CN115611844B - 一种从关苍术中分离得到的化合物的制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于一种医药技术领域，涉及从关苍术中提取分离得到一种新的具有体外抗肿瘤活性的萜类化合物制备方法及应用，其分子式为C30H44O3，分子量为452。本发明方法以关苍术为原料，经过乙醇冷浸提取，采用大孔树脂富集纯化、正相硅胶柱色谱及葡聚糖凝胶柱色谱分离等方法分离纯化而得到。通过MTT实验结果表明，该化合物对胃癌和肝癌均有较好的抑制作用。本发明旨在充分合理利用东北地区丰富的关苍术野生资源，扩大其药用来源，提高综合开发利用价值。
Description
技术领域
本发明涉及医药技术领域，具体涉及一种具有癌细胞抑制作用的化合物的制备方法和在制备治疗癌症药物方面的应用。
背景技术
关苍术(学名:Atractylodes japonica Koidz.ex Kitam.)是菊科苍术属多年生草本植物，主要以根茎入药。该药生长在海拔200-800米的野生林缘及林下。主要分布于我国东北地区(黑龙江、吉林与辽宁省)，日本、朝鲜等国家也有发现。关苍术味辛苦，性温无毒，主要具有健脾燥湿、发汗解表明目、祛风、避秽的功效，用于脘腹胀满，食欲不振，风湿性关节炎，头痛，水肿无汗等症。据报道其化学成分和药理功效方面与二级濒危中药材苍术具有相似性，常被作为其替代品使用，《中华本草》曾记载关苍术也为苍术的来源之一。
目前研究发现关苍术中主要含有倍半萜及其苷类、烯炔类等化学成分，但深入系统的化学研究较少。本发明所涉及从关苍术中提取分离得到的一种萜烯醛类化合物，并通过体外抗肿瘤活性筛选发现具有较显著的活性，为进一步开发新型抗肿瘤药物提供了物质来源；同时对充分利用东北地区丰富的关苍术野生资源，解决苍术目前紧缺现状，扩大其药用价值等方面具有重要意义。
发明内容
本发明的目的在于合理充分利用东北地区丰富的关苍术野生资源，扩大肿瘤药物的来源，提供一种具有肿瘤细胞抑制作用的化合物。
为了达成上述目的，本发明提供了一种萜类化合物，分子式为C30H44O3，命名为关苍术萜烯醛A，其化学结构式如下：
本发明还提供了该萜类化合物的制备方法：依次通过醇提、大孔树脂富集纯化、正相硅胶/葡聚糖凝胶柱色谱及重结晶纯化得到。具体制备步骤如下：
(1)乙醇冷浸提取：取10kg关苍术低温干燥，适当粉碎，然后加入95％乙醇，所加入的95％乙醇体积为药材的8倍，重复提取3次，每次7d，合并提取液，减压浓缩，得到乙醇粗提物浸膏；
(2)大孔树脂富集纯化：将步骤(1)所得乙醇粗提物浸膏用水分散形成混悬液，经D101型大孔树脂柱色谱富集纯化，用水、50％、95％乙醇进行梯度洗脱，收集各梯度洗脱液，减压回收溶剂分别得到各浓度乙醇洗脱部位浸膏；
(3)正相硅胶柱色谱分离：取步骤(2)所得95％乙醇洗脱部位浸膏，进行正相硅胶柱色谱分离。采用体积比30:1和15:1的二氯甲烷-甲醇混合溶剂进行依次洗脱，体积比30:1的二氯甲烷-甲醇混合溶剂洗脱3.5个柱体积，体积比15:1的二氯甲烷-甲醇混合溶剂洗脱5个柱体积，将比例15:1的二氯甲烷-甲醇混合溶剂洗脱部分减压回收，得到分离产物；
(4)葡聚糖凝胶柱色谱分离：将取步骤(3)所得到的分离产物，通过葡聚糖凝胶柱，以体积比为2:1的甲醇-水为流动相进行梯度洗脱，收集洗脱液，回收溶剂，得粗品。
(5)重结晶处理：将(4)所得分离产物采用甲醇重结晶两次，即可得到该化合物纯品。
