CN103191143A - 一种强心苷化合物的新用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了强心苷化合物12β-hydroxycalotropin在制备具有治疗和预防肿瘤作用的药物中的用途，该强心苷化合物12β-hydroxycalotropin具有显著的抗肿瘤活性，可作为治疗肿瘤的先导化合物；同时，本发明提供的强心苷化合物12β-hydroxycalotropin的提取分离方法简单易行，成本低，效率和得率高，提取物质量好。

Description

一种强心苷化合物的新用途

技术领域

本发明涉及强心苷化合物，具体涉及一种强心苷化合物12β-hydroxycalotropin及其用途。

背景技术

肿瘤对人类健康和生命的威胁很大，它和心血管疾患已成为医学上的两大难关，在全世界构成死亡原因的头两位。全世界52亿人口中，每年约有700万人新患肿瘤，每年约有500多万人死于肿瘤，几乎每6秒钟就有一名肿瘤患者死亡。我国目前每年平均约有150万人新患肿瘤，每年约有80万人死于肿瘤。现有的抗肿瘤药物都不能彻底有效地治愈。同时由于新型肿瘤的不断发现，迫使人们努力寻找新的抗肿瘤药物。长期以来，从药用植物尤其是热带药用植物中寻找抗肿瘤药物成为各国医学、药学、化学及生物学家的一个共同愿望。研究表明，抗肿瘤药物70％来源于热带或亚热带植物。继长春花新碱之后，紫杉醇及其衍生物Epothilones的发现，使此项工作取得了突破性的进展。然而，由于有些抗肿瘤成分在植物体内含量极低，有些植物还是濒危珍稀物种，且植物生长缓慢，过度采挖可能导致该物种的灭绝，这些因素限制了抗肿瘤植物药的发展。

牛角瓜[Calotropis gigantea (L.) Dryand ex Ait. f.]为萝藦科(Asclepiadaceae)牛角瓜属(Calotropis)植物。在我国主要分布于海南、广东、四川和云南等地。牛角瓜全株有毒，其根、茎、叶、花、果及各部位的白色汁液均可药用，具有抗菌、消炎、驱虫、化痰、解毒等功效，是一种民间常用药。国内外研究表明牛角瓜主要含强心苷类化合物，为其毒性成分。但是关于牛角瓜中的强心苷化合物12β-hydroxycalotropin是否具有抗肿瘤作用目前还是未知的。

发明内容

本发明的目的在于提供一种强心苷化合物12β-hydroxycalotropin在制备具有治疗和预防肿瘤作用的药物中的用途。

本申请发明人对牛角瓜中的强心苷类化合物12β-hydroxycalotropin进行了提取、分离、纯化和抗肿瘤活性测试发现，该牛角瓜中的强心苷化合物12β-hydroxycalotropin具有抗肿瘤的新用途。

本发明的上述目的是通过如下技术方案来实现的：强心苷化合物12β-hydroxycalotropin在制备具有治疗和预防肿瘤作用的药物中的用途，所述强心苷化合物12β-hydroxycalotropin的分子式为C₂₉H₄₀O₁₀，结构式如下：

本发明所述肿瘤主要是为胆管癌、肾癌、胰腺癌、结肠直肠癌、膀胱癌、乳腺癌、子宫癌、卵巢癌、大肠癌、肝癌、胆癌、胆道癌、急性白血病、恶性淋巴瘤、脑瘤、骨肿瘤、黑素瘤、神经胶质瘤、口腔癌、鼻咽癌、肺癌或胃癌等。

本发明强心苷化合物12β-hydroxycalotropin可以从牛角瓜中利用包括吸附树脂柱层析、硅胶柱层析、反相硅胶柱层析、凝胶柱层析、减压柱层析等多种分离手段获得，或者通过合成以及半合成手段获得。与适宜的赋形剂相结合，按照常规方法制成各种剂型。

本发明所述强心苷化合物12β-hydroxycalotropin优选的制备方法如下： 

A、选取牛角瓜茎，粉碎后，加入乙醇，浸提3～4次，每次6～8天，合并浸提液，减压浓缩至无醇味得到牛角瓜的乙醇提取物；

B、将牛角瓜的乙醇提取物分散于水中制成牛角瓜悬浊液，分别按牛角瓜悬浊液与石油醚的体积比为1:3、1:2和1:1，用石油醚对牛角瓜悬浊液重复萃取后，保留石油醚萃取后的水相；

C、将石油醚萃取后的水相过滤，将滤液用D-101大孔吸附树脂柱色谱分离，并依次用水和甲醇洗脱，收集甲醇洗脱液，减压浓缩回收甲醇后，得到甲醇浸膏；

D、将甲醇浸膏经减压硅胶柱层析，以氯仿与甲醇的体积比分别为100:1、50:1、25:1、10:1、5:1、2:1和0:100作为洗脱剂，对减压硅胶柱进行梯度洗脱，分别得粗提物Fr.1~Fr.7；

