CN108623645B - 一种黄酮类化合物及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种黄酮类化合物及其制备方法与应用。该黄酮类化合物的结构式如式I所示。本发明化合物具有抗肿瘤活性，能够在制备抗肿瘤药物中应用。

Description

一种黄酮类化合物及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及一种抗肿瘤的化合物，具体地，涉及一种黄酮类化合物及其制备方法与应用。

背景技术

肿瘤尤其是恶性肿瘤已经成为严重威胁人类健康的疾病之一，该病发展较快，且治疗后效果较差。全世界60多亿人口中，平均每年死于恶性肿瘤者达690万人，新发病例为870万例。随着经济发展，人们生活水平逐步提高，生活节奏不断加快，肿瘤的发病率和死亡率也在增加，且还有继续增加的趋势。各类肿瘤疾病导致的死亡是仅次于心血管疾病的第二大死因。尽管现代医学水平在不断提高，世界抗肿瘤药物研发硕果累累，抗肿瘤药物在肿瘤患者的治愈率、延长生存时间、延缓疾病等方面发挥了巨大的作用，但是抗肿瘤药物的毒副作用以及一些严重的不良反应仍不可小视，严重影响患者的生存质量。因此，为满足抗肿瘤药物市场的需要，研究和开发疗效确切、不良反应小的植物来源抗肿瘤药物具有重要意义。

银杏叶为银杏科银杏属植物银杏Ginkgo biloba L.的干燥叶，主产于江苏、广西、山东等地，为我国特有珍贵树种。银杏叶性甘、苦、涩、平，归心、肺经。具有活血化瘀，通络止痛，敛肺平喘，化浊降脂等功效。现代药理研究表明，银杏叶具有降低胆固醇、扩张冠状血管、松弛支气管平滑肌等作用，常用于预防和治疗脑血管供血不足、心肌缺血等心脑血管疾病，实验发现其主要活性成分为黄酮类和萜内酯类化合物。

目前从银杏叶中分离得到的化学成分主要有黄酮类、萜内酯类、多糖类、聚戊烯醇类化合物，以及有机酸、烷基酚酸类和挥发油等。其中黄酮类化合物含量较高，主要有黄酮醇苷、双黄酮和儿茶素等物质，具有明显的抗氧化、抗炎、清除自由基、调节内分泌、抗肿瘤以及调节免疫系统等多种生理活性。本发明化合物及其抗肿瘤活性作用研究还未见诸报道。

发明内容

本发明的主要目的是提供一种具有抗肿瘤效果的新型黄酮类化合物。

本发明提供的黄酮类化合物的结构式如式I所示。

本发明还提供了一种制备式I所示黄酮类化合物的方法，其包括如下步骤：

a、准备银杏叶；

b、对所述银杏叶进行提取，得到清膏；

c、将所述清膏通过大孔吸附树脂柱色谱进行分离，以纯化水洗脱，弃去水洗液，然后用乙醇-水溶液进行洗脱，收集乙醇-水洗脱液，浓缩得到粗品I；其中，

所述大孔吸附树脂柱色谱中的大孔吸附树脂为D101型大孔吸附树脂、HP-20型大孔吸附树脂、HPD-450型大孔吸附树脂、HPD-950型大孔吸附树脂或AB-8型大孔吸附树脂中的任意一种；

d、将所述粗品I通过反相C₁₈柱色谱进行梯度洗脱，得到粗品II；其中，

所述反相C₁₈柱色谱为动态轴向压缩色谱、高效液相色谱或中低压制备色谱，所用流动相为甲醇-水溶液或乙腈-水溶液；

e、将所述粗品II通过凝胶柱色谱进行纯化，得到粗品III；其中，

所述凝胶柱色谱中的凝胶为Sephadex LH-20、Sephadex G15或Sephadex G50，所用流动相为甲醇；

f、将所述粗品III通过制备型液相色谱进行分离，得到所述黄酮类化合物；其中，

所述制备型液相色谱所用流动相为甲醇-水溶液或乙腈-水溶液。

进一步地，步骤b中，采用乙醇-水溶液对所述银杏叶进行提取，所述乙醇-水溶液的浓度为30～95％，优选为60％。

进一步地，所述银杏叶与所述乙醇-水溶液的重量比为1:6～1:10，优选为1:8；提取次数为1～3次，优选为2次；提取时间为0.5～3小时，优选为1.5～2.5小时。

