CN107722087B - 一种绞股蓝黄酮类化合物及其制备与在抗肿瘤药物中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于中药领域，公开了一种绞股蓝黄酮类化合物及其制备与在抗肿瘤药物中的应用。方法：(1)采用乙醇水溶液加热回流提取绞股蓝粗粉，离心，浓缩，得到绞股蓝乙醇浸膏；(2)将浸膏用水溶解，过滤，将滤液采用石油醚萃取，将下层水相采用乙酸乙酯萃取；将乙酸乙酯相进行减压浓缩，烘干，在硅胶柱中用氯仿‑甲醇的混合溶剂等度洗脱，得到若干馏分；(4)将上述馏分过凝胶柱，甲醇洗脱，收集比拟值相等的馏分；(5)将馏分过ODS柱，用甲醇‑水等度洗脱，收集馏分，通过干燥得到绞股蓝黄酮类化合物。本发明的绞股蓝黄酮类化合物抗肿瘤活性高，使用剂量低，在同样剂量下的对正常人肝细胞无毒副作用。

Description

一种绞股蓝黄酮类化合物及其制备与在抗肿瘤药物中的应用
技术领域
本发明属于中药领域，具体涉及一种绞股蓝黄酮类化合物及其制备方法与在抗肿瘤药物中的应用。
背景技术
肿瘤死亡率高居全世界第一或第二位,极大威胁着人类的生存与健康。肿瘤治疗一直是医学界面临的难题,手术、化学疗法和放射性疗法是通常的治疗方法。而大多数现有的治疗方法会有很严重的副作用,如出血,认知障碍,多发等,这主要和其非选择性的细胞毒性相关。对于化学疗法来说,新兴药物的耐药性是另一个严重的问题。寻找毒副作用小、具有选择性杀伤的新型抗癌药物一直是全世界科学工作者主要研究目标之一。天然产品,包括植物、海洋生物和微生物等一直吸引了许多科学家的关注，其中绞股蓝作为药食两用价值中草药，其抗肿瘤活性引起了广泛研究。
绞股蓝(Gynostemma Pentaphylium Makino)是葫芦科绞股蓝属植物的干燥根茎或者全草，又名“五叶参”、“七叶胆”等。它是一种名贵的中草药，在各种重要书籍和民间偏方中常有记载，其全草均可入药，在我国药源丰富，产量颇高，无污染且具有独特的药理作用和生物活性。明代李时珍所著的《本草纲目》一书中记载绞股蓝已具有“治虫咬、凉血解毒、利小便”的功效；及至现代，绞股蓝作为一种常见的中药，其药理活性较强，具有抗肿瘤、降血脂、抗氧化、调节免疫、护肝、抗衰老、镇静等功效。研究发现绞股蓝中含有皂苷类、多糖类、黄酮类、甾醇类、木脂素类、氨基酸、维生素、矿物质等其它化学成分，其生物活性大多以皂苷类和多糖类化合物为主，对其黄酮类化合物研究甚少，实验结果发现绞股蓝中黄酮类物质除具有明显的抗氧化活性，还具有较好的抗肿瘤活性。
目前，绞股蓝活性成分研究多集中于萜类、皂苷、多糖等成分，很少有关于黄酮类成分的研究，而绞股蓝作为药食的天同源天然保健品，其黄酮类物质的提取纯化和药理活性等方面的研究具有重要价值，可待进一步深入探讨和全面加强绞股蓝的生物利用，对于开发新药、指导临床用药具有重要的意义。
发明内容
为了克服现有技术的不足和缺点，本发明的首要目的在于提供一种绞股蓝黄酮类化合物的制备方法。
本发明的另一目的在于提供由上述制备方法得到的黄酮类化合物。所述黄酮类化合物为山奈酚-3-O-[2'-反式-香豆酰基-3'-O-β-D-葡萄糖基-3'-O-β-D-葡萄糖芸香苷。
本发明的再一目的在于提供上述绞股蓝黄酮类化合物的应用。所述黄酮类化合物山奈酚-3-O-[2'-反式-香豆酰基-3'-O-β-D-葡萄糖基-3'-O-β-D-葡萄糖芸香苷在制备抗肿瘤药物中的应用。
本发明的目的通过下述方案实现：
一种绞股蓝黄酮类化合物的制备方法，包含如下步骤：