E、将步骤D所得粗提物Fr.4经硅胶柱层析，以氯仿与甲醇的体积比分别为10:1、8:1、6:1、4:1、2:1、0:1作为洗脱剂，对硅胶柱进行梯度洗脱，得到6个部分Fr.4-1~Fr.4-6；

F、将E步骤的Fr.4-2经硅胶柱层析，采用氯仿和丙酮作为洗脱剂进行洗脱，洗脱时采用TLC薄层色谱收集相同的成分，得到6个部分Fr.4-2-1~Fr.4-2-6；将Fr.4-2-3依次进行Sephadex LH-20凝胶柱层析、反相柱层析、以及再次硅胶柱层析，最终得到强心苷化合物12β-hydroxycalotropin。

本发明步骤A中牛角瓜茎与乙醇的质量体积比为1kg：1～3L；所述乙醇的体积百分含量为92～98％。

本发明步骤B中用石油醚对牛角瓜悬浊液重复萃取3次后，保留石油醚萃取后的水相。

本发明步骤F中氯仿和丙酮的体积比为4:5；凝胶柱层析时采用的凝胶柱为Sephadex LH-20凝胶柱，凝胶柱层析时洗脱溶剂采用体积百分含量为95%的乙醇；再次硅胶柱层析时采用的洗脱溶剂为体积比为11:1:1 的氯仿、甲醇和丙酮混合溶剂。

上述步骤A、B、C、D、E、F中采用的溶剂如石油醚、氯仿、甲醇、乙醇等均为工业级溶剂，重蒸后使用。

上述D、E、F步骤中使用的硅胶柱、凝胶柱以及反相柱等均为现有技术中的常规设备。

本发明具有如下优点：本发明提供的强心苷化合物12β-hydroxycalotropin具有显著的抗肿瘤活性，可作为治疗肿瘤的先导化合物；同时，本发明提供的提取分离方法简单易行，成本低，效率高，得率高，提取物质量好。

具体实施方式

下面结合具体实例对本发明作进一步阐述，但不限制本发明。

实施例1

A、将牛角瓜(Calotropis gigantea)茎25.4 kg自然风干粉碎后，按牛角瓜样品：乙醇水溶液约为1:2的质量/体积比(kg/L)，将50 L体积分数为95%的乙醇水溶液与25.4 kg牛角瓜样品进行充分混合，密封，于室温浸提3次，每次7天，过滤合并浸提液，减压浓缩至无醇味得到乙醇提取物；

B、在室温下，将乙醇提取物分散于水中制成悬浊液，按乙醇提取液：石油醚=1:3、1:2、1:1的体积比，用石油醚对乙醇提取液重复萃取3次，减压浓缩回收石油醚后，得到石油醚浸膏(254.1 g)；

C、将石油醚萃取后的水液过滤，将过滤液用D-101大孔吸附树脂柱色谱分离，依次用水和甲醇洗脱，收集甲醇洗脱液，减压浓缩回收甲醇后，得到甲醇浸膏(255.7 g)；

D、将甲醇浸膏经减压硅胶柱层析，以氯仿：甲醇=100:1，50:1，25:1，10:1，5:1，2:1，0:100体积比的洗脱剂，进行梯度洗脱，分别得到7个部分Fr.1~Fr.7；

E、将D步骤用氯仿：甲醇=10:1洗脱得到的Fr.4(38.4 g)经硅胶柱层析，用氯仿：甲醇=10:1，8:1，6:1，4:1，2:1体积比的洗脱剂进行梯度洗脱，最后用甲醇洗脱，得到6个部分Fr.4-1~Fr.4-6；

F、将E步骤的Fr.4-2 (16.7 g)经硅胶柱层析，用氯仿：丙酮=4:5体积比的洗脱剂进行洗脱，然后采用TLC薄层色谱收集相同的成分，得到6个部分，在这6个部分中的第3部分，也就是Fr.4-2-3，将Fr.4-2-3 (2.0 g)依次进行Sephadex LH-20凝胶柱层析(体积分数为95%的乙醇洗脱)、反相柱层析、以及硅胶柱层析(氯仿：甲醇：丙酮=11:1:1洗脱)，最终得到强心苷化合物12β-hydroxycalotropin (98.2 mg)。 

