CN110452249B

CN110452249B - 新吉玛烷型倍半萜内酯类化合物及其制备和应用

Info

Publication number: CN110452249B
Application number: CN201910832122.XA
Authority: CN
Inventors: 宋少江; 黄肖霄; 白明; 徐伟
Original assignee: Shenyang Pharmaceutical University
Current assignee: Shenyang Pharmaceutical University
Priority date: 2019-09-04
Filing date: 2019-09-04
Publication date: 2021-02-05
Anticipated expiration: 2039-09-04
Also published as: CN110452249A

Abstract

本发明属于医药技术领域，涉及从菊科地胆草属植物地胆草(Elephantopus scaber Linn)中提取分离的三个新吉玛烷型倍半萜内酯类化合物1‑3(Elephantopusol，Scaberol C，Scaberlactone D)，它们具有相同的吉玛烷型倍半萜内酯母核，本发明还涉及该类新化合物及其药用组合物在制备抗肿瘤药物中的用途。本发明化合物制备方法简单易行，重现性比较好，纯度较高。获得的化合物具有良好的抗肿瘤活性。

Description

新吉玛烷型倍半萜内酯类化合物及其制备和应用

技术领域：

本发明属于医药技术领域，尤其涉及植物地胆草中制备的新吉玛烷型倍半萜内酯及其制备方法和这类化合物在制备抗肿瘤药物方面的应用。

背景技术：

地胆草：地胆草(Elephantopus scaber Linn)为菊科地胆草属植物，产于浙江、福建、云南、贵州等地。该属约有30余种，多集中分布于新热带地区，我国仅有两种，即地胆草和白花地胆草。地胆草又名地胆头、苦地胆，全株都可入药，其全草是中药苦地胆的来源,传统中医认为地胆草具有清热、凉血、利尿的功效，它具有抗炎、清热解毒、消肿利尿等功效，用于治疗感冒、咽喉炎、肾、湿疹、疔疮、蛇虫咬伤等疾病。

肿瘤是当前世界所面临的一个主要的威胁健康的问题，癌细胞能快速持久地生长、增殖并耐缺氧，是导致人类死亡的主要杀手，严重影响人们的健康和生活质量，其中肝癌的发病率和死亡率更是高达世界前列，中国是肝癌大国，我国每年新发肝癌病人约39.5万人，死亡38.3万人，并以5％的速度增长，占全球发病人数的近50％以上。因此，开发抗肿瘤药物是药学领域人员不断努力的方向。

发明内容：

本发明提供了三种从菊科地胆草属植物地胆草(Elephantopus scaber Linn)中分离得到的新吉玛烷型倍半萜内酯：

本发明的制备技术方案包括如下步骤：

利用地胆草制备新吉玛烷型倍半萜内酯的方法，包括如下步骤：

(1)取干燥的地胆草全草以70-80％乙醇回流提取，合并提取液浓缩得浸膏，浸膏采用乙酸乙酯萃取，并将所得组分经硅胶柱色谱，以二氯甲烷-甲醇系统100:0-0:100进行等度梯度洗脱，共收集到6个馏分(Ⅰ-Ⅳ)。

(2)馏分Ⅱ经HP-20柱色谱，以甲醇-水系统30:70-10:90进行梯度洗脱，得两个组分B1、B2、B3。利用凝胶柱色谱将B2组分以纯甲醇进行洗脱，得三个组分(a-c)。

(3)所得组分a经Sephadex LH-20柱色谱以90-95％乙醇为流动相以去除色素，并在开放式ODS柱色谱上用乙醇-水(20％-80％)洗脱，得到三个部分(Fr.a1-Fr.a3)。Fr.a2经硅胶柱色谱以石油醚-乙酸乙酯系统10:1-1:1洗脱，在TLC分析的基础上得到四个亚组分(F.A21-FR.A24)。

