和含杂质的维采宁-2；

含杂质的夏佛塔苷和含杂质的维采宁-2分别再进一步经硅胶柱层析分离纯化，分别得到夏佛塔苷单体和维采宁-2单体；硅胶柱层析的洗脱系统为乙酸乙酯-甲醇-水，其洗脱比例为：乙酸乙酯：甲醇：水≈8：1：1。