实施例2

将实施例1中E步骤的Fr.4-1 (3.2 g) 经柱层析后，用氯仿：甲醇=25:1体积比的洗脱剂进行洗脱，采用TLC薄层色谱收集相同的成分，得到7个部分Fr.4-1-1~Fr.4-1-7；将Fr.4-1-4(869.5 mg) 经硅胶柱层析，依次用氯仿：甲醇=40:1、氯仿：丙酮=6:2体积比的洗脱剂进行洗脱，最终得到强心苷化合物calotropin (109.9 mg)。研究发现，该化合物与本发明的目的化合物结构上的区别在于12位的碳上没有羟基，而本发明的目的化合物12位的碳上有羟基取代。在进一步的体外抗肿瘤活性测试中发现这两个化合物的抗IC₅₀值差异显著(见表2)。

实施例3

强心苷化合物12β-hydroxycalotropin的结构鉴定：

利用光谱技术，包括紫外、红外、核磁共振及高分辨质谱分析，鉴定了实施例1中的强心苷化合物12β-hydroxycalotropin 的结构。运用2D-NMR技术对牛角瓜茎中首次发现的强心苷化合物12β-hydroxycalotropin的¹³C-NMR，¹H-NMR数据进行了归属(见下表1)。

以下为强心苷化合物12β-hydroxycalotropin 的理化常数：

12β-hydroxycalotropin：C₂₉H₄₀O₁₀，白色无定形粉末(甲醇)，10%硫酸乙醇溶液显棕色。m.p. 214-216 °C; [α]_D+6.4° (c = 0.045, MeOH); HR-ESI-MS: m/z [M+Na]⁺ 583.2318 ( calcd. For C₂₉H₄₀O₁₀Cl, 583.2310); IRλ_max (cm^-1): 3433 cm^-1, 2957 cm^-1, 2923 cm^-1, 2852 cm^-1, 1712 cm^-1, 1655 cm^-1, 1648cm^-1, 1638 cm^-1, 1630cm^-1, 1459 cm^-1, 1262 cm^-1, 1105 cm^-1, 1025 cm^-1; UVλ_max nm (MeOH): 218 nm. ¹³C-NMR和¹H-NMR见下表1。

表1 强心苷化合物12β-hydroxycalotropin的碳谱和氢谱数据

实施例4

强心苷化合物12β-hydroxycalotropin 和calotropin体外抗肿瘤活性测试的对比实验： 

采用MTT法测试了强心苷化合物12β-hydroxycalotropin和calotropin，对人胃癌细胞(SGC-7901)、人胃腺癌细胞(KKLS、MKN-28、MKN-45)、人慢性骨髓性白血病细胞(K562)、人口腔表皮癌细胞(KB)、人乳腺癌细胞(MCF7)、人肺癌细胞(NCI-H187)、人骨纤维肉瘤细胞(HT-1080)、人骨肉瘤细胞(G-292)、人骨肉瘤细胞(KHOS/NP)、人前列腺癌细胞(LNCap)等细胞株的体外抗肿瘤活性(结果见表2)。

活性测试方法如下：

实验设阴性对照组（水）、DMSO溶剂对照组、阳性对照组(丝裂霉素C)和8个不同浓度(0.1、0.3、0.9、2.7、 8.1、24.3 μg·mL^-1 )的待测样品，IC₅₀值＜0.1 μg·mL^-1的待测样品继续往下稀释，再设6个不同浓度(0.0003、0.001、0.004、0.011、0.033和0.100μg·mL^-1)，每个浓度设3个平行。收集对数生长期细胞，血球计数板计数，按每孔4500个癌细胞量接种于96孔平底细胞培养板中，置于5% CO₂、湿度90%以上、37℃温箱中培养。24h后取出加入一定量的待测样品，继续培养72 h后取出置于显微镜下观察每孔细胞形态，记录细胞形态变化情况，接着每孔加入5 mg/mL的MTT溶液（溶于平衡盐溶液PBS）15 μL, 37℃反应4 h后，将细胞培养液吸出，每孔加入100 μL DMSO将Formazane充分溶解，将细胞培养板置于MK3酶标仪上，用570 nm波长测各孔的吸光度(A)，按下列公式求生长抑制率。

生长抑制率（%）＝(1 － 

)×100%

以样品浓度为横坐标，以抑制率为纵坐标，根据浓度梯度利用origin软件拟合出抑制率曲线图，当抑制率为50 %时的样品浓度即是细胞毒活性的IC₅₀值，样品活性结果即以半数抑制浓度(IC₅₀)表示。

从表2可看出，强心苷化合物12β-hydroxycalotropin 和calotropin结构上的差异进而抗肿瘤活性上也存在着显著差异。本发明的强心苷化合物抗肿瘤活性明显比calotropin强。