本发明还提供了关苍术萜烯醛A在体外抗肿瘤活性方面的初步测试和评价，所选肿瘤细胞系包括人胃癌细胞(BGC-803)和人肝癌细胞(HepG-2)。结果表明，本发明提供的萜类化合物具有较显著的抗胃癌、肝癌作用。因此，本发明提供的化合物可在开发抗肿瘤药物方面应用。
本发明的优点在于，本发明以关苍术为原料，容易大量获得，因其与我国珍贵濒危中药材苍术功效相似，可替代和补充苍术在临床的使用；另外从关苍术中分离得到一种萜类化合物具有比较显著的抗肿瘤活性，便于对其进一步开展深入的药理和临床研究，为开发疗效佳、毒副作用小的新型抗肿瘤药物提供了物质基础条件。
附图说明
图1为本发明化合物的化学结构式；
图2为本发明化合物的正性HR-ESI-MS谱图；
图3为本发明化合物的1H-NMR谱图；
图4为本发明化合物的13C-NMR谱图；
图5为本发明化合物的DEPT谱图；
图6为本发明化合物的HSQC谱图；
图7为本发明化合物的HMBC谱图；
图8为本发明化合物的1H-1H COSY谱图；
图9为本发明化合物的HMBC谱和1H-1H COSY谱主要相关关系图
具体实施方式
根据本发明所公开的技术内容，本领域技术人员很清楚本发明的其他实施方案，下述实施方案仅作为范例，本发明不限于本实施例。对于该领域研究人员，任何对本发明进行的同等修改以及替代均属于本发明的范畴。下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。
实施例1：关苍术萜烯醛A的制备方法
本发明所述关苍术中一种萜类化合物关苍术萜烯醛A的制备方法，包括以下具体步骤：
(1)乙醇冷浸提取：取10kg关苍术低温干燥，适当粉碎，然后加入95％乙醇，所加入的95％乙醇体积为药材的8倍，重复提取3次，每次7d，合并提取液，减压浓缩，得到乙醇粗提物浸膏1.05kg。
(2)大孔树脂富集纯化：将步骤(1)所得乙醇粗提物浸膏用水分散形成混悬液，混悬液体积与原有乙醇浸膏体积比为5:1，用D101型大孔树脂柱色谱富集纯化，用水、50％、95％乙醇进行梯度洗脱，收集各梯度洗脱液，减压回收溶剂分别得到水、50％、95％乙醇洗脱部位浸膏各218g、156g、192g。
(3)正相硅胶柱色谱分离：取80～100目拌样硅胶与步骤(2)所得95％乙醇洗脱部位浸膏以质量比为3:1搅拌均匀，然后置于水浴锅蒸干溶剂；用200～300目的柱层析硅胶作为装柱硅胶，装柱硅胶为95％乙醇洗脱部位浸膏质量的30倍，用体积比30:1和15:1的二氯甲烷-甲醇混合溶剂进行依次洗脱，其中30:1的二氯甲烷-甲醇混合溶剂洗脱3.5个柱体积，15:1的二氯甲烷-甲醇混合溶剂洗脱5个柱体积，将比例15:1的二氯甲烷-甲醇混合溶剂洗脱部分全部收集并减压回收溶剂后，得到分离产物6.82g
(4)葡聚糖凝胶柱色谱分离：将取步骤(3)所得到的分离产物，通过葡聚糖凝胶柱，以体积比为2:1的甲醇-水为流动相进行梯度洗脱，洗脱5.5个柱体，弃去前2个柱体积洗脱液，收集后3.5个柱体积洗脱液，回收溶剂，得粗品0.12g。
(5)重结晶处理：将(4)所得分离产物采用甲醇重结晶两次，即可得到该化合物纯品25.6mg，纯度为98.2％。
实施例2：关苍术萜烯醛A的结构鉴定
本发明化合物关苍术烯醛A的结构通过以下方法进行鉴定；淡黄色油状物，溶于二氯甲烷。在HR-ESI-MS中，m/z 475.3178处可见[M+Na]+离子峰，表明该萜类化合物的分子量为452。结合1H-NMR、13C-NMR及DEPT谱等推测该萜类化合物的分子式为C30H44O3，计算其不饱和度为9，具体波谱数据见表1。
表1本发明化合物1D，2D-NMR数据表
实施例3：关苍术萜烯醛A的抗肿瘤活性测试