(1)将绞股蓝全草干燥、粉碎、过筛，得到绞股蓝粗粉；采用乙醇水溶液加热回流提取绞股蓝粗粉；将提取液离心，并将上清液浓缩，得到浓缩的绞股蓝乙醇浸膏；
(2)将绞股蓝乙醇浸膏用水溶解，过滤，将滤液采用石油醚萃取，得到上层石油醚相和下层水相A；将下层水相A采用乙酸乙酯萃取，得到乙酸乙酯相和下层水相B；将乙酸乙酯相进行减压浓缩，得到乙酸乙酯浸膏；
(3)将乙酸乙酯浸膏烘干，然后与硅胶拌样，再与硅胶装填硅胶柱，用氯仿-甲醇的混合溶剂等度洗脱，得到若干馏分；氯仿与甲醇的体积比为100： 16；
(4)将上述馏分过凝胶柱，甲醇洗脱，收集比拟值相等的馏分；
(5)将步骤(4)中比拟值相等的馏分过ODS柱，用甲醇：水体积比为 30:70的混合溶剂等度洗脱，收集馏分，干燥，得到绞股蓝黄酮类化合物。
步骤(5)中所述收集馏分中馏分为比拟值在聚酰胺层析展开剂中相等的馏分；所述展开剂为甲醇和水的混合溶剂，展开剂中甲醇与水的体积比为 30:70。
所述黄酮类化合物为山奈酚-3-O-[2'-反式-香豆酰基-3'-O-β-D-葡萄糖基 -3'-O-β-D-葡萄糖芸香苷。
步骤(1)中所述乙醇水溶液的体积分数为60％～80％，优选为75％；步骤 (1)中所述绞股蓝粗粉与乙醇水溶液的质量体积比为1g:(10～25)mL；所述加热回流提取的温度为75～90℃，提取的次数为2～5次，每次1～3小时；
步骤(1)中所述干燥温度为40℃～60℃。
步骤(1)中所述离心的转速为2000～6000r/min，优选为4000r/min，离心的时间为6～15min，优选为10min。
步骤(1)中所述浓缩为减压浓缩，减压浓缩的条件为：压力0.090～0.1MPa，温度为40℃～60℃。
步骤(2)中所述石油醚萃取的次数为3～5次，所述乙酸乙酯萃取的次数为 3～5次；所述减压浓缩的温度为40℃～50℃；
步骤(2)中所述下层水相B采用正丁醇萃取，得到正丁醇相和下层水相C，将正丁醇相和水相C分别减压浓缩，得到正丁醇浸膏和水相浸膏；所述减压浓缩的温度为50℃～60℃；所述正丁醇萃取的次数为3～5次。
步骤(2)中所述石油醚相需进行减压浓缩，得到石油醚浸膏；所述减压浓缩的温度为40℃～50℃。
步骤(3)中所述拌样为湿法拌样，具体为采用甲醇溶解烘干的乙酸乙酯浸膏，然后与100-200目硅胶拌样；
步骤(3)中所述乙酸乙酯浸膏拌样后进行干燥，将干燥的乙酸乙酯相与 200-300目硅胶装填于硅胶柱中，选用氯仿-甲醇混合溶剂等度洗脱，氯仿与甲醇的体积比为100:16，洗脱多个柱体积，得到若干馏分。
步骤(4)中所述凝胶柱为葡聚糖凝胶柱。
步骤(5)中最后所得馏分进行纯度确定和结构鉴定，馏分经过分析型高效液相确定纯度，质谱MS和核磁共振波谱NMR等进行结构鉴定。
使用分析型高效液相确定纯度时，甲醇：水体积比为30:70的流动相等度洗脱，馏分出现单一峰形确定为单一物质。
所述结构鉴定为使用质谱MS和核磁共振波谱NMR等进行，最后所得馏分经干燥后为黄色松针状晶体，用1ml氘代甲醇溶解，从原子结构谱图分析确定为黄酮类化合物-山奈酚-3-O-[2'-反式-香豆酰基-3'-O-β-D-葡萄糖基-3'-O-β -D-葡萄糖芸香苷。
所述绞股蓝黄酮类化合物为山奈酚-3-O-[2'-反式-香豆酰基-3'-O-β-D-葡萄糖基-3'-O-β-D-葡萄糖芸香苷。
所述绞股蓝黄酮类化合物用于制备抗肿瘤药物，特别是制备抗人肺癌细胞 (如：A-549)和/或人乳腺癌细胞(如：MCF)药物。
