CN104324043B

CN104324043B - 一种强心苷化合物的用途

Info

Publication number: CN104324043B
Application number: CN201410662252.0A
Authority: CN
Inventors: 王茂媛; 晏小霞; 王祝年; 王建荣; 王清隆; 王鹏
Original assignee: Tropical Crops Genetic Resources Institute CATAS
Current assignee: Tropical Crops Genetic Resources Institute CATAS
Priority date: 2013-04-11
Filing date: 2013-04-11
Publication date: 2017-06-23
Anticipated expiration: 2033-04-11
Also published as: CN104324043A

Abstract

本发明公开了强心苷化合物12β‑hydroxycalotropin在制备具有治疗和预防肿瘤作用的药物中的用途，该强心苷化合物12β‑hydroxycalotropin具有显著的抗肿瘤活性，可作为治疗肿瘤的先导化合物；同时，本发明提供的强心苷化合物12β‑hydroxycalotropin的提取分离方法简单易行，成本低，效率和得率高，提取物质量好。

Description

一种强心苷化合物的用途

本申请是“一种强心苷化合物的新用途”的分案申请，原申请的申请日为2013年4月11日，申请号为：201310124216.4。

技术领域

本发明涉及强心苷化合物，具体涉及一种强心苷12β-hydroxycalotropin及其用途。

背景技术

肿瘤对人类健康和生命的威胁很大，它和心血管疾患已成为医学上的两大难关，在全世界构成死亡原因的头两位。全世界52亿人口中，每年约有700万人新患肿瘤，每年约有500多万人死于肿瘤，几乎每6秒钟就有一名肿瘤患者死亡。我国目前每年平均约有150万人新患肿瘤，每年约有80万人死于肿瘤。现有的抗肿瘤药物都不能彻底有效地治愈。同时由于新型肿瘤的不断发现，迫使人们努力寻找新的抗肿瘤药物。长期以来，从药用植物尤其是热带药用植物中寻找抗肿瘤药物成为各国医学、药学、化学及生物学家的一个共同愿望。研究表明，抗肿瘤药物70％来源于热带或亚热带植物。继长春花新碱之后，紫杉醇及其衍生物Epothilones的发现，使此项工作取得了突破性的进展。然而，由于有些抗肿瘤成分在植物体内含量极低，有些植物还是濒危珍稀物种，且植物生长缓慢，过度采挖可能导致该物种的灭绝，这些因素限制了抗肿瘤植物药的发展。

牛角瓜[Calotropis gigantea(L.)Dryand ex Ait.f.]为萝藦科(Asclepiadaceae)牛角瓜属(Calotropis)植物。在我国主要分布于海南、广东、四川和云南等地。牛角瓜全株有毒，其根、茎、叶、花、果及各部位的白色汁液均可药用，具有抗菌、消炎、驱虫、化痰、解毒等功效，是一种民间常用药。国内外研究表明牛角瓜主要含强心苷类化合物，为其毒性成分。但是关于牛角瓜中的强心苷化合物12β-hydroxycalotropin是否具有抗肿瘤作用目前还是未知的。

发明内容

本发明的目的在于提供一种强心苷化合物12β-hydroxycalotropin在制备具有治疗和预防肿瘤作用的药物中的用途。

本申请发明人对牛角瓜中的强心苷类化合物12β-hydroxycalotropin进行了提取、分离、纯化和抗肿瘤活性测试发现，该牛角瓜中的强心苷化合物12β-hydroxycalotropin具有抗肿瘤的新用途。

本发明的上述目的是通过如下技术方案来实现的：强心苷化合物12β-hydroxycalotropin在制备具有治疗和预防肿瘤作用的药物中的用途，所述强心苷化合物12β-hydroxycalotropin的分子式为C₂₉H₄₀O₁₀，结构式如下：

本发明所述肿瘤主要是为胆管癌、肾癌、胰腺癌、结肠直肠癌、膀胱癌、乳腺癌、子宫癌、卵巢癌、大肠癌、肝癌、胆癌、胆道癌、急性白血病、恶性淋巴瘤、脑瘤、骨肿瘤、黑素瘤、神经胶质瘤、口腔癌、鼻咽癌、肺癌或胃癌等。