(1)材料和方法
对实施例1中制备得到的化合物进行了体外抗肿瘤试验，试验所采用的细胞为人胃癌BGC-803细胞株和人肝癌HepG2细胞，上述瘤株均购自赛尔试剂公司，采用CKK8法进行细胞毒体外活性实验。
具体实施实施实施方法如下：
将处于对数生长期状态良好的人胃癌MGC-803细胞和人肝癌HepG2细胞以(1-3)×104个细胞/mL的密度接种于96孔板中，每个孔内100μL。将上述肿瘤细胞用含10％胎牛血清和1％的青霉素-链霉素的DMEM培养基在37℃、5％ CO2恒温培养箱中培养，使其贴壁24h后，空白组和对照组给予不完全培养基，受试药物组加入用培养液稀释成不同浓度的待测化合物(即为本发明中申请的实施例1所制备的关苍术萜烯醛A)100μL，浓度分别为5μM、10μM、20μM、40μM、80μM、160μM。继续培养48h后，向每个孔中加入10μL的CCK8试剂，并放置在37℃、5％CO2恒温培养箱中孵育1 h，在酶标仪在450 nm处测量每个孔的吸光度(OD)值，重复3次实验，取平均值。使用Logit法计算药物的IC50值。结果如下表2所示：
表2本发明化合物对两种肿瘤细胞株MGC-803、HepG2的抑制作用
(2)结果
经线性回归计算IC50值，结果显示本发明化合物对人胃癌MGC-803细胞作用IC50值是43.26±2.05μM(阳性对照药阿霉素IC50值是5.82±1.03μM)；人肝癌HepG2细胞作用IC50值是33.12±1.11μM(阳性对照药阿霉素IC50值是1.06±0.46μM)。
综上所述，本发明所述的从关苍术中分离得到的化合物关苍术萜烯醛A具有制备临床肿瘤预防和治疗药物的开发前景。
Claims (1)
1. 本发明所述萜类化合物关苍术萜烯醛 A的制备方法，其特征在于，以关苍术为原料，依次通过乙醇冷浸提取、大孔树脂富集纯化、正相硅胶/葡聚糖凝胶柱色谱及重结晶纯化得到，其特征在于，通过以下具体步骤制备：
（1）乙醇冷浸提取：取10 kg关苍术低温干燥，适当粉碎，然后加入95%乙醇，所加入的95%乙醇体积为药材的8倍，重复提取3次，每次7 d，合并提取液，减压浓缩，得到乙醇粗提物浸膏；
（2）大孔树脂富集纯化：将步骤（1）所得乙醇粗提物浸膏用水分散形成混悬液，经D101型大孔树脂柱色谱富集纯化，用水、50%、95%乙醇进行梯度洗脱，收集各梯度洗脱液，减压回收溶剂分别得各浓度乙醇洗脱部位浸膏；
（3）正相硅胶柱色谱分离：取步骤（2）所得95%乙醇洗脱部位浸膏，进行正相硅胶柱色谱分离，采用体积比30:1和15:1的二氯甲烷-甲醇混合溶剂进行依次洗脱，体积比30:1的二氯甲烷-甲醇混合溶剂洗脱3.5个柱体积，体积比15:1的二氯甲烷-甲醇混合溶剂洗脱5个柱体积，将比例15:1的二氯甲烷-甲醇混合溶剂洗脱部分减压回收，得到分离产物；
（4）葡聚糖凝胶柱色谱分离：将取步骤（3）所得到的分离产物，通过葡聚糖凝胶柱，以体积比为2:1的甲醇-水为流动相进行梯度洗脱，收集洗脱液，回收溶剂，得粗品；
（5）重结晶处理：将（4）所得分离产物采用甲醇重结晶两次，即可得到该化合物纯品；
该化合物命名为关苍术萜烯醛 A，其特征在于，其结构式如式（I）所示：
。
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| 陈芬儿.《基础药物设计学》.武汉：华中理工大学出版社,1995,第181页. * |
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