CN114129558B - 倍半萜内酯类化合物在制备化疗药物抗肿瘤增效剂或耐药逆转剂中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明首次发现式(I)所示倍半萜内酯类化合物联合化疗药物对乳腺癌MDA‑MB‑231和SKBR3细胞具有高效的抗肿瘤增殖及诱导凋亡作用。式(I)所示倍半萜内酯类化合物不仅提高了乳腺癌MDA‑MB‑231和SKBR3细胞对EPI的敏感性,也提高了表阿霉素耐药的乳腺癌MDA‑MB‑231/EPI细胞对EPI的敏感性,EM‑2(IC20)联合EPI可以逆转MDA‑MB‑231/EPI细胞对EPI的耐药。EM‑2联合EPI在治疗癌症方面具有广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域,更具体地,涉及倍半萜内酯类化合物在制备化疗药物抗肿瘤增效剂或耐药逆转剂中的应用。
背景技术
白花地胆草(Elephantopus mollis H.B.K.)为菊科地胆草属植物,又名牛舌草,主要分布于华南和西南等热带地区,如福建、广东等地,白花地胆草以全草入药,性凉,味辛、苦,具有清热解毒、消炎、凉血、利湿消肿等功效。临床上主要治疗扁桃体炎、感冒、肝炎、毒疮等疾病。对该植物的研究表明其所含化学成分类型比较多,而咖啡酰奎宁酸类衍生物和倍半萜内酯类是其主要活性成分。
现有技术中对白花地胆草单体医疗用途的效果及作用机制的研究还很欠缺,急需进一步研究开发白花地胆草单体的其它医药用途具有重要的应用价值。
发明内容
本发明的目的在于提供倍半萜内酯类化合物在制备化疗药物抗肿瘤增效剂或耐药逆转剂中的应用
本发明所采取的技术方案是:
本发明的第一个方面,提供倍半萜内酯类化合物在制备化疗药物抗肿瘤增效剂中的应用,所述倍半萜内酯类化合物为式(I)所示化合物、其药学上可接受的盐或其立体异构体或其前药分子:
根据本发明第一个方面所述的应用,优选地,所述化疗药物为蒽环类药物。
根据本发明第一个方面所述的应用,优选地,所述化疗药物包括EPI、DDP、CBP、5-FU、PTX中的至少一种。
更优选为EPI。
根据本发明第一个方面所述的应用,优选地,所述肿瘤为乳腺癌。
本发明的第二个方面,提供倍半萜内酯类化合物在制备化疗药物抗肿瘤耐药逆转剂中的应用,所述倍半萜内酯类化合物为式(I)所示化合物、其药学上可接受的盐或其立体异构体或其前药分子:
根据本发明第二个方面所述的应用,优选地,所述化疗药物为蒽环类药物。
根据本发明第二个方面所述的应用,优选地,所述化疗药物包括EPI、DDP、CBP、5-FU、PTX中的至少一种。
更优选地,所述化疗药物为EPI。
根据本发明第二个方面所述的应用,优选地,所述肿瘤为乳腺癌。
本发明的第三个方面,提供倍半萜内酯类化合物在制备化疗药物抑制肿瘤细胞增殖的增效剂中的应用,所述倍半萜内酯类化合物为式(I)所示化合物、其药学上可接受的盐或其立体异构体或其前药分子:
根据本发明第三个方面所述的应用,优选地,所述化疗药物为蒽环类药物。
根据本发明第三个方面所述的应用,优选地,所述化疗药物包括EPI、DDP、CBP、5-FU、PTX中的至少一种。
更优选地,所述化疗药物为EPI。
根据本发明第三个方面所述的应用,优选地,所述肿瘤细胞为乳腺癌细胞。
更优选地,所述肿瘤细胞为MDA-MB-231细胞和/或SKBR3细胞。
本发明的第四个方面,提供倍半萜内酯类化合物在制备化疗药物诱导肿瘤细胞凋亡的增效剂中的应用,所述倍半萜内酯类化合物为式(I)所示化合物、其药学上可接受的盐或其立体异构体或其前药分子:
根据本发明第四个方面所述的应用,优选地,所述化疗药物为蒽环类药物。
根据本发明第四个方面所述的应用,优选地,所述化疗药物包括EPI、DDP、CBP、5-FU、PTX中的至少一种。
更优选地,所述化疗药物为EPI。
根据本发明第四个方面所述的应用,优选地,所述肿瘤细胞为乳腺癌细胞。
更优选地,所述肿瘤细胞为MDA-MB-231细胞和/或SKBR3细胞。
本发明的第五个方面,提供I~III中的任意一种在制备抗肿瘤药物中的应用,其中:
I.式(I)所示倍半萜内酯类化合物、其药学上可接受的盐或其立体异构体或其前药分子:
II.式(I)所示倍半萜内酯类化合物、其药学上可接受的盐或其立体异构体或其前药分子和蒽环类药物;
III.式(I)所示倍半萜内酯类化合物、其药学上可接受的盐或其立体异构体或其前药分子和化疗药物,所述化疗药物为DDP、CBP、5-FU和PTX中的至少一种。
根据本发明第五个方面所述的应用,优选地,所述化疗药物为蒽环类药物。
根据本发明第五个方面所述的应用,优选地,所述化疗药物包括EPI、DDP、CBP、5-FU、PTX中的至少一种。
更优选地,所述化疗药物为EPI。