进一步地，步骤c中，所述乙醇-水溶液的浓度为20～40％。

进一步地，步骤d中，所述梯度洗脱采用的流动相为15～80％乙腈-水溶液，优选为25～75％乙腈-水溶液。

进一步地，步骤f中，所述乙腈-水溶液的浓度为20～40％。

进一步地，步骤f中，所述流动相的流速为3～20mL/min，检测波长为350nm。

本发明还提供一种上述黄酮类化合物在制备抗肿瘤药物中的应用。

本发明还提供一种抗肿瘤药物，其包括上述黄酮类化合物。

本发明提供的式I所示结构的黄酮类化合物对人肺癌细胞A549和人乳腺癌细胞MCF-7有显著抑制作用，具有良好的抗肿瘤作用。

附图说明

图1为本发明制得的式I结构的化合物的ESI-MS谱图；

图2为本发明制得的式I结构的化合物的¹H NMR谱图；

图3为本发明制得的式I结构的化合物的¹³C NMR谱图；

图4为本发明制得的式I结构的化合物的HSQC谱图；

图5为本发明制得的式I结构的化合物的HMBC谱图；

图6为本发明制得的式I结构的化合物的¹H-¹H COSY谱图；

图7为本发明制得的式I结构的化合物的TOCSY谱图。

具体实施方式

以下结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式进行更加详细的说明，以便能够更好地理解本发明的方案以及其各个方面的优点。然而，以下描述的具体实施方式和实施例仅是说明的目的，而不是对本发明的限制。

特别需要指出的是，针对本发明所做出的类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

其次，需要注意的是，本发明所涉及的所有浓度均为体积百分含量(v/v)。

另，本发明如未注明具体条件者，均按照常规条件或制造商建议的条件进行，所用原料药或辅料，以及所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

本发明提供的黄酮类化合物从银杏叶中分离提取而得，其结构如式I所示，该黄酮类化合物对人肺癌细胞A549和人乳腺癌细胞MCF-7具有显著抑制作用，具有良好的抗肿瘤作用。

本发明提供了一种式I所示黄酮类化合物的制备方法，包括如下步骤：

a、准备银杏叶；

b、对银杏叶进行提取，得到清膏；

c、将清膏通过大孔吸附树脂柱色谱分离，以纯化水洗脱，弃去水洗液，然后用乙醇-水溶液进行洗脱，收集乙醇-水洗脱液，浓缩得到粗品I；

d、将粗品I通过反相C₁₈柱色谱梯度洗脱，得到粗品II；

e、将粗品II通过凝胶柱色谱纯化，得到粗品III；

f、将粗品III通过制备型液相色谱分离，即得。

本发明提供的式I所示黄酮类化合物从银杏叶Ginkgo biloba L.中分离提取而得。本发明对提取的方法没有特殊限制，本领域公知的用于溶剂提取中草药成分的方法均可，本发明优选采用乙醇-水溶液提取。

具体地，将银杏叶与乙醇-水溶液混合，回流提取，过滤，将滤液浓缩得到清膏。

在本发明的优选实施例中，在步骤b中，使用的乙醇-水溶液的浓度为30～95％，优选为60％。银杏叶与乙醇-水溶液的重量比为1:6～1:10，优选为1:8。提取的次数为1～3次，优选为2次；提取的时间为0.5～3小时，优选为1.5～2.5小时。

得到的清膏依次通过大孔吸附树脂柱色谱、反相C₁₈柱色谱、凝胶柱色谱和制备型液相色谱分离得到式I所示黄酮类化合物，即步骤c、d、e、f。

步骤c中的大孔吸附树脂柱色谱中的大孔吸附树脂为D101型大孔吸附树脂、HP-20型大孔吸附树脂、HPD-450型大孔吸附树脂、HPD-950型大孔吸附树脂或AB-8型大孔吸附树脂中的任意一种。

