CN111333606B - 降碳倍半萜类化合物、制备方法及作为抗肿瘤药物的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种降碳倍半萜类化合物，结构式如下：
Figure 100004_DEST_PATH_IMAGE001
本发明的降碳倍半萜类化合物是从中药吴茱萸中提取制备而成，对人肝癌细胞（Hepg‑2）、人乳腺癌细胞（MCF‑7）、人肺癌细胞（A549）、人肾癌细胞（A498）和人骨髓神经母细胞瘤细胞（SHSY‑5Y）细胞的增殖具有抑制作用，可应用于制备抗肿瘤药物。

Description

降碳倍半萜类化合物、制备方法及作为抗肿瘤药物的应用
技术领域
本发明涉及一种倍半萜类化合物，尤其是一种降碳倍半萜类化合物、制备方法及作为抗肿瘤药物的应用。
背景技术
中药吴茱萸为芸香科(Rutaceae)吴茱萸属(Tetradium)植物吴茱萸 Evodia rutaecarpa (Juss.) Benth.、石虎 Evodia rutaecarpa (Juss.) Benth. var.officinalis (Dode) Huang 或疏毛吴茱萸 Evodia rutaecarpa (Juss.) Benth. var.bodinieri (Dode) Huang的干燥近成熟果实。根据《神农本草经》记载，吴茱萸具有味苦、辛温、有小毒等特性，归肝、脾、胃、肾经，具有助阳止泻、温中止痛、降逆止呕、散寒止痛等功，临床上常用于寒凝疼痛、胃寒呕吐、虚寒泄泻等症状的治疗。目前，虽然已有以吴茱萸为原料提取抗肿瘤活性成份的相关报道，但是并未有其抗肿瘤活性成份为降碳倍半萜类化合物的记载。
发明内容
本发明是为了解决现有技术所存在的上述技术问题，提供一种降碳倍半萜类化合物、制备方法及作为抗肿瘤药物的应用。
本发明的技术解决方案是：一种降碳倍半萜类化合物，结构式如下：
Figure 920888DEST_PATH_IMAGE001
。
一种上述降碳倍半萜类化合物的制备方法，按照如下步骤进行：
a. 将吴茱萸近成熟果实粉碎，用质量浓度70%的乙醇加热回流提取三次，合并提取液，减压浓缩并回收乙醇，得吴茱萸浸膏；将吴茱萸浸膏用水分散，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇多次等体积萃取，分别减压浓缩得石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物及正丁醇萃取物；
b. 将乙酸乙酯萃取物进行硅胶柱层析，采用石油醚-乙酸乙酯按50:1，30:1，20:1，10:1，5:1，2:1，1:1，1:2梯度洗脱；
c. 合并石油醚-乙酸乙酯20:1至5:1洗脱流份；
d. 将所得洗脱流分经硅胶柱层析，用石油醚-乙酸乙酯按50:1，30:1，20:1，10:1，5:1，2:1，1:1，1:2梯度洗脱，每个梯度收集3个洗脱流份，每个洗脱流份为1 L，将依次得到的24个洗脱流分分别记为N1~N24；
e. 将洗脱流份N6经反相ODS中压柱色谱分离，以甲醇-水梯度洗脱，流速15ml/min，洗脱6h，得到13个洗脱流份，每个洗脱流份为420 ml，将依次得到的13个洗脱流份分别记为N6-1~ N6-13；
f. 将洗脱流份N6-5经反相半制备C18色谱柱HPLC分离，甲醇：水=7：3，流速3.0 ml/min，得到单体化合物，即降碳倍半萜类化合物。
所述降碳倍半萜类化合物作为抗肿瘤药物的应用。
所述降碳倍半萜类化合物作为抗肝癌、抗乳腺癌、抗肺癌、抗肾癌或抗骨髓神经母细胞瘤药物的应用。
本发明的降碳倍半萜类化合物是从中药吴茱萸中提取制备而成，对人肝癌细胞（Hepg-2）、人乳腺癌细胞（MCF-7）、人肺癌细胞（A549）、人肾癌细胞（A498）和人骨髓神经母细胞瘤细胞（SHSY-5Y）细胞的增殖具有抑制作用，可应用于制备抗肿瘤药物。
附图说明
图1是本发明实施例化合物1的HRESIMS谱图。
图2是本发明实施例化合物1的关键1H-1H COSY 和 HMBC相关图。