本发明强心苷化合物12β-hydroxycalotropin可以从牛角瓜中利用包括吸附树脂柱层析、硅胶柱层析、反相硅胶柱层析、凝胶柱层析、减压柱层析等多种分离手段获得，或者通过合成以及半合成手段获得。与适宜的赋形剂相结合，按照常规方法制成各种剂型。

本发明所述强心苷化合物12β-hydroxycalotropin优选的制备方法如下：

A、选取牛角瓜茎，粉碎后，加入乙醇，浸提3～4次，每次6～8天，合并浸提液，减压浓缩至无醇味得到牛角瓜的乙醇提取物；

B、将牛角瓜的乙醇提取物分散于水中制成牛角瓜悬浊液，分别按牛角瓜悬浊液与石油醚的体积比为1:3、1:2和1:1，用石油醚对牛角瓜悬浊液重复萃取后，保留石油醚萃取后的水相；

C、将石油醚萃取后的水相过滤，将滤液用D-101大孔吸附树脂柱色谱分离，并依次用水和甲醇洗脱，收集甲醇洗脱液，减压浓缩回收甲醇后，得到甲醇浸膏；

D、将甲醇浸膏经减压硅胶柱层析，以氯仿与甲醇的体积比分别为100:1、50:1、25:1、10:1、5:1、2:1和0:100作为洗脱剂，对减压硅胶柱进行梯度洗脱，分别得粗提物Fr.1～Fr.7；

E、将步骤D所得粗提物Fr.4经硅胶柱层析，以氯仿与甲醇的体积比分别为10:1、8:1、6:1、4:1、2:1、0:1作为洗脱剂，对硅胶柱进行梯度洗脱，得到6个部分Fr.4-1～Fr.4-6；

F、将E步骤的Fr.4-2经硅胶柱层析，采用氯仿和丙酮作为洗脱剂进行洗脱，洗脱时采用TLC薄层色谱收集相同的成分，得到6个部分Fr.4-2-1～Fr.4-2-6；将Fr.4-2-3依次进行Sephadex LH-20凝胶柱层析、反相柱层析、以及再次硅胶柱层析，最终得到强心苷化合物12β-hydroxycalotropin。

本发明步骤A中牛角瓜茎与乙醇的质量体积比为1kg：1～3L；所述乙醇的体积百分含量为92～98％。

本发明步骤B中用石油醚对牛角瓜悬浊液重复萃取3次后，保留石油醚萃取后的水相。

本发明步骤F中氯仿和丙酮的体积比为4:5；凝胶柱层析时采用的凝胶柱为Sephadex LH-20凝胶柱，凝胶柱层析时洗脱溶剂采用体积百分含量为95％的乙醇；再次硅胶柱层析时采用的洗脱溶剂为体积比为11:1:1的氯仿、甲醇和丙酮混合溶剂。

上述步骤A、B、C、D、E、F中采用的溶剂如石油醚、氯仿、甲醇、乙醇等均为工业级溶剂，重蒸后使用。

上述D、E、F步骤中使用的硅胶柱、凝胶柱以及反相柱等均为现有技术中的常规设备。

本发明具有如下优点：本发明提供的强心苷化合物12β-hydroxycalotropin具有显著的抗肿瘤活性，可作为治疗肿瘤的先导化合物；同时，本发明提供的提取分离方法简单易行，成本低，效率高，得率高，提取物质量好。

具体实施方式

下面结合具体实例对本发明作进一步阐述，但不限制本发明。

实施例1

A、将牛角瓜(Calotropis gigantea)茎25.4kg自然风干粉碎后，按牛角瓜样品：乙醇水溶液约为1:2的质量/体积比(kg/L)，将50L体积分数为95％的乙醇水溶液与25.4kg牛角瓜样品进行充分混合，密封，于室温浸提3次，每次7天，过滤合并浸提液，减压浓缩至无醇味得到乙醇提取物；

B、在室温下，将乙醇提取物分散于水中制成悬浊液，按乙醇提取液：石油醚＝1:3、1:2、1:1的体积比，用石油醚对乙醇提取液重复萃取3次，减压浓缩回收石油醚后，得到石油醚浸膏(254.1g)；

C、将石油醚萃取后的水液过滤，将过滤液用D-101大孔吸附树脂柱色谱分离，依次用水和甲醇洗脱，收集甲醇洗脱液，减压浓缩回收甲醇后，得到甲醇浸膏(255.7g)；

D、将甲醇浸膏经减压硅胶柱层析，以氯仿：甲醇＝100:1，50:1，25:1，10:1，5:1，2:1，0:100体积比的洗脱剂，进行梯度洗脱，分别得到7个部分Fr.1～Fr.7；