在本发明的优选实施例中，步骤c中，采用20～40％的乙醇-水溶液进行洗脱。

步骤d中，所用的反相C₁₈柱色谱为动态轴向压缩色谱、高效液相色谱或中低压制备色谱，所用流动相为甲醇-水溶液或乙腈-水溶液。

在本发明的优选实施例中，步骤d所用的乙腈-水溶液的浓度为15～80％，优选为25～75％。

步骤e中，凝胶柱色谱中的凝胶为Sephadex LH-20、Sephadex G15或SephadexG50，所用流动相为甲醇。

步骤f中，制备型液相色谱所用流动相为甲醇-水溶液或乙腈-水溶液。

在本发明的优选实施例中，步骤f所用的乙腈-水溶液的浓度为20～40％。

在本发明的优选实施例中，步骤f中所用的流动相的流速为3～20mL/min，检测波长为350nm。

本发明还提供一种式I所示黄酮类化合物在制备抗肿瘤药物中的应用。

本发明还提供一种抗肿瘤药物，其包括式I所示黄酮类化合物。

下面参考具体实施例，对本发明进行说明。下述实施例中所取工艺条件数值均为示例性的，其可取数值范围如前述发明内容中所示。下述实施例所用的检测方法均为本行业常规的检测方法。

黄酮类化合物的制备

药材与试剂

除液相色谱用甲醇和乙腈为色谱纯外，其余试剂均为分析纯。银杏叶为Ginkgobiloba L.的干燥叶，购于江苏邳州。

实施例1

11)取干燥的银杏叶10kg，粉碎过筛后加入8倍量的60％乙醇-水溶液，提取3次，每次1.5h，过滤，滤液浓缩、回收乙醇得到清膏。

12)取步骤11)的清膏，加入纯化水使其溶解，室温静置，再取上清液经HP-20大孔吸附树脂柱分离，以4倍柱体积的纯化水洗脱，弃去水洗液，然后用4倍柱体积的25％乙醇-水溶液进行洗脱，收集25％乙醇-水溶液洗脱部位，得到粗品I。

13)取粗品I，减压浓缩后经反相C₁₈动态轴向压缩柱(80×600mm，70μm)色谱进行分离，以(15～80)％乙腈-水溶液梯度洗脱，流速70mL/min，每5min收集一个馏分，共收集12个馏分(Fr.1-Fr.12)。

14)取步骤13)的馏分Fr.8(即粗品II)，浓缩后经Sephadex LH-20柱色谱分离纯化，甲醇洗脱，每8mL收集一个流份，减压浓缩，得到粗品III。

15)取粗品III，经制备型HPLC(21.2×250mm，5μm)分离，以23％乙腈-水溶液为流动相，流速15mL/min，检测波长为350nm，得到6mg成品。

实施例2

21)取干燥的银杏叶15kg，粉碎过筛后加入8倍量的70％乙醇-水溶液，提取2次，每次2h，过滤，滤液浓缩、回收乙醇得到清膏。

22)取步骤21)的清膏，加入纯化水使其溶解，室温静置，再取上清液经D101大孔吸附树脂柱进行分离，以4倍柱体积的纯化水洗脱，弃去水洗脱液，然后以4倍柱体积的35％乙醇-水溶液进行洗脱，收集35％乙醇-水溶液洗脱部位，得到粗品I。

23)取粗品I，经反相C₁₈动态轴向压缩柱(80×600mm，70μm)色谱进行分离，以(20～75)％乙腈-水溶液进行梯度洗脱，流速70mL/min，每5min收集一个馏分，共收集13个馏分(Fr.1-Fr.13)。

24)取步骤23)的馏分Fr.10(即粗品II)，经Sephadex LH-20柱色谱分离纯化，甲醇洗脱，每8mL收集一个流份，减压浓缩，得到粗品III。

25)取粗品III，经制备型HPLC(21.2×250mm，5μm)分离，以30％乙腈-水溶液为流动相，流速15mL/min，检测波长为350nm，得到12mg成品。