表2强心苷化合物12β-hydroxycalotropin 的体外抑瘤结果

实施例5

将实施例1制备的强心苷化合物 12β-hydroxycalotropin 8g与微晶纤维素75g及硬脂酸镁7g混合，混合物用单冲压片机打成直径5 mm，重量100mg的片剂。本片剂中每片含12β-hydroxycalotropin 8mg。结合病症，每次1-2片，每日服用2-3次。　

实施例6

将实施例1制备的强心苷化合物12β-hydroxycalotropin 20g 与乳糖95g及硬脂酸镁6g混合，以每300mg填充胶囊。本胶囊剂中，每个胶囊含12β-hydroxycalotropin 25mg。结合病症，每次1-2 个，每日服用3-4次。　

以上列举的具体实施例是对本发明进行的说明。需要指出的是，以上实施例只用于对本发明作进一步说明，不代表本发明的保护范围，其他人根据本发明的提示做出的非本质的修改和调整，仍属于本发明的保护范围。

Claims (6)

1.强心苷化合物12β-hydroxycalotropin在制备具有治疗和预防肿瘤作用的药物中的用途，所述强心苷化合物12β-hydroxycalotropin的分子式为C₂₉H₄₀O₁₀，结构式如下：

                                                 

。

2.根据权利要求1所述的强心苷化合物12β-hydroxycalotropin在制备具有治疗和预防肿瘤作用的药物中的用途，其特征是：所述肿瘤为胆管癌、肾癌、胰腺癌、结肠直肠癌、膀胱癌、乳腺癌、子宫癌、卵巢癌、大肠癌、肝癌、胆癌、胆道癌、急性白血病、恶性淋巴瘤、脑瘤、骨肿瘤、黑素瘤、神经胶质瘤、口腔癌、鼻咽癌、肺癌或胃癌。

3.根据权利要求1所述的强心苷化合物12β-hydroxycalotropin在制备具有治疗和预防肿瘤作用的药物中的用途，其特征是：所述强心苷化合物12β-hydroxycalotropin的制备方法如下：

A、选取牛角瓜茎，粉碎后，加入乙醇，浸提3～4次，每次6～8天，合并浸提液，减压浓缩至无醇味得到牛角瓜的乙醇提取物；

B、将牛角瓜的乙醇提取物分散于水中制成牛角瓜悬浊液，分别按牛角瓜悬浊液与石油醚的体积比为1:3、1:2和1:1，用石油醚对牛角瓜悬浊液重复萃取后，保留石油醚萃取后的水相；

C、将石油醚萃取后的水相过滤，将滤液用D-101大孔吸附树脂柱色谱分离，并依次用水和甲醇洗脱，收集甲醇洗脱液，减压浓缩回收甲醇后，得到甲醇浸膏；

D、将甲醇浸膏经减压硅胶柱层析，以氯仿与甲醇的体积比分别为100:1、50:1、25:1、10:1、5:1、2:1和0:100作为洗脱剂，对减压硅胶柱进行梯度洗脱，分别得粗提物Fr.1~Fr.7；

E、将步骤D所得粗提物Fr.4经硅胶柱层析，以氯仿与甲醇的体积比分别为10:1、8:1、6:1、4:1、2:1、0:1作为洗脱剂，对硅胶柱进行梯度洗脱，得到6个部分Fr.4-1~Fr.4-6；

F、将E步骤的Fr.4-2经硅胶柱层析，采用氯仿和丙酮作为洗脱剂进行洗脱，洗脱时采用TLC薄层色谱收集相同的成分，得到6个部分Fr.4-2-1~Fr.4-2-6；将Fr.4-2-3依次进行Sephadex LH-20凝胶柱层析、反相柱层析、以及再次硅胶柱层析，最终得到强心苷化合物12β-hydroxycalotropin。

4.根据权利要求1所述的强心苷化合物12β-hydroxycalotropin在制备具有治疗和预防肿瘤作用的药物中的用途，其特征是：步骤A中牛角瓜茎与乙醇的质量体积比为1kg：1～3L；所述乙醇的体积百分含量为92～98％。

5.根据权利要求1所述的强心苷化合物12β-hydroxycalotropin在制备具有治疗和预防肿瘤作用的药物中的用途，其特征是：步骤B中用石油醚对牛角瓜悬浊液重复萃取3次后，保留石油醚萃取后的水相。

6.根据权利要求1所述的强心苷化合物12β-hydroxycalotropin在制备具有治疗和预防肿瘤作用的药物中的用途，其特征是：步骤F中氯仿和丙酮的体积比为4:5；凝胶柱层析时采用的凝胶柱为Sephadex LH-20凝胶柱，凝胶柱层析时洗脱溶剂采用体积百分含量为95%的乙醇；再次硅胶柱层析时采用的洗脱溶剂为体积比为11:1:1 的氯仿、甲醇和丙酮混合溶剂。