图3是本发明实施例化合物1的实验CD与计算ECD图。
图4是本发明实施例化合物1的X-射线单晶衍射图。
图5是本发明实施例化合物1的1H NMR谱图。
图6是本发明实施例化合物1的13C NMR谱图。
图7是本发明实施例化合物1的1H-1H COSY谱图。
图8是本发明实施例化合物1的HSQC谱图。
图9是本发明实施例化合物1的HMBC谱图。
具体实施方式
本发明的制备方法按照如下步骤进行：
a. 将吴茱萸近成熟果实粉碎，用质量浓度70%的乙醇加热回流提取三次，合并提取液，减压浓缩并回收乙醇，得吴茱萸浸膏；将吴茱萸浸膏用水分散，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇多次等体积萃取，分别减压浓缩得石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物及正丁醇萃取物；
b. 将乙酸乙酯萃取物进行硅胶柱层析，采用石油醚-乙酸乙酯按50:1，30:1，20:1，10:1，5:1，2:1，1:1，1:2梯度洗脱，每个梯度收集32L；
c. 合并石油醚-乙酸乙酯20:1至5:1洗脱流份；
d. 将所得洗脱流分经硅胶柱层析，用石油醚-乙酸乙酯按50:1，30:1，20:1，10:1，5:1，2:1，1:1，1:2梯度洗脱，每个梯度收集3个洗脱流份，每个洗脱流份为1 L，将依次得到的24个洗脱流分分别记为N1~N24；
e. 将洗脱流份N6经反相ODS中压柱色谱分离，以甲醇-水（10：90~90:10）梯度洗脱，流速15ml/min，洗脱6h，得到13个洗脱流份，每个洗脱流份为420 ml，将依次得到的13个洗脱流份分别记为N6-1~ N6-13；
f. 将洗脱流份N6-5经反相半制备C18色谱柱HPLC分离，甲醇：水=7：3，流速3.0 ml/min，得到化合物1。
一. 化合物的结构测定：
化合物1为白色结晶。
化合物1的HRESIMS谱图、H-1H COSY和HMBC相关谱图、实验CD与计算ECD谱图、X-射线单晶衍射图、1H NMR谱图、13C NMR谱图、1H-1H COSY谱图、HSQC谱图及HMBC谱图分别如图1~图9所示。
化合物1的核磁共振氢谱和碳谱数据如表1所示。
表1
Figure 175152DEST_PATH_IMAGE002
注： 1H-NMR（600 MHz，CD3OD）， 13C-NMR（150 MHz，CD3OD）
根据[α]20 D -111.2 (c 0.22, MeOH)，(+)-HR-ESIMS m/z 247.0948 [M + Na]+(calcd for C12H16O4Na, 247.0941) 结合核磁共振数据以及5个不饱和度确定其分子式为C12H16O4（图1）。化合物1的1H NMR谱显示存在两个末端双键质子[δ H 5.56 (br s, H-10a)和5.46 (br s, H-10b)]，两个顺式双键质子[δ H 5.91 (d, J = 12.6 Hz, H-3) 和 6.75(d, J = 12.6 Hz, H-4)]，两个甲基质子[δ H 1.44 (s, H-11) 和 1.48 (s, H-12)]，一个甲氧基质子[δ H 3.63 (s,OCH 3 -9)]，两个脂肪族亚甲基质子[δ H 2.83 (dd, J = 15.6,10.2 Hz, H-8a) 和2.28 (dd, J =15.6, 3.6 Hz, H-8b)]，一个脂肪族次甲基质子[δ H3.16 (ddd, J = 10.2, 3.6,1.2 Hz, H-6)]（表1）。13C NMR谱显示存在12个碳信号，除了以上基团相对应的碳信号外，还存在三个sp2季碳信号[δ C 168.0 (C-2), 145.7 (C-5) 和173.8 (C-9)]，一个sp3连氧季碳信号[δ C 82.0.4 (C-7)] （表1）。以上波谱数据显示该化合物是一个特殊的降碳倍半萜，并通过2D NMR波谱数据分析对其结构进行了确定。