绞股蓝中含有多种黄酮及其苷类化合物，主要为槲皮素(quercetin)，芦丁(rutin)，山奈酚(kaempferol)，商陆素(ombuin)，商陆苷(ombuoside)和异鼠李素(isothanmetin)，芸香苷等，黄酮含量可高达3％。其黄酮及其苷类化合物具有很强的药理活性，如抗氧化、抗肿瘤、抗菌、消炎等作用。本发明从绞股蓝全草中分离提取得到黄酮类化合物山奈酚-3-O-[2'-反式-香豆酰基 -3'-O-β-D-葡萄糖基-3'-O-β-D-葡萄糖芸香苷，并通过实验发现其具有良好的抗肿瘤活性，其原理可能是通过影响肿瘤细胞的分裂、增殖、生长等环节，并提高机体的免疫功能、非特异性和特异性免疫能力，对肿瘤细胞起防御和杀伤作用。绞股蓝中的黄酮及其苷类物质，有较好的研究应用价值。
发明的原理：
植物来源的黄酮类化合物具有抗肿瘤、抗氧化、抗菌、消炎等多方面药理作用。绞股蓝黄酮类化合物尤其能通过杀死癌细胞来体现出其抗肿瘤药理作用。通过实验分离方法，得到的绞股蓝黄酮类化合物单体纯度高达95％以上，且通过细胞实验得出黄酮类单体对杀死癌细胞具有一定的靶向性，效果与阳性对照5-F相当，说明在同样剂量下的对相应的癌细胞具有较高的毒副作用。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
(1)本发明从绞股蓝中分离提取出黄酮类化合物-山奈酚-3-O-[2'-反式-香豆酰基-3'-O-β-D-葡萄糖基-3'-O-β-D-葡萄糖芸香苷，该化合物具有较好的抗肿瘤效果；
(2)本发明分离提取绞股蓝黄酮类化合物，其纯度高达95％以上；
(3)本发明的绞股蓝黄酮类化合物对人肺癌细胞(A-549)和人乳腺癌细胞(MCF)具有一定的杀伤性，具有抗肿瘤效果，且呈浓度依赖性。
附图说明
图1是山奈酚-3-O-[2'-反式-香豆酰基-3'-O-β-D-葡萄糖基-3'-O-β-D-葡萄糖芸香苷(化合物1)的1H-NMR图谱；
图2是山奈酚-3-O-[2'-反式-香豆酰基-3'-O-β-D-葡萄糖基-3'-O-β-D-葡萄糖芸香苷(化合物1)的13C-NMR图谱；
图3是实施例1制备的绞股蓝黄酮类化合物-山奈酚-3-O-[2'-反式-香豆酰基 -3'-O-β-D-葡萄糖基-3'-O-β-D-葡萄糖芸香苷在不同浓度下对人正常肝细胞 (LO2)的存活率的柱状图；
图4是实施例1制备的绞股蓝黄酮类化合物-山奈酚-3-O-[2'-反式-香豆酰基 -3'-O-β-D-葡萄糖基-3'-O-β-D-葡萄糖芸香苷在不同浓度下对人肺癌细胞 (A-549)的抑制率的柱状图；5-F是指5-氟尿嘧啶(5-Fu)在不同浓度下对人肺癌细胞(A-549)的抑制率的柱状图；
图5是实施例1制备的绞股蓝黄酮类化合物-山奈酚-3-O-[2'-反式-香豆酰基 -3'-O-β-D-葡萄糖基-3'-O-β-D-葡萄糖芸香苷在不同浓度下对人乳腺癌细胞 (MCF)的抑制率的柱状图；5-F是指5-氟尿嘧啶(5-Fu)在不同浓度下对人乳腺癌细胞(MCF)的抑制率的柱状图；
图6是实施例4中400μg/m L的山奈酚-3-O-[2'-反式-香豆酰基-3'-O-β-D- 葡萄糖基-3'-O-β-D-葡萄糖芸香苷作用于人肺癌细胞(A-549)(B)和对照细胞(A)的形态图；
图7是实施例5中400μg/m L的山奈酚-3-O-[2'-反式-香豆酰基-3'-O-β-D- 葡萄糖基-3'-O-β-D-葡萄糖芸香苷作用于人乳腺癌细胞(MCF)(B)和对照细胞(A)的形态图。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。实施例中，人正常肝细胞LO2、人肺癌细胞A-549、人乳腺癌细胞MCF购自中科院上海生命科学研究院细胞资源中心；绞股蓝购于广州清平药材市场，产地为陕西。