(4)在制备性反相高效液相色谱上使用甲醇-水(53:47，v/v)50％-60％的流动相来分离fr.A22得到了化合物1-3。

其中，

步骤(1)中所述的乙醇浓度为：70-80％，所述提取为回流提取，提取3-4次，每次2-3小时。

步骤(1)中，使用地胆草为菊科地胆草属植物地胆草(Elephantopus scaberLinn)。

所得化合物经过系统结构鉴定结果如下：

利用高分辨质谱，一维NMR、二维NMR及计算ECD技术对化合物1-3的结构鉴定。

Elephantopusol(1):无色块状晶体；

(c 0.1,MeOH)；HR-ESI-MS给出其准分子离子峰为301.1081[M+Na]⁺(cal.C₁₅H₁₈O₅Na,301.1046)，结合氢谱碳谱确定分子式为C₁₅H₁₈O₅，确定其不饱和度为7。

化合物1的¹H-NMR(400MHz in CDCl₃)谱数据显示存在两个烯烃质子[δ_H 6.96(1H,s)和5.02(1H,dt,J＝10.2,1.6Hz)]，两个甲基[δ_H 1.37(3H,d,J＝6.8Hz)和1.65(3H,d,J＝1.6Hz)]，三个连氧次甲基质子[δ_H 5.32(1H,d,J＝4.9Hz)，4.69(1H,t,J＝10.2Hz)和3.58(1H,dt,J＝10.5,5.1Hz)]和两对亚甲基[δ_H 2.90(1H,dt,J＝14.5,1.5Hz),2.28(1H,m)和2.72(1H,m),2.70(1H,m)]。¹³C-NMR(100MHz in CDCl₃)谱，显示15碳信号，包括两个内酯羰基碳信号(δ_C 178.9和174.5)，四个烯烃碳信号(δ_C 147.6,134.4,131.8和125.4)，三个含氧碳信号(δ_C 79.3,79.2和72.6)，两个亚甲基信号(δ_C 40.4和34.7)，两个次甲基信号(δ_C55.5和38.7)和两个甲基信号(δ_C 21.7和16.1)。在HMBC谱中，通过H-1与C-9,C-15的相关，H-6与C-4,C-8的相关，H-11与C-7，C-12，C-13的相关，确定了化合物10元环的存在和内酯环的位置；通过H-14与C-5的相关，确定了甲基的位置。以上数据建立了化合物1的平面结构。

化合物1的相对构型由偶合常数分析法和NOESY谱确定。H-5和H-6之间存在较大的偶合常数(J_{H 5，H6}＝10.2Hz)，这表明它们处于相反的关系。H-1/H-14，H-6/H-8，H-6/H-14之间可观察的NOE相关确定他们为β构型，而H-7和H-13之间的NOE相关，确定其为α构型。其绝对构型通过从二氯甲烷中获得化合物1的晶体，用单晶X射线衍射方法，以确定1的绝对构型。此外，实验和计算的ECD数据也支持1的2S,6R,7R,8S,11S的构型。因此，1的绝对构型为2S,6R,7R,8S,11S。

综上所述，最终确定了该化合物结构，为Elephantopusol(1)。

化合物1的¹H(400MHz)与¹³C(100MHz)NMR数据(CDCl₃)

Scaberol C(2):白色无定型粉末；

(c 0.1,MeOH)；HR-ESI-MS给出其准分子离子峰为299.0895[M+Na]⁺(cal.C₁₅H₁₆O₅Na,299.0890)，结合氢谱碳谱确定分子式为C₁₅H₁₆O₅，确定其不饱和度为8。

通过比较质谱与核磁数据，发现化合物2与1的结构相似，2的¹H-NMR(400MHz inCDCl₃)谱数据显示存在两个烯烃质子[δ_H 7.03(1H,s)和5.03(1H,d,J＝9.6Hz)]，两个甲基[δ_H6.42(3H,d,J＝2.4Hz)、6.15(3H,d,J＝1.5Hz)和1.61(3H,s)]，三个连氧次甲基质子[δ_H5.37(1H,d,J＝3.9Hz)，4.24(1H,t,J＝9.7Hz)和3.78(1H,dt,J＝11.4,4.2Hz)]和两对亚甲基[δ_H 2.25(1H,dd,J＝14.7,4.7),2.94(1H,dd,14.7,2.9)和2.90(1H,d,J＝7.9),2.72(1H,t,J＝12.0)]。¹³C-NMR(100MHz in CDCl₃)谱，显示15碳信号，包括两个内酯羰基碳信号(δ_C 178.9和174.5)，四个烯烃碳信号(δ_C,148.0,131.8,131.2和131.2)，三个含氧碳信号(δ_C 79.7,70.6和81.0)，两个亚甲基信号(δ_C 40.0和30.6)，两个次甲基信号(δ_C 49.9和134.4)和两个甲基信号(δ_C 21.9和128.4)。但化合物2具有一对环外双键(δ_H＝6.42,6.15)。这也被从H-13到C-11的HMBC相关性证实了C-11位与环外双键相连。此外，在NOESY谱中还确定了H-2、H-6、H-7、H-8的相对构型。通过实验和计算得到的ECD谱的比较，确定了2的绝对构型。因此，化合物被鉴定为2S,6R,7S,8S。