实施例3

31)取干燥的银杏叶12kg，粉碎过筛后加入10倍量的30％乙醇-水溶液，提取3次，每次2.5h，过滤，滤液浓缩、回收乙醇得到清膏。

32)取步骤31)的清膏，加入纯化水使其溶解，室温静置，再取上清液经HPD-450型大孔吸附树脂柱进行分离，以4倍柱体积的纯化水洗脱，弃去水洗脱液，然后以4倍柱体积的30％乙醇-水溶液进行洗脱，收集30％乙醇-水溶液洗脱部位，得到粗品I。

33)取粗品I，经反相C₁₈高效液相色谱(50×250mm，10μm)进行分离，以(35～60)％乙腈-水溶液进行梯度洗脱，流速30mL/min，每5min收集一个馏分，共收集10个馏分(Fr.1-Fr.10)。

34)取步骤33)的馏分Fr.6(即粗品II)，经Sephadex G15柱色谱分离纯化，甲醇洗脱，每8mL收集一个流份，减压浓缩，得到粗品III。

35)取粗品III，经制备型HPLC(30×250mm，5μm)分离，以26％乙腈-水溶液为流动相，流速20mL/min，检测波长为350nm，得到6mg成品。

实施例4

41)取干燥的银杏叶16kg，粉碎过筛后加入6倍量的95％乙醇-水溶液，提取1次，3h，过滤，滤液浓缩、回收乙醇得到清膏。

42)取步骤41)的清膏，加入纯化水使其溶解，室温静置，再取上清液经HPD-950型大孔吸附树脂柱进行分离，以4倍柱体积的纯化水洗脱，弃去水洗脱液，再以4倍柱体积的40％乙醇-水溶液进行洗脱，收集40％乙醇-水溶液洗脱部位，得到粗品I。

43)取粗品I，经反相C₁₈中低压制备色谱(80×600mm，70μm)进行分离，以(25～75)％甲醇-水溶液进行梯度洗脱，流速60mL/min，每5min收集一个馏分，共收集13个馏分(Fr.1-Fr.13)。

44)取步骤43)的馏分Fr.10(即粗品II)，经Sephadex G50柱色谱分离纯化，甲醇洗脱，每8mL收集一个流份，减压浓缩，得到粗品III。

45)取粗品III，经制备型HPLC(21.2×250mm，5μm)分离，以40％甲醇-水溶液为流动相，流速15mL/min，检测波长为350nm，得到5mg成品。

实施例5

51)取干燥的银杏叶10kg，粉碎过筛后加入7倍量的70％乙醇-水溶液，提取3次，每次0.5h，过滤，滤液浓缩、回收乙醇得到清膏。

52)取步骤51)的清膏，加入纯化水使其溶解，室温静置，再取上清液经AB-8型大孔吸附树脂柱进行分离，以4倍柱体积的纯化水洗脱，弃去水洗脱液，再以4倍柱体积的25％乙醇-水溶液进行洗脱，收集25％乙醇-水溶液洗脱部位，得到粗品I。

53)取粗品I，经反相C₁₈动态轴向压缩柱(80×600mm，70μm)色谱进行分离，以(25～75)％乙腈-水溶液进行梯度洗脱，流速70mL/min，每5min收集一个馏分，共收集12个馏分(Fr.1-Fr.12)。

54)取步骤53)的馏分Fr.8(即粗品II)，经Sephadex LH-20柱色谱分离纯化，甲醇洗脱，每8mL收集一个流份，减压浓缩，得到粗品III。

55)取粗品III，经制备型HPLC(21.2×250mm，5μm)分离，以32％乙腈-水溶液为流动相，流速20mL/min，检测波长为350nm，得到7mg成品。

实施例6

61)取干燥的银杏叶8kg，粉碎过筛后加入8倍量的60％乙醇-水溶液，提取2次，每次2h，过滤，滤液浓缩、回收乙醇得到清膏。

62)取步骤61)的清膏，加入纯化水使其溶解，室温静置，再取上清液经HP-20型大孔吸附树脂柱进行分离，以4倍柱体积的纯化水洗脱，弃去水洗脱液，再以4倍柱体积的20％乙醇-水溶液进行洗脱，收集20％乙醇-水溶液洗脱部位，得到粗品I。