实施例1从绞股蓝中提取分离出黄酮类化合物山奈酚-3-O-[2'-反式-香豆酰基-3'-O-β-D-葡萄糖基-3'-O-β-D-葡萄糖芸香苷：
(1)将绞股蓝全草干燥(50℃)、粉碎(每次粉碎时间10秒，连续3-5 次)，过20目筛，得到绞股蓝粗粉；称取5Kg绞股蓝粗粉，分批次提取，每次 500g，用体积分数为75％乙醇水溶液加热回流提取，其中，固液比为1g:15mL，回流提取温度为80℃，回流提取时间为2h，回流提取次数3次；然后合并提取液，将提取液离心(4000r/min，10min)，将上清液在0.095MPa下减压浓缩至膏状(40℃)，得到乙醇浸膏；
(2)将乙醇浸膏用蒸馏水溶解，用石油醚萃取(石油醚：蒸馏水体积比1:1)，将萃取后下层水相继续采用石油醚萃取，如此萃取3-5次至上层颜色变浅为止，合并上层石油醚相，在0.095MPa，40℃下减压浓缩后，也可将浓缩后的膏状物于50℃下烘干得到石油醚提取物；将最后一次石油醚萃取后的下层水相备用；
(3)将步骤(2)的最后一次石油醚萃取后的下层水相用等体积乙酸乙酯萃取，萃取3-5次至上层颜色变浅为止，合并上层乙酸乙酯相，在0.095MPa， 45℃下减压浓缩，得到乙酸乙酯浸膏；将最后一次乙酸乙酯萃取后的下层水相采用等体积正丁醇萃取，萃取3-5次至上层颜色变浅为止，合并正丁醇相；将正丁醇相和正丁醇萃取后的下层水相分别在0.095MPa，50℃下减压浓缩，在60℃下烘干得到正丁醇相提取物和水相提取物；
(4)将步骤(3)中的乙酸乙酯浸膏于50℃烘干，得到乙酸乙酯相提取物；称取30g乙酸乙酯相提取物，用甲醇溶解，然后与100～200目硅胶(乙酸乙酯相提取物与硅胶的质量比1：2)湿法拌样混匀，在50℃下烘干至恒重，得到干燥的乙酸乙酯相；干燥乙酸乙酯相与200～300目硅胶干法装填硅胶柱(干燥乙酸乙酯相与硅胶的质量比1:30～50，如：1:40)，柱顶端添加少量100～200目硅胶保护层；所述硅胶柱为层析硅胶柱，其大小为(Ф8*120cm)；
(5)根据流动相极性大小，选用氯仿-甲醇(体积比为100：16)的等度洗脱，冲洗5个柱体积，每1升洗脱液减压旋干为1个馏分，用甲醇溶解后收集于试管中；(在进行洗脱时，可选用8个梯度氯仿-甲醇系统洗脱，分别为体积比100:16，90:20，80：20，3:1，10:4，10:5，50:50，0:100，每个梯度洗脱 5个柱体积，这样会得到不同馏分；为了获得黄酮类化合物，选用体积比为 100:16的氯仿-甲醇进行等度洗脱)；
(6)将步骤(5)收集的馏分分别点硅胶板，在层析缸中展开，展开剂为氯仿-甲醇(体积比为100:16)，合并相同比拟值的馏分；将具有相同比拟值的馏分过葡聚糖凝胶柱(φ3*90cm)，用纯甲醇洗脱，收集比拟值相等的馏分，得到300mg的馏分；
(7)将步骤(6)中300mg的馏分过ODS柱(φ2.5*80cm)，用甲醇：水体积比为30:70的混合溶剂等度洗脱，得到馏分；将馏分干燥，干燥后的馏分为黄色松针状晶体(化合物1)；将馏分至聚酰胺薄层层析缸点板发现比拟值相等，馏分为均一物质；干燥后的馏分在365nm紫外光下有黄色荧光，喷洒1％硝酸铝显色剂，黄色荧光更加明亮；化合物1称重有180mg，初步确定为单一物质；将化合物1上高效液相，甲醇：水体积比为30:70等度冲洗，出现单一峰形确定化合物1为单一物质；化合物1的纯度高达95％以上；