综上所述，最终确定了该化合物结构，为Scaberol C(2)。

化合物2的¹H(400MHz)与¹³C(100MHz)NMR数据(CDCl₃)

Scaberlactone D(3):白色无定型粉末。

(c 0.1,MeOH)；HR-ESI-MS给出其准分子离子峰为367.1113[M+Na]⁺(cal.C₁₉H₂₀O₆Na,381.1152)，结合氢谱碳谱确定分子式为C₁₉H₂₀O₆，确定其不饱和度为10。通过化合物3核磁共振数据，低场区中δ_H 6.28(1H,d,J＝3.3Hz),5.68(1H,d,J＝2.7Hz)为α-亚甲基γ-内酯结构中不饱和双键端基质子信号，δ_H7.02(1H,s)和δ_H 5.39(1H,d,J＝7.4Hz)为α,β不饱和内酯结构中质子信号。两个甲基信号δ_H1.97(3H,s),1.61(3H,s)和一个烯基质子δ_H 6.15(1H,s),5.68(1H,d,J＝2.7Hz)表明存在一个异丁基酰氧基侧链。三个羰基碳信号分别为δ_C 171.4(C-15),168.7(C-12),165.7(C-16),其中两个为内酯羰基碳，一个为酯羰基碳。δ_C 165.7(C-16),136.0(C-17),18.4(C-19),126.9(C-18),为异丁基酰氧基侧链信号。δ_C 148.9(C-1),77.2(C-2),129.4(C-10),171.4(C-15)为α,β不饱和内酯碳信号，δ_C 76.5(C-6),48.0(C-7),135.0(C-11),168.7(C-12),124.9(C-13)为α-亚甲基-γ-内酯结构的碳信号。δ_C 134.8(C-4)和δ_C 123.4(C-5)为双键碳信号，δ_C 34.6(C-3)和δ_C 32.3(C-9)为亚甲基碳信号，δ_C 72.0(C-8)为次甲基碳信号，δ_C 28.2(C-14)为甲基碳信号。在HMBC谱中，H-1与C-9,C-15的相关，H-6与C-4,C-8的相关，H-11与C-7，C-12，C-13的相关，确定了化合物10元环的存在和内酯环的位置；通过H-14与C-5的相关，确定了甲基的位置；H-8与C-16的相关，确定了异丁基酰氧基侧链的连接位置，以上信息确定化合物3的平面结构。H-2/H-6,H-14和H-5/H-7,H-8的关键NOE相关表明H-2,H-6和H-14是同相的，而H-5,H-7和H-8为相反。根据计算ECD与实验值相比较，因此绝对构型为2S,6R,7R,8R。

综上所述，最终确定了该化合物结构，为Scaberlactone D(3)

化合物3的¹H(400MHz)与¹³C(100MHz)NMR数据(CDCl₃)

对发明所述三个化合物的抗肿瘤活性进行了考察，三个化合物均显示出了明显的抗肿瘤活性。其中在HepG2细胞中，化合物2的IC₅₀值(16.79)，3的IC₅₀值(15.31)均明显小于阳性药的IC₅₀值(44.34)；在Hep3B细胞中，化合物2的IC₅₀值(19.68)，3的IC₅₀值(19.78)均明显小于阳性药的IC₅₀值(22.91)，即化合物2和3的对于肝癌细胞毒活性明显强于阳性药，因此本发明所述的新吉玛烷型倍半萜内酯类化合物具有进一步开发预防和治疗肿瘤药物的前景。