63)取粗品I，经反相C₁₈动态轴向压缩柱(80×600mm，70μm)色谱进行分离，以(20～75)％乙腈-水溶液进行梯度洗脱，流速70mL/min，每5min收集一个馏分，共收集13个馏分(Fr.1-Fr.13)。

64)取步骤63)的馏分Fr.10(即粗品II)，经Sephadex LH-20柱色谱分离纯化，甲醇洗脱，每5mL收集一个流份，减压浓缩，得到粗品III。

65)取粗品III，经制备型HPLC(21.2×250mm，5μm)分离，以20％乙腈-水溶液为流动相，流速15mL/min，检测波长为350nm，得到7mg成品。

实施例7

71)取干燥的银杏叶5kg，粉碎过筛后加入8倍量的60％乙醇-水溶液，提取2次，每次1.5h，过滤，滤液浓缩、回收乙醇得到清膏。

72)取步骤71)的清膏，加入纯化水使其溶解，室温静置，再取上清液经HP-20型大孔吸附树脂柱进行分离，以4倍柱体积的纯化水洗脱，弃去水洗脱液，然后以4倍柱体积的30％乙醇-水溶液进行洗脱，收集30％乙醇-水溶液洗脱部位，得到粗品I。

73)取粗品I，经反相C₁₈高效液相色谱(50×250mm，10μm)进行分离，以(20～75)％甲醇-水溶液进行梯度洗脱，流速30mL/min，每5min收集一个馏分，共收集13个馏分(Fr.1-Fr.13)。

74)取步骤73)的馏分Fr.10(即粗品II)，经Sephadex LH-20柱色谱分离纯化，甲醇洗脱，每5mL收集一个流份，减压浓缩，得到粗品III。

75)取粗品III，经制备型HPLC(10×250mm，5μm)分离，以35％甲醇-水溶液为流动相，流速3mL/min，检测波长为350nm，得到5mg成品。

结构鉴定

实施例1-7所得成品均为淡黄色粉末，难溶于甲醇、水，在365nm紫外光下显黄色荧光，盐酸-镁粉反应呈阳性，Molish反应呈阳性，提示可能为黄酮类化合物。

采用ESI-MS、¹H NMR、¹³C NMR、HSQC、HMBC、¹H-¹H COSY和TOCSY谱对实施例1-7所得成品进行结构鉴定。

图1为实施例1制得的化合物的ESI-MS谱图，图2为实施例1制得的化合物的¹H NMR谱图，图3为实施例1制得的化合物的¹³C NMR谱图，图4为实施例1制得的化合物的HSQC谱图，图5为实施例1制得的化合物的HMBC谱图，图6为实施例1制得的化合物的¹H-¹H COSY谱图，图7为实施例1制得的化合物的TOCSY谱图。

HR-ESI-MS负离子模式m/z:653.1733[M-H]^-，HR-ESI-MS正离子模式m/z:677.1704[M+Na]⁺(计算值C₂₉H₃₃O₁₇，653.18)，推测其分子式为C₂₉H₃₄O₁₇，相对分子质量为654.18。

