CN101445499A - 一种二萜类抗肿瘤化合物及其制备方法 - Google Patents

一种二萜类抗肿瘤化合物及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及医药技术领域，具体为从中国海绵中分离得到的一个具有抗肿瘤活性的二萜类化合物(7R)－2－甲氧基－5，7－二甲基－7－[(1S，3E)－1－乙基－3－己烯]－1－氧代－2，5－二烯－4－庚酮，结构式如上，体外抗肿瘤试验表明，该化合物对HepG2人肝癌细胞和Bcap－37人结肠癌细胞等4种肿瘤细胞株有明显的抑制作用。本发明可为研制新的抗肿瘤药物提供先导化合物，对开发利用中国的海洋药用资源具有重要价值。

Description

一种二萜类抗肿瘤化合物及其制备方法
技术领域
本发明涉及医药技术领域，是一种从海洋动物海绵中分离得到的二萜类抗肿瘤化合物C19H30O3及其制备方法。
背景技术
海绵是一种海洋动物，其生活环境具有低温，高压，高盐等特点。本申请人曾从细薄星海绵中分离到几种具有抗肿瘤活性的三萜类化合物并已申请专利(申请号：200710042653.6)。但至今未见从海绵中分离到具有抗肿瘤活性的二萜类化合物C19H30O3的报道。
发明内容
本发明提供一种从生长于我国西沙海域的海绵中提取分离到的二萜类抗肿瘤化合物(7R)-2-甲氧基-5，7-二甲基-7-[(1S，3E)-1-乙基-3-己烯]-1-氧代-2，5-二烯-4-庚酮，分子式为C19H30O3，其化学结构式为：
Figure A200810207634D00041
本发明化合物的制备方法如下：
1.制备总浸膏；
按常规将新鲜的海绵用丙酮和甲醇以1:0～0:1比例混合的混合溶液分次进行超声提取或渗漉提取，至提取液无色，合并提取液，减压回收丙酮和/或甲醇后，加入乙酸乙酯萃取，减压回收乙酸乙酯，得总浸膏；
2.纯化：
将总浸膏溶于85％～95％甲醇，用石油醚萃取，弃去石油醚层；调整甲醇浓度至60％～70％，用二氯甲烷萃取，回收二氯甲烷，将所得的浸膏浓缩至干；用体积比为1：1的二氯甲烷/甲醇或者体积比为4：5：1的正己烷/二氯甲烷/甲醇混合溶剂将浸膏溶解，过Sephandex LH20凝胶柱，用体积比为1：1的二氯甲烷/甲醇或者4：5：1的正己烷/二氯甲烷/甲醇混合溶剂洗脱，根据薄层色谱的监测，收集含有化合物C19H30O3的流分，回收溶剂浓缩至干；过200～400目的正相硅胶柱，以体积比为1：0～0：1石油醚/乙酸乙酯混合溶剂梯度洗脱，根据薄层色谱的监测，收集含C19H30O3的流分，再过ODS反相柱，以体积比为1：1～0：1的甲醇/水混合溶剂梯度洗脱，根据薄层色谱的监测，收集含有化合物C19H30O3的流分；再经反相高效液相色谱分离，以甲醇：水的体积比为7：3～8.5：1.5的混合溶剂进行洗脱，根据薄层色谱的监测，收集含有C19H30O3的流分并减压浓缩，得纯化合物C19H30O3。
本发明化合物C19H30O3为无色液体，在电喷雾离子质谱(ESI-MS)中出现329[M+Na]+，330[M++Na+H]+和635[2M+Na]+准分子离子峰；紫外光谱λmax(MeOH)＝287.6nm，1H和13C核磁共振数据见表1，从而确定了它的化学结构。
表1.C19H30O3的1H和13C核磁共振数据表
Figure A200810207634D00061
本发明使用上海天甲生物有限公司提供的肿瘤细胞株HepG2(人肝癌细胞株)，Bcap-37(人结肠癌细胞株)，H460(人肺癌细胞株)，HT-29(人结肠癌细胞株)，对化合物C19H30O3进行体外抗肿瘤试验，表明其具有明显的抑制肿瘤的活性，因此本发明化合物可以用于制备抗肿瘤药物。
具体实施方式
现结合实施例，对本发明作详细描述，但保护范围不局限于如下实施例。
实施例1  从海绵中制备化合物C19H30O3
选择生长于中国海南西沙海域的海绵1500克，洗净，剪碎，分别用1000毫升的甲醇超声提取三次，直至提取液为无色，合并提取液，减压回收甲醇；加入乙酸乙酯萃取三次，每次1000毫升，合并萃取液，减压回收乙酸乙酯，得总浸膏；将总浸膏溶于1000毫升90％甲醇，用石油醚萃取三次，每次1000毫升，弃去石油醚层，调整甲醇浓度至60％；用二氯甲烷萃取三次，每次1000毫升，合并萃取液，回收二氯甲烷，将所得的浸膏浓缩至干；加入体积比1：1的二氯甲烷/甲醇混合溶剂5毫升溶解，过Sephadex LH20凝胶柱，用流动相体积比为1：1的二氯甲烷/甲醇混合溶剂洗脱，根据薄层色谱监测，收集含C19H30O3流分，以真空减压旋转蒸发仪回收溶剂浓缩至干，得到浸膏10克；将浸膏过200目正相硅胶柱进行色谱分离，以石油醚：丙酮的体积比为50：1～5：1的混合溶剂进行梯度洗脱，根据薄层色谱监测，收集含C19H30O3的流分，再经反相高效液相色谱进行分离，以甲醇：水体积比为80：20的混合溶剂进行洗脱，根据薄层色谱监测，收集含C19H30O3的流分。以真空减压旋转蒸发仪浓缩后，得纯化合物C19H30O3 16.0毫克。