(8)称取15mg化合物1用1ml氘代甲醇溶解，使用质谱MS和核磁共振波谱NMR等进行结构鉴定，从原子结构谱图分析确定化合物1为黄酮类化合物山奈酚-3-O-[2'-反式-香豆酰基-3'-O-β-D-葡萄糖基-3'-O-β-D-葡萄糖芸香苷。
实施例2确定山奈酚-3-O-[2'-反式-香豆酰基-3'-O-β-D-葡萄糖基-3'-O-β -D-葡萄糖芸香苷的结构
称取15mg实施例1制备得到的化合物1(微量)用氘代甲醇溶解置于核磁管中，利用Bruker DRX-400核磁共振仪，以四甲基硅烷(TMS)作为内标物，测定其氢谱(1H-NMR)(图1)、全去偶碳谱(13C-NMR)(图2)。图1是山奈酚 -3-O-[2'-反式-香豆酰基-3'-O-β-D-葡萄糖基-3'-O-β-D-葡萄糖芸香苷的1H-NMR图谱；图2是山奈酚-3-O-[2'-反式-香豆酰基-3'-O-β-D-葡萄糖基-3'-O- β-D-葡萄糖芸香苷的13C-NMR图谱。
化合物1为黄色松针状晶体，以聚酰胺薄层层析(甲醇：水体积比为1:1)展开，呈现单一斑点；在365nm紫外光下有黄色荧光；喷洒1％硝酸铝显色剂，黄色荧光更加明亮。
1H-NMR(氘代甲醇、400MHz)谱显示：山奈酚结构的共振[δH6.15(1H,br d,J＝2.0Hz)；6.34(1H,br d,J＝2.0Hz)；7.96(2H，d，J＝8.0Hz)；6.90(2H，d， J＝8.8Hz)]，一个(E)-酰基基团[δH7.45(2H，d，J＝8.8Hz)；6.80(2H，d， J＝8.8Hz)；7.67(1H，d，J＝15.6Hz)；6.41(1H，d，J＝15.6Hz)]和四个异头质子[δH5.54(1H，d，J＝8.0Hz)；4.43(1H，d，J＝8.0Hz)；4.41(1H，br d， J＝7.2Hz)；4.60(1H，br s)]。
13C-NMR(400MHz、氘代甲醇)谱中，糖苷配基中包含一个内葡萄糖 (δC100.8，74.4，84.5，70.1，76.6，68.4)，一个内鼠李糖(δC102.2，71.3，83.0， 72.4，69.4，18.0)，两个端基葡萄糖(δC104.7，74.7，77.4，71.2，78.0，62.4) 和(δC105.5，75.3，77.4，70.7，77.5，62.0)。耦合常数(J＝7.6-8.0Hz)表明三个D-葡萄糖均为β构型。
1H-NMR和13C-NMR数据和文献数据对照基本一致，故鉴定化合物为山奈酚 3-O-[2G-(E)-酰-3G-O-β-D-葡萄糖基-3R-O-β-D-葡萄糖芸香苷]，故鉴定该化合物为山奈酚-3-O-[2'-反式-香豆酰基-3'-O-β-D-葡萄糖基-3'-O-β-D-葡萄糖芸香苷。
山奈酚-3-O-[2'-反式-香豆酰基-3'-O-β-D-葡萄糖基-3'-O-β-D-葡萄糖芸香苷结构式为：
Figure BDA0001386014030000081
结构中Glc-Ⅰ为内葡萄糖苷配基，Glc-Ⅱ、Glc-Ⅲ为终端葡萄糖苷配基，Rha为内鼠李糖苷配基。
化合物1的1H-NMR和13C-NMR化学位移表(氘代甲醇、400MHz)如下：
化合物1的1H-NMR和13C-NMR化学位移表(氘代甲醇、400MHz)
Figure BDA0001386014030000091
实施例3 MTT法检测山奈酚-3-O-[2'-反式-香豆酰基-3'-O-β-D-葡萄糖基 -3'-O-β-D-葡萄糖芸香苷对人正常肝细胞(LO2)代谢活力