本化合物的¹H NMR(400MHz，DMSO-d₆)谱(图2)中，δ_H 12.51(1H,s)为黄酮类化合物5位活泼羟基特征信号；低场区芳香质子δ_H 7.45(1H,d,J＝2.0Hz)和7.12(1H,d,J＝2.0Hz)为一组相互耦合的双重峰；δ_H 6.21(1H,d,J＝1.8Hz)和6.40(1H,d,J＝1.8Hz)为A环间位耦合的两个芳香质子信号；δ_H3.83(3H,s)和3.76(3H,s)提示结构中存在2个甲氧基，由于B环无AA'BB'对称峰，故B环可能有三个取代基，即甲氧基和羟基，提示结构中可能含有一个3',4',5'-三取代的苯环；δ_H 5.52(1H,d,J＝7.4Hz)为葡萄糖端基质子信号，据其偶合常数可知葡萄糖苷键为β-构型，δ_H 4.45(1H,d,J＝0.8Hz)为鼠李糖端基质子信号，δ_H 0.98(3H,d,J＝6.2Hz)为鼠李糖基上的甲基质子特征信号，此外在δ_H 3.0～3.8处为糖配基上质子信号峰，至此推测该化合物可能为5,7,3',4',5'-五取代黄酮苷类化合物。¹³C NMR(100MHz，DMSO-d₆)谱(图3)中，δ_C 56.3和60.5为两个甲氧基信号，除了黄酮骨架15个碳信号外，该结构中还含有1个葡萄糖和鼠李糖单元。δ_C 177.8为黄酮4位羰基的特征信号，δ_C99.4和δ_C94.2为5,7-二氧代黄酮A环上的6、8位的特征信号，高场区δ_C 18.1的为鼠李糖上甲基碳信号。HMBC谱中，葡萄糖的端基质子δ_H 5.52(1H,d,J＝7.4Hz)与苷元母核3位碳信号δ_C134.1远程相关，提示苷元的3位与葡萄糖的1位相连；葡萄糖6位质子信号δ_H 3.72(1H,m,H_a)和3.39(1H,m,H_b)分别与鼠李糖的端基碳信号δ_C 101.3有远程相关，同时葡萄糖6位碳化学位移值δ_C 67.2较游离葡萄糖6位碳向低场移动，证明鼠李糖的1位连接在葡萄糖的6位；δ_H 7.45(1H,d,J＝2.0Hz)和δ_C 139.1，110.2，156.1相关，δ_H 7.12(1H,d,J＝2.0Hz)和δ_C 139.1，105.7，156.1相关，甲氧基质子δ_H 3.83(3H,s)和δ_C 153.0相关，δ_H 3.76(3H,s)和δ_C 139.1相关，提示B环为3'-羟基-4',5'-二甲氧基取代。结合¹H-¹H COSY、TOCSY和ESI-MS等波谱数据信息，确定该化合物为5,7,3'-三羟基-4',5'-二甲氧基黄酮醇-3-O-α-L-鼠李糖基(1→6)-O-β-D-葡萄糖苷，英文名称为5,7,3'-trihydroxy-4',5'-dimethoxy-flavonol-3-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→6)-O-β-D-glucopyranoside，结构如式I所示，为一个新的黄酮苷类化合物。

表1为该化合物的核磁数据归属，其结构式如式I所示。

表1式I所示化合物的核磁数据

(DMSO-d₆,¹H NMR 400MHz,¹³C NMR 100MHz)

实施例2-7的ESI-MS谱图、¹H NMR谱图、¹³C NMR谱图、HSQC谱图、HMBC谱图、¹H-¹HCOSY谱图和TOCSY谱图与实施例1相同，说明其结构式均如式I所示。

黄酮类化合物体外抗肿瘤试验

1、材料

人肺癌细胞株A549(南京科佰生物科技有限公司，批号CBP60080)，人乳腺癌细胞MCF-7(ATCC)，CCK-8试剂盒(贝博生物)；DMEM培养基、RPMI1640培养基、胎牛血清(美国Gibco公司)；黄酮类化合物(结构式如式I所示)。

2、仪器

Thermo scientific 3100二氧化碳培养箱(美国Thermo公司)；Flex station 3微孔板检测系统(美国MD公司)。

3、试验方法

3.1黄酮类化合物对人肺癌细胞A549的体外抑制试验

人肺癌细胞A549用含10％胎牛血清的RPMI-1640培养液，在37℃，5％CO2细胞培养箱中进行培养。每两天换液1次，待细胞长至对数生长期时进行试验。取对数生长期肺癌细胞，用0.25％胰酶消化，计数，以内含10％胎牛血清的RPMI-1640培养液稀释为5×10³/L细胞悬浮液，接种于96孔板中，100μL/孔，待细胞贴壁生长后，将细胞分为阴性对照组、阳性药顺铂(50μmol/L)、黄酮类化合物处理组(100、50、10、1、0.1μmol/L)，每孔200μL，每组设8个复孔。细胞培养箱中培养48h后终止反应，采用CCK-8检测细胞各孔吸光度(A)值。以空白组A值为细胞存活率100％，抑制率为0，计算各组细胞的抑制率。