根据HMBC谱中，H-4/ C-2 和C-6, H-3/ C-5,H-8/ C-4 和 C-6，H-8和OCH 3-9/ C-9异核相关信号，结合它们的化学位移以及5个不饱和度，确证化合物1结构中存在一个乙酸甲酯单元和一个α,β-不饱和七元内酯环，并且C-5 和C-10形成末端双键（图2）。根据1H–1H COSY谱中H-6/H-8同核质子偶合相关信号以及HMBC谱中OCH 3 -9/C-9, H2-8/C-7, C-10 和 C-19, 推断出乙酸甲酯单元与七元内酯环通过C-6相连。另外，H-11和H-12与C-4 的HMBC相关信号，表明两个甲基连接在C-7上（图2）。化合物1预设为6R构型的计算ECD谱图与实验CD谱图相似，支持其C-6为R构型（图3）。化合物1经X-射线单晶衍射 (CuKα辐射)实验进一步确定其结构式如下所示（图4）。
Figure 114158DEST_PATH_IMAGE003
二.本发明实施例化合物1的抗肿瘤活性评价：
细胞活力测定：通过CCK-8方法检测化合物1对人肝癌细胞(Hepg-2)，人乳腺癌细胞(MCF-7), 人肺癌细胞(A549)，人肾癌细胞(A498)和人骨髓神经母细胞瘤细胞(SHSY-5Y)细胞活力的影响。
具体方法如下：
将处于对数生长期的肿瘤细胞制成单细胞悬液，取5000个/孔接种于96孔板中。次日，将96孔板中培养基更换为含有不同药物（化合物1）浓度（1、5、20、50、100 μM）的新鲜培养基，每组设置5个复孔，并设置空白对照；继续培养48 h后，更换为100μL用无血清培养基配制的CCK8溶液，孵育1~2 h后，于450 nm处测吸光值，并用GraphPad Prism 6计算得到IC50值，如表2所示：
表2
Figure 733358DEST_PATH_IMAGE004
从表2中可以看出，化合物1 对人肝癌细胞(Hepg-2)，人乳腺癌细胞(MCF-7), 人肺癌细胞(A549)，人肾癌细胞(A498)和人骨髓神经母细胞瘤细胞(SHSY-5Y)细胞的增殖具有抑制作用。

Claims (4)

1.一种降碳倍半萜类化合物，其特征在于结构式如下：
Figure DEST_PATH_IMAGE001
。
2.一种如权利要求1所述降碳倍半萜类化合物的制备方法，其特征在于按照如下步骤进行：
a. 将吴茱萸近成熟果实粉碎，用质量浓度70%的乙醇加热回流提取三次，合并提取液，减压浓缩并回收乙醇，得吴茱萸浸膏；将吴茱萸浸膏用水分散，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇多次等体积萃取，分别减压浓缩得石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物及正丁醇萃取物；
b. 将乙酸乙酯萃取物进行硅胶柱层析，采用石油醚-乙酸乙酯按50:1，30:1，20:1，10:1，5:1，2:1，1:1，1:2梯度洗脱；
c. 合并石油醚-乙酸乙酯20:1至5:1洗脱流份；
d. 将所得洗脱流分经硅胶柱层析，用石油醚-乙酸乙酯按50:1，30:1，20:1，10:1，5:1，2:1，1:1，1:2梯度洗脱，每个梯度收集3个洗脱流份，每个洗脱流份为1 L，将依次得到的24个洗脱流分分别记为N1~N24；
e. 将洗脱流份N6经反相ODS中压柱色谱分离，以甲醇-水梯度洗脱，流速15ml/min，洗脱6h，得到13个洗脱流份，每个洗脱流份为420 ml，将依次得到的13个洗脱流份分别记为N6-1~ N6-13；
f. 将洗脱流份N6-5经反相半制备C18色谱柱HPLC分离，甲醇：水=7：3，流速3.0 ml/min，得到单体化合物，即降碳倍半萜类化合物。
3.一种如权利要求1所述的降碳倍半萜类化合物在制备抗肿瘤药物中的应用。
4.根据权利要求3所述降碳倍半萜类化合物在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于是在制备抗肝癌、抗乳腺癌、抗肺癌、抗肾癌或抗骨髓神经母细胞瘤药物中的应用。
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