将人正常肝细胞(LO2)以1×105个/ml浓度接种于96孔细胞培养板(100 μL/孔)，置37℃，5％二氧化碳培养箱中培养。待孔板中的细胞完全贴壁后，加入不同浓度(25，50，100，200，400，800μg/mL)的实施例1制备的黄酮类化合物的溶液100μl。同时设阳性对照组，阳性对照样品为5-氟尿嘧啶 (5-Fu)，设置同样6个浓度梯度，实验还设置空白细胞对照组，即只加入100 μl完全培养液，每个浓度设6个平行。在37℃，5％CO2培养箱中继续培养，24h后取出，倒置显微镜观察细胞形态的变化。用注射器小心吸弃96孔板中培养液，用不含钙、镁离子的PBS洗板2次，然后每孔加入5mg/m L的MTT 溶液20μL(需关灯操作，MTT见光易分解)和DMEM完全培养液180μL，在37℃，5％CO2培养箱中继续培养4h。小心吸弃孔内的细胞培养液，每孔加入150μL DMSO，振荡10min。用酶联免疫检测仪在波长为490nm下测定其吸光度值。
人正常肝细胞的存活率＝样品组吸光度值/空白细胞对照组的吸光值×100％。
测试结果如图3所示；图3是实施例1制备的山奈酚-3-O-[2'-反式-香豆酰基-3'-O-β-D-葡萄糖基-3'-O-β-D-葡萄糖芸香苷在不同浓度下对人正常肝细胞 (LO2)的细胞存活率的柱状图。
由实施例1制备得到的黄酮类化合物对人正常肝细胞(LO2)的细胞存活率的柱状图(图3)可看出，在25-800μg/m L浓度范围内，黄酮类化合物作用于细胞24h，细胞存活率大于90％，显示出黄酮类化合物对LO2细胞正常生长没有毒副作用，因此后续实验设定化合物浓度为800、400、200、100、50、25μg/m L。
实施例4 MTT法检测山奈酚-3-O-[2'-反式-香豆酰基-3'-O-β-D-葡萄糖基 -3'-O-β-D-葡萄糖芸香苷对人肺癌细胞A-549的增殖抑制效果
将人肺癌细胞A-549以1×105个/ml浓度接种于96孔细胞板(100μL/ 孔)，置37℃，5％二氧化碳培养箱中培养。待孔板中的细胞完全贴壁后，加入不同浓度(25，50，100，200，400，800μg/m L)的实施例1制备的黄酮类化合物的溶液100μl。同时设阳性对照组，阳性对照样品为5-氟尿嘧啶(5-Fu)，设置同样6个浓度梯度，实验还设置空白细胞对照组，即只加入100μl完全培养液，每个浓度设6个平行。在37℃，5％CO2培养箱中继续培养，24h后取出，倒置显微镜观察细胞形态的变化。用注射器小心吸弃96孔板中培养液，用不含钙、镁离子的PBS洗板2次，然后每孔加入5mg/m L的MTT溶液20μL(需关灯操作，MTT见光易分解)和DMEM完全培养液180μL，在37℃，5％CO2培养箱中继续培养4h。小心吸弃孔内的细胞培养液，每孔加入150μL DMSO，振荡10min。用酶联免疫检测仪在波长为490nm下测定其吸光度值。
癌细胞的抑制率＝1-(样品组吸光度值/空白细胞对照组的吸光值)×100％。
测试结果如图4所示；图4是实施例1制备的山奈酚-3-O-[2'-反式-香豆酰基 -3'-O-β-D-葡萄糖基-3'-O-β-D-葡萄糖芸香苷在不同浓度下对人肺癌细胞A-549 的抑制率的柱状图，5-F是指5-氟尿嘧啶(5-Fu)在不同浓度下对人肺癌细胞 (A-549)的抑制率；图6是实施例4中400μg/m L的山奈酚-3-O-[2'-反式-香豆酰基-3'-O-β-D-葡萄糖基-3'-O-β-D-葡萄糖芸香苷作用于人肺癌细胞(A-549) (B)和对照细胞的形态图(空白细胞对照)(A)。