E、将D步骤用氯仿：甲醇＝10:1洗脱得到的Fr.4(38.4g)经硅胶柱层析，用氯仿：甲醇＝10:1，8:1，6:1，4:1，2:1体积比的洗脱剂进行梯度洗脱，最后用甲醇洗脱，得到6个部分Fr.4-1～Fr.4-6；

F、将E步骤的Fr.4-2(16.7g)经硅胶柱层析，用氯仿：丙酮＝4:5体积比的洗脱剂进行洗脱，然后采用TLC薄层色谱收集相同的成分，得到6个部分，在这6个部分中的第3部分，也就是Fr.4-2-3，将Fr.4-2-3(2.0g)依次进行Sephadex LH-20凝胶柱层析(体积分数为95％的乙醇洗脱)、反相柱层析、以及硅胶柱层析(氯仿：甲醇：丙酮＝11:1:1洗脱)，最终得到强心苷化合物12β-hydroxycalotropin(98.2mg)。

实施例2

将实施例1中E步骤的Fr.4-1(3.2g)经柱层析后，用氯仿：甲醇＝25:1体积比的洗脱剂进行洗脱，采用TLC薄层色谱收集相同的成分，得到7个部分Fr.4-1-1～Fr.4-1-7；将Fr.4-1-4(869.5mg)经硅胶柱层析，依次用氯仿：甲醇＝40:1、氯仿：丙酮＝6:2体积比的洗脱剂进行洗脱，最终得到强心苷化合物calotropin(109.9mg)。研究发现，该化合物与本发明的目的化合物结构上的区别在于12位的碳上没有羟基，而本发明的目的化合物12位的碳上有羟基取代。在进一步的体外抗肿瘤活性测试中发现这两个化合物的抗IC50值差异显著(见表2)。

实施例3

强心苷化合物12β-hydroxycalotropin的结构鉴定：

利用光谱技术，包括紫外、红外、核磁共振及高分辨质谱分析，鉴定了实施例1中的强心苷化合物12β-hydroxycalotropin的结构。运用2D-NMR技术对牛角瓜茎中首次发现的强心苷化合物12β-hydroxycalotropin的¹³C-NMR，¹H-NMR数据进行了归属(见下表1)。

以下为强心苷化合物12β-hydroxycalotropin的理化常数：

12β-hydroxycalotropin：C₂₉H₄₀O₁₀，白色无定形粉末(甲醇)，10％硫酸乙醇溶液显棕色。m.p.214-216℃；[α]D+6.4°(c＝0.045,MeOH)；HR-ESI-MS:m/z[M+Na]⁺583.2318(calcd.For C₂₉H₄₀O₁₀Cl,583.2310)；IRλ_max(cm^-1):3433cm^-1,2957cm^-1,2923cm^-1,2852cm^-1,1712cm^-1,1655cm^-1,1648cm^-1,1638cm^-1,1630cm^-1,1459cm^-1,1262cm^-1,1105cm^-1,1025cm^-1；UVλ_max nm(MeOH):218nm.¹³C-NMR和¹H-NMR见下表1。

表1 强心苷化合物12β-hydroxycalotropin的碳谱和氢谱数据

实施例4

强心苷化合物12β-hydroxycalotropin和calotropin体外抗肿瘤活性测试的对比实验：

采用MTT法测试了强心苷化合物12β-hydroxycalotropin和calotropin，对人胃癌细胞(SGC-7901)、人胃腺癌细胞(KKLS、MKN-28、MKN-45)、人慢性骨髓性白血病细胞(K562)、人口腔表皮癌细胞(KB)、人乳腺癌细胞(MCF7)、人肺癌细胞(NCI-H187)、人骨纤维肉瘤细胞(HT-1080)、人骨肉瘤细胞(G-292)、人骨肉瘤细胞(KHOS/NP)、人前列腺癌细胞(LNCap)等细胞株的体外抗肿瘤活性(结果见表2)。