实施例2  从海绵中制备化合物C19H30O3
选择生长于中国海南西沙海域的海绵1500克，洗净，剪碎，用1000毫升的丙酮超声提取三次，直至提取液为无色，合并提取液，减压回收甲醇；加入二氯甲烷萃取三次，每次1000毫升，合并萃取液，减压回收二氯甲烷，得总浸膏；将总浸膏溶于1000毫升95％甲醇，用石油醚萃取三次，每次1000毫升，弃去石油醚层，调整甲醇浓度至65％；用二氯甲烷萃取三次，每次1000毫升，合并萃取液，回收二氯甲烷，将所得的浸膏浓缩至干；加入体积比4：5：1的正己烷/二氯甲烷/甲醇混合溶剂5毫升溶解，过Sephadex LH20凝胶柱，用流动相体积比为4：5：1的正己烷/二氯甲烷/甲醇混合溶剂洗脱，收集含化合物C19H30O3的流分，以真空减压旋转蒸发仪回收溶剂浓缩至干，得到浸膏9克，将浸膏过300目正相硅胶柱进行色谱分离，以石油醚：丙酮的体积比为50：1～5：1的混合溶剂进行梯度洗脱，根据薄层色谱监测，收集含C19H30O3的流分，再经反相高效液相色谱进行分离，以甲醇：水体积比为77：23的混合溶剂进行洗脱，根据薄层色谱监测，收集含C19H30O3的流分。以真空减压旋转蒸发仪浓缩后，得纯化合物C19H30O3 15.3毫克。
实施例3  从海绵中制备化合物C19H30O3
选择生长于中国海南西沙海域的海绵1500克，洗净，剪碎，用95％乙醇渗漉提取，直至提取液为无色，将提取液减压回收乙醇；加入乙酸乙酯萃取三次，每次1000毫升，合并萃取液，减压回收乙酸乙酯，得总浸膏；将总浸膏溶于1000毫升95％甲醇，用石油醚萃取三次，每次1000毫升，弃去石油醚层，调整甲醇浓度至65％；用二氯甲烷萃取三次，每次1000毫升，回收二氯甲烷，将所得的浸膏浓缩至干；加入体积比4：5：1的正己烷/二氯甲烷/甲醇混合溶剂5毫升溶解，过Sephadex LH20凝胶柱，用流动相体积比为4：5：1的正己烷/二氯甲烷/甲醇混合溶剂洗脱，根据薄层色谱监测，收集含化合物C19H30O3的流分，以真空减压旋转蒸发仪回收溶剂浓缩至干，得到浸膏9克；将浸膏过400目正相硅胶柱进行色谱分离，以石油醚：乙酸乙酯的体积比为50：1～5：1的混合溶剂进行梯度洗脱，根据薄层色谱监测，收集含C19H30O3的流分；再经反相高效液相色谱进行分离，以甲醇：水体积比为75：25的混合溶剂进行洗脱，根据薄层色谱监测，收集含C19H30O3的流分；以真空减压旋转蒸发仪浓缩得纯化合物C19H30O3 15.0毫克。
体外抗肿瘤活性实验：
本发明对化合物C19H30O3进行了体外抗肿瘤实验，实验使用的肿瘤细胞株为上海天甲生物有限公司提供的HepG2(人肝癌细胞株)、Bcap-37(人结肠癌细胞株)、H460(人肺癌细胞株)和HT-29(人结肠癌细胞株)。实验结果表明化合物C19H30O3具有明显的抑制肿瘤的活性，因此可以用于制备抗肿瘤药物。
实验方法采用四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法，台盼兰染色法(详见Monks，A；Scudiero，D，；Skehan，P.etal.J.Natl.Cancer.Inst.1991，83，757-66)。实验分3组：空白对照组、阳性对照组和本发明化合物C19H30O3组。阳性对照药为长春新碱。将本发明化合物和阳性对照药分别用DMSO溶解，配成100，50，25，12.5，6.25，3.125(微克/毫升)6种浓度，细胞先按常规以10％的小牛血清培养，传代时贴壁细胞以0.2％的胰酶消化液消化。使细胞处于对数生长期，实验时细胞接种于96孔培养板，每孔接种180微升，浓度为5×104个/毫升的细胞悬液。于37℃的CO2培养箱预培养过夜。预培养后，每孔加20微升药物溶液，空白对照组加20微升DMSO，每种浓度重复5孔。药物作用细胞3天后进行MTT法测定，于96孔培养板每孔加入浓度为5毫克/毫升的MTT工作液10微升，37℃孵育4小时，弃上清液，加100微升DMSO，在570纳米波长下用酶标仪测定OD值。台盼兰排染法，加入台盼兰工作液，计数活细胞。按下列公式计算被测物对癌细胞生长的抑制率：
Figure A200810207634D00101
半数有效抑制浓度IC50值采用Logit法计算。实验结果见表2
表2.C19H30O3对肿瘤细胞的半数有效抑制浓度(μg/ml)
Figure A200810207634D00102
上述实验结果表明：化合物C19H30O3对四种不同的肿瘤细胞株均显示明显抑制作用，因此可以用于制备抗肿瘤药物。本发明为研制新的抗肿瘤药物提供了新的先导化合物，为开发利中国的海洋药用生物资源具有重要意义。