从图4中可知，由实施例1制备的山奈酚-3-O-[2'-反式-香豆酰基-3'-O-β-D- 葡萄糖基-3'-O-β-D-葡萄糖芸香苷在不同浓度下对A-549细胞具有较强程度的抑制作用，其IC50值为25.67μg/m L，抗肿瘤效果呈浓度依赖性，和阳性对照 5-Fu效果相当；从图6中看出，黄酮类化合物作用的癌细胞与未使用药物作用的癌细胞相比，密度降低，细胞呈现圆形，悬浮细胞数量增加，周围碎片增多，说明山奈酚-3-O-[2'-反式-香豆酰基-3'-O-β-D-葡萄糖基-3'-O-β-D-葡萄糖芸香苷对人肺癌细胞有较强的抑制作用。
实施例5 MTT法检测山奈酚-3-O-[2'-反式-香豆酰基-3'-O-β-D-葡萄糖基 -3'-O-β-D-葡萄糖芸香苷对人乳腺癌细胞MCF增殖抑制效果
将人乳腺癌细胞MCF以1×105个/ml浓度接种于96孔细胞培养板(100 μL/孔)，置37℃，5％二氧化碳培养箱中培养。待孔板中的细胞完全贴壁后，加入不同浓度(25，50，100，200，400，800μg/mL)的样品溶液100μl，同时设阳性对照组，阳性对照样品为5-氟尿嘧啶(5-Fu)，设置同样6个浓度梯度，实验还设置空白细胞对照组，即加入与样品液等量体积的完全培养液；每个浓度设6个平行。在37℃，5％CO2培养箱中继续培养，24h后取出，倒置显微镜观察细胞形态的变化。用注射器小心吸弃96孔板中培养液，用不含钙、镁离子的PBS洗板2次，然后每孔加入5mg/m L的MTT溶液20μL(需关灯操作，MTT见光易分解)和DMEM完全培养液180μL，在37℃，5％CO2培养箱中继续培养4h。小心吸弃孔内的细胞培养液，每孔加入150μLDMSO，振荡 10min。用酶联免疫检测仪在波长为490nm下测定其吸光度值。
癌细胞的抑制率＝1-样品组吸光度值/空白对照组的吸光值×100％。
测试结果如图5所示；图5是实施例1制备的山奈酚-3-O-[2'-反式-香豆酰基-3'-O-β-D-葡萄糖基-3'-O-β-D-葡萄糖芸香苷在不同浓度下对人乳腺癌细胞 MCF的抑制率的柱状图，5-F是指5-氟尿嘧啶(5-Fu)在不同浓度下对人乳腺癌细胞MCF的抑制率；图7是实施例5中400μg/m L的山奈酚-3-O-[2'-反式- 香豆酰基-3'-O-β-D-葡萄糖基-3'-O-β-D-葡萄糖芸香苷作用于人乳腺癌细胞 (MCF)(B)和对照细胞(空白细胞对照)的形态图(A)。
由实施例1制备得到的山奈酚-3-O-[2'-反式-香豆酰基-3'-O-β-D-葡萄糖基 -3'-O-β-D-葡萄糖芸香苷在不同浓度下对人乳腺癌细胞MCF细胞(图5)得出具有一定程度的抑制作用，其IC50值为679.67μg/m L，抗肿瘤效果呈浓度依赖性，和阳性对照5-Fu效果相当，在较高浓度样品下抗肿瘤效果越明显，较低浓度下抑制作用不显著，呈平稳趋势；从图7中看出400μg/m L黄酮类化合物干预的细胞与未使用药物作用的癌细胞相比，细胞形态无明显变化，细胞数量略微减少，说明山奈酚-3-O-[2'-反式-香豆酰基-3'-O-β-D-葡萄糖基-3'-O-β-D-葡萄糖芸香苷对人乳腺癌细胞损伤较低，细胞对其不敏感，抑制效果在低浓度时不明显。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种绞股蓝黄酮类化合物在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于：