本发明的优点在于，所述化合物均为新化合物，结构新颖，且均为立体构型确定的光学纯化合物，同时其抗肿瘤活性强，具有进一步开发的价值。

附图说明：

图1化合物1的UV谱；

图2化合物1的IR谱；

图3化合物1的HR-ESIMS谱；

图4化合物1的CD谱；

图5化合物1的¹H-NMR谱(400MHz,CDCl₃)；

图6化合物1的¹³C-NMR谱(100MHz,CDCl₃)；

图7化合物1的HSQC谱(600MHz,CDCl₃)；

图8化合物1的HMBC谱(600MHz,CDCl₃)；

图9化合物1的NOESY谱(600MHz,CDCl₃)；

图10化合物2的UV谱；

图11化合物2的IR谱；

图12化合物2的HR-ESIMS谱；

图13化合物2的CD谱；

图14化合物2的¹H-NMR谱(400MHz,CDCl₃)；

图15化合物2的¹³C-NMR谱(100MHz,CDCl₃)；

图16化合物2的HSQC谱(600MHz,CDCl₃)；

图17化合物2的HMBC谱(600MHz,CDCl₃)；

图18化合物2的NOESY谱(600MHz,CDCl₃)；

图19化合物3的UV谱；

图20化合物3的IR谱；

图21化合物3的HR-ESIMS谱；

图22化合物3的CD谱；

图23化合物3的¹H-NMR谱(400MHz,CDCl₃)；

图24化合物3的¹³C-NMR谱(100MHz,CDCl₃)；

图25化合物3的HSQC谱(600MHz,CDCl₃)；

图26化合物3的HMBC谱(600MHz,CDCl₃)；

图27化合物3的NOESY谱(600MHz,CDCl₃)。

具体实施方式：

下面所列实施例有助于本领域技术人员更好地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。

实施例1：化合物1-3的制备。

取干燥的地胆草全草以70％工业乙醇回流提取三次，每次3小时。合并提取液浓缩得浸膏，浸膏采用乙酸乙酯萃取并将所得组分经硅胶柱色谱，以二氯甲烷-甲醇系统100:0-0:100进行等度梯度洗脱，共收集到6个馏分(Ⅰ-Ⅳ)。

馏分Ⅱ经HP-20柱色谱，以甲醇-水系统30:70-10:90进行梯度洗脱，得两个组分B1、B2、B3。利用凝胶柱色谱将B2组分以纯甲醇进行洗脱，得三个组分(a-c)。

所得组分a经Sephadex LH-20柱色谱以95％乙醇为流动相以去除色素，并在开放式ODS柱色谱上用乙醇-水(20％-80％)洗脱，得到三个部分(Fr.a1-Fr.a3)。Fr.a2经硅胶柱色谱以石油醚-乙酸乙酯系统10:1-1:1在TLC分析的基础上得到四个亚组分(F.A21-FR.A24)。

在制备性反相高效液相色谱上使用甲醇-水(53:47，v/v)的流动相来分离fr.A22得到了化合物1-3。

实施例2：化合物1-3的抗肝癌的活性考察。

取处于对数生长期的细胞(HepG2,Hep3B)，经胰酶消化后，形成细胞悬浮液。在96孔培养板上接种，每孔5000个细胞密度，100μL/孔。将接种好的96孔板培养于37℃，5％CO₂条件下的培养箱内培养。12h后，待细胞贴壁，每孔加入100μL不同浓度下的受试化合物，培养于37℃，5％CO₂条件下的培养箱内，作用48h。对照组加入相同体积的空白培养基，每组设置3个复孔，无细胞孔作为背景。48h后加四唑蓝(MTT)20μL/孔，继续在相同的条件下培养4h，小心吸弃96孔内的培养上清液，每孔加入150μL DMSO，在室温条件下适当振荡，使形成的结晶充分溶解。用酶标仪在490nm处测定光密度值,生长抑制率按如下公式计算：

利用SPSS(16.0)统计软件进行检验分析，结果用IC₅₀值来评估受试化合物的细胞毒活性。

以5-氟尿嘧啶为阳性对照。