Claims (4)

1.一种二萜类抗肿瘤化合物，化学结构式如下：
Figure A200810207634C00021
2.权利要求1所述抗肿瘤化合物的制备方法，步骤如下：
1)提取总浸膏：
将新鲜的海绵用丙酮和甲醇以体积比为1：0～0：1混合溶剂分次进行超声提取或渗漉提取，至提取液无色，合并提取液，减压回收丙酮和/或甲醇，加入乙酸乙酯萃取，减压回收乙酸乙酯，得总浸膏；
2)纯化
将总浸膏溶于85％～95％甲醇，用石油醚萃取，弃去石油醚层；调整甲醇浓度至60％～70％，用二氯甲烷萃取，回收二氯甲烷，将所得的浸膏浓缩至干；用体积比为1：1的二氯甲烷/甲醇或者体积比为4：5：1的正己烷/二氯甲烷/甲醇混合溶剂将浸膏溶解，过Sephandex LH20凝胶柱，用体积比为1：1的二氯甲烷/甲醇或者4：5：1的正己烷/二氯甲烷/甲醇混合溶剂洗脱，根据薄层色谱的监测，收集含有化合物C19H30O3的流分，回收溶剂浓缩至干；过200～400目的正相硅胶柱，以体积比为1：0～0：1石油醚/乙酸乙酯混合溶剂梯度洗脱，根据薄层色谱的监测，收集含C19H30O3的流分，再过ODS反相柱，以体积比为1：1～0：1的甲醇/水混合溶剂梯度洗脱，根据薄层色谱的监测，收集含有化合物C19H30O3的流分；再经反相高效液相色谱分离，以甲醇：水的体积比为7：3～8.5：1.5的混合溶剂进行洗脱，根据薄层色谱的监测，收集含有C19H30O3的流分并减压浓缩，得纯二萜类化合物C19H30O3。
3.按权利要求2所述的制备方法，其特征在于，提取总浸膏时，新鲜海绵用丙酮或甲醇分3次提取；纯化时，总浸膏溶于90％甲醇，再用石油醚萃取，弃去石油醚层，调整甲醇浓度至60％，用二氯甲烷萃取，回收二氯甲烷，将所得的浸膏浓缩至干；过正相硅胶柱时，所用的是300目正相硅胶柱。
4.权利要求1所述化合物在制备抗肿瘤药物中的应用。
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