抑制率(％)＝(1-A_给药组/A_对照组)×100％。

3.2黄酮类化合物对人乳腺癌细胞MCF-7的体外抑制试验

人乳腺癌细胞MCF-7常规培养于含10％小牛血清的RPMI1640培养基中，置于37℃，5％CO₂的细胞培养箱中贴壁培养。接种细胞进入对数生长期后，用RPMI1640培养液配成1×10⁵/ml的细胞悬液，接种于96孔板中，待细胞贴壁后将细胞分为阴性对照组、阳性药顺铂(50μmol/L)、黄酮类化合物处理组(100、50、10、1、0.1μmol/L)，作用48h后采用CCK-8检测细胞活性各种观察指标。

4、统计方法

使用SPSS 16.0统计软件进行分析，实验数据均以

表示，两组间比较采用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

5、结果

5.1黄酮类化合物对人肺癌细胞A549的体外抑制试验

结果表明，黄酮类化合物作用于人肺癌细胞A549 48h后，显著抑制肺癌细胞的增殖，并且随着黄酮类化合物浓度的升高，抑制率也明显增大，黄酮类化合物IC50值为3.58μmol/L，结果见表2。

表2不同浓度黄酮类化合物对人肺癌细胞增值的影响

5.2黄酮类化合物对人乳腺癌细胞MCF-7的体外抑制试验

结果表明，黄酮类化合物作用于人乳腺癌细胞MCF-7 48h后，显著抑制乳腺癌细胞的增殖，并且随着黄酮类化合物浓度的升高，抑制率也明显增大，黄酮类化合物IC50值为3.64μmol/L，结果见表3。

表3不同浓度黄酮类化合物对人乳腺癌细胞增值的影响

综上可知，本发明提供的式I所示结构的黄酮类化合物对人肺癌细胞A549和人乳腺癌细胞MCF-7有显著抑制作用，具有良好的抗肿瘤作用。

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之中。

Claims (7)

1.一种黄酮类化合物的制备方法，其特征在于，制备方法包括如下步骤：

a、准备银杏叶；

b、对所述银杏叶进行提取，得到清膏；

c、将所述清膏通过大孔吸附树脂柱色谱进行分离，以纯化水洗脱，弃去水洗液，然后用乙醇-水溶液进行洗脱，收集乙醇-水洗脱液，浓缩得到粗品I；其中，

所述大孔吸附树脂柱色谱中的大孔吸附树脂为D101型大孔吸附树脂、HP-20型大孔吸附树脂、HPD-450型大孔吸附树脂、HPD-950型大孔吸附树脂或AB-8型大孔吸附树脂中的任意一种；

d、将所述粗品I通过反相C₁₈柱色谱进行梯度洗脱，得到粗品II；其中，

所述反相C₁₈柱色谱为动态轴向压缩色谱、高效液相色谱或中低压制备色谱，所用流动相为甲醇-水溶液或乙腈-水溶液；

e、将所述粗品II通过凝胶柱色谱进行纯化，得到粗品III；其中，

所述凝胶柱色谱中的凝胶为Sephadex LH-20、Sephadex G15或Sephadex G50，所用流动相为甲醇；

f、将所述粗品III通过制备型液相色谱进行分离，得到所述黄酮类化合物；其中，

所述制备型液相色谱所用流动相为甲醇-水溶液或乙腈-水溶液；

所述黄酮类化合物结构式如式I所示，

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤b中，采用乙醇-水溶液对所述银杏叶进行提取，所述乙醇-水溶液的浓度为60％。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述银杏叶与所述乙醇-水溶液的重量比为1:8；提取次数为2次；提取时间为1.5～2.5小时。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤c中，所述乙醇-水溶液的浓度为20～40％。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤d中，所述梯度洗脱采用的流动相为25～75％乙腈-水溶液。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤f中，所述乙腈-水溶液的浓度为20～40％。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤f中，所述流动相的流速为3～20mL/min，检测波长为350nm。

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