活性测试方法如下：

实验设阴性对照组(水)、DMSO溶剂对照组、阳性对照组(丝裂霉素C)和8个不同浓度(0.1、0.3、0.9、2.7、8.1、24.3μg·mL^-1)的待测样品，IC₅₀值＜0.1μg·mL^-1的待测样品继续往下稀释，再设6个不同浓度(0.0003、0.001、0.004、0.011、0.033和0.100μg·mL^-1)，每个浓度设3个平行。收集对数生长期细胞，血球计数板计数，按每孔4500个癌细胞量接种于96孔平底细胞培养板中，置于5％CO₂、湿度90％以上、37℃温箱中培养。24h后取出加入一定量的待测样品，继续培养72h后取出置于显微镜下观察每孔细胞形态，记录细胞形态变化情况，接着每孔加入5mg/mL的MTT溶液(溶于平衡盐溶液PBS)15μL,37℃反应4h后，将细胞培养液吸出，每孔加入100μL DMSO将Formazane充分溶解，将细胞培养板置于MK3酶标仪上，用570nm波长测各孔的吸光度(A)，按下列公式求生长抑制率。

以样品浓度为横坐标，以抑制率为纵坐标，根据浓度梯度利用origin软件拟合出抑制率曲线图，当抑制率为50％时的样品浓度即是细胞毒活性的IC₅₀值，样品活性结果即以半数抑制浓度(IC₅₀)表示。

从表2可看出，强心苷化合物12β-hydroxycalotropin和calotropin结构上的差异进而抗肿瘤活性上也存在着显著差异。本发明的强心苷化合物抗肿瘤活性明显比calotropin强。

表2 强心苷化合物12β-hydroxycalotropin的体外抑瘤结果

实施例5

将实施例1制备的强心苷化合物12β-hydroxycalotropin 8g与微晶纤维素75g及硬脂酸镁7g混合，混合物用单冲压片机打成直径5mm，重量100mg的片剂。本片剂中每片含12β-hydroxycalotropin 8mg。结合病症，每次1-2片，每日服用2-3次。

实施例6

将实施例1制备的强心苷化合物12β-hydroxycalotropin 20g与乳糖95g及硬脂酸镁6g混合，以每300mg填充胶囊。本胶囊剂中，每个胶囊含12β-hydroxycalotropin 25mg。结合病症，每次1-2个，每日服用3-4次。

以上列举的具体实施例是对本发明进行的说明。需要指出的是，以上实施例只用于对本发明作进一步说明，不代表本发明的保护范围，其他人根据本发明的提示做出的非本质的修改和调整，仍属于本发明的保护范围。

Claims

1.强心苷化合物12β-hydroxycalotropin作为唯一具有治疗和预防肿瘤作用的活性成分在制备具有治疗和预防肿瘤作用的药物中的用途，所述强心苷化合物12β-hydroxycalotropin的分子式为C₂₉H₄₀O₁₀，结构式如下：

所述的肿瘤为乳腺癌、骨肿瘤或人慢性髓原白血病细胞K562。

2.根据权利要求1所述的强心苷化合物12β-hydroxycalotropin作为唯一具有治疗和预防肿瘤作用的活性成分在制备具有治疗和预防肿瘤作用的药物中的用途，其特征是：所述强心苷化合物12β-hydroxycalotropin的制备方法如下：

3.根据权利要求2所述的强心苷化合物12β-hydroxycalotropin作为唯一具有治疗和预防肿瘤作用的活性成分在制备具有治疗和预防肿瘤作用的药物中的用途，其特征是：步骤A中牛角瓜茎与乙醇的质量体积比为1kg：1～3L；所述乙醇的体积百分含量为92～98％。

4.根据权利要求2所述的强心苷化合物12β-hydroxycalotropin作为唯一具有治疗和预防肿瘤作用的活性成分在制备具有治疗和预防肿瘤作用的药物中的用途，其特征是：步骤B中用石油醚对牛角瓜悬浊液重复萃取3次后，保留石油醚萃取后的水相。

5.根据权利要求2所述的强心苷化合物12β-hydroxycalotropin作为唯一具有治疗和预防肿瘤作用的活性成分在制备具有治疗和预防肿瘤作用的药物中的用途，其特征是：步骤F中氯仿和丙酮的体积比为4:5；凝胶柱层析时采用的凝胶柱为Sephadex LH-20凝胶柱，凝胶柱层析时洗脱溶剂采用体积百分含量为95％的乙醇；再次硅胶柱层析时采用的洗脱溶剂为体积比为11:1:1的氯仿、甲醇和丙酮混合溶剂。