所述抗肿瘤药物为抗人肺癌细胞的药物；抗人肺癌细胞为抗人肺癌细胞A-549；
所述绞股蓝黄酮类化合物为山奈酚-3-O-[2'-反式-香豆酰基-3'-O-β-D-葡萄糖基-3'-O-β-D-葡萄糖芸香苷：
Figure FDA0002760100830000011
结构中Glc-Ⅰ为内葡萄糖苷配基，Glc-Ⅱ、Glc-Ⅲ为终端葡萄糖苷配基，Rha为内鼠李糖苷配基；
所述绞股蓝黄酮类化合物的制备方法，包含如下步骤：
(1)将绞股蓝全草干燥、粉碎、过筛，得到绞股蓝粗粉；采用乙醇水溶液加热回流提取绞股蓝粗粉；将提取液离心，并将上清液浓缩，得到浓缩的绞股蓝乙醇浸膏；
(2)将绞股蓝乙醇浸膏用水溶解，过滤，将滤液采用石油醚萃取，得到上层石油醚相和下层水相A；将下层水相A采用乙酸乙酯萃取，得到乙酸乙酯相和下层水相B；将乙酸乙酯相进行减压浓缩，得到乙酸乙酯浸膏；
(3)将乙酸乙酯浸膏烘干，然后与硅胶拌样，再与硅胶装填硅胶柱，用氯仿-甲醇的混合溶剂等度洗脱，得到若干馏分；氯仿与甲醇的体积比为100：16；
(4)将上述馏分过凝胶柱，甲醇洗脱，收集比拟值相等的馏分；
(5)将步骤(4)中比拟值相等的馏分过ODS柱，用甲醇：水体积比为30:70的混合溶剂等度洗脱，收集馏分，通过干燥得到绞股蓝黄酮类化合物。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：步骤(1)中所述乙醇水溶液的体积分数为60％～80％；步骤(1)中所述绞股蓝粗粉与乙醇水溶液的质量体积比为1g:(10～25)mL；
步骤(2)中所述石油醚萃取的次数为3～5次，所述乙酸乙酯萃取的次数为3～5次；所述减压浓缩的温度为40℃～50℃。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：步骤(1)中所述加热回流提取的温度为75～90℃，步骤(1)中所述提取的次数为2～5次，每次1～3小时；
步骤(1)中所述干燥温度为40℃～60℃；
步骤(1)中所述浓缩为减压浓缩，减压浓缩的条件为：压力0.090～0.1MPa，温度为40℃～60℃。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：步骤(5)中所述收集馏分中馏分为比拟值在聚酰胺层析展开剂中相等的馏分；所述展开剂为甲醇和水的混合溶剂，展开剂中甲醇与水的体积比为30:70。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：步骤(3)中所述拌样为湿法拌样，具体为采用甲醇溶解烘干的乙酸乙酯浸膏，然后与100-200目硅胶拌样；
步骤(3)中所述乙酸乙酯浸膏拌样后进行干燥，将干燥的乙酸乙酯相与200-300目硅胶装填于硅胶柱中，选用氯仿-甲醇混合溶剂等度洗脱，氯仿与甲醇的体积比为100:16，洗脱多个柱体积，得到若干馏分。
6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：步骤(2)中所述下层水相B采用正丁醇萃取，得到正丁醇相和下层水相C，将正丁醇相和水相C分别减压浓缩，得到正丁醇浸膏和水相浸膏；所述减压浓缩的温度为50℃～60℃；所述正丁醇萃取的次数为3～5次；
步骤(2)中所述石油醚相需进行减压浓缩，得到石油醚浸膏；所述减压浓缩的温度为40℃～50℃。
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