根据本发明第五个方面所述的应用,优选地,所述肿瘤为乳腺癌。
根据本发明第五个方面所述的应用,优选地,所述肿瘤细胞为乳腺癌细胞。
更优选地,所述肿瘤细胞为MDA-MB-231细胞和/或SKBR3细胞。
本发明的第六个方面,提供一种药物组合物,包括以下I~III中的任意一种:
I.式(I)所示倍半萜内酯类化合物、其药学上可接受的盐或其立体异构体或其前药分子:
II.式(I)所示倍半萜内酯类化合物、其药学上可接受的盐或其立体异构体或其前药分子和蒽环类药物;
III.式(I)所示倍半萜内酯类化合物、其药学上可接受的盐或其立体异构体或其前药分子和化疗药物,所述化疗药物为DDP、CBP、5-FU和PTX中的至少一种。
根据本发明第六个方面所述的药物组合物,进一步地,所述药物组合物用于治疗癌症。
更进一步地,所述药物组合物用于治疗乳腺癌。
更优选地,所述药物组合物的序贯给药方式为先给式(I)所示倍半萜内酯类化合物其药学上可接受的盐或其立体异构体或其前药分子,再给蒽环类药物或DDP、CBP、5-FU和PTX中的至少一种。
根据本发明第六个方面所述的药物组合物,进一步地,所述药物组合物的剂型选自:注射剂、片剂、胶囊、试剂盒或贴剂。
本发明的有益效果是:
1.本发明首次发现式(I)所示倍半萜内酯类化合物(EM-2,IC20浓度,即达到20%的抑制率的药物EM-2的浓度,下同)联合化疗药物对乳腺癌MDA-MB-231和SKBR3细胞具有高效的抗肿瘤增殖及诱导凋亡作用。EM-2(IC20)联合5种化疗药物(EPI、DDP、CBP、5-FU、PTX)作用48h,其中EM-2(IC20)联合EPI具有显著的协同抗乳腺癌细胞增殖作用,且增敏倍数最高,在MDA-MB-231和SKBR3细胞中分别增敏37.909和33.889倍。EM-2(IC20)联合EPI在MDA-MB-231和SKBR3细胞作用24h和72h同样具有良好的抗肿瘤和增敏作用,分别增敏22.054、21.130、19.534、35.000倍。EM-2(IC20)联合EPI不同的序贯给药方式对乳腺癌MDA-MB-231和SKBR3细胞具有不同的增殖抑制效果,其中EM2→EPI的序贯给药方式对乳腺癌细胞具有最显著的增殖抑制作用,且增敏倍数最高。
2.本发明还验证了EM-2联合EPI通过以下途径发挥抗肿瘤作用:(1)EM-2联合EPI通过阻断自噬流诱导不完整自噬的发生,诱导乳腺癌细胞凋亡。(2)EM-2联合EPI通过持续激活内质网应激,诱导乳腺癌MDA-MB-231和SKBR3细胞发生Caspase依赖性凋亡。EM-2联合EPI诱导的自噬流阻断,增加乳腺癌MDA-MB-231和SKBR3细胞内ROS的水平,从而诱发DNA损伤,促进细胞凋亡。EM-2(IC20)不仅提高了乳腺癌MDA-MB-231和SKBR3细胞对EPI的敏感性,也提高了表阿霉素耐药的乳腺癌MDA-MB-231/EPI细胞对EPI的敏感性,EM-2(IC20)联合EPI可以逆转MDA-MB-231/EPI细胞对EPI的耐药。因此EM-2联合EPI在治疗癌症方面具有广阔的应用前景。
附图说明
图1EPI抑制乳腺癌细胞增殖,诱导乳腺癌细胞凋亡。A:MTT检测结果;B:细胞克隆形成实验结果;C:western blot实验检测Caspase家族蛋白表达量结果。
图2自噬抑制剂联合EPI可增加乳腺癌细胞的毒性并逆转生存。A:Western blot结果;B、C:MTT检测结果;D、E:western blot检测自噬及相关凋亡蛋白的表达水平。
图3EM-2对人乳腺癌细胞的细胞毒性作用。
图4EM-2(IC20)联合化疗药物对MDA-MB-231细胞和SKBR3细胞的增殖抑制作用。A、B、C、D、E分别为:EM-2联合表阿霉素(EPI)、顺铂(DDP)、EM-2联合卡铂(CBP)、EM-2联合氟尿嘧啶(5-FU)和EM-2联合紫杉醇(PTX)的抗肿瘤效果。
图5EM-2(IC20)和EPI联合应用对乳腺癌细胞增殖抑制的影响。A、B:EM-2(IC20)联合EPI作用24h(A)和72h(B)对乳腺癌细胞存活能力的MTT检测结果;C:细胞克隆形成实验结果。
图6EM-2联合EPI序贯给药方式对乳腺癌细胞增殖抑制的影响(MTT法检测结果)。
图7EM-2诱导MDA-MB-231细胞和SKBR3细胞凋亡(western blot法检测结果)。
图8EM-2联合EPI诱导乳腺癌细胞凋亡。A、B分别为采用Annexin V-FITC/PI双染色检测MDA-MB-231细胞和SKBR3细胞凋亡水平的检测结果。C:EM-2联合EPI作用MDA-MB-231和SKBR3细胞24h后Caspase家族蛋白的表达量变化结果;D:Z-VAD-FMK逆转EM-2联合EPI导致的细胞凋亡(western blot法检测结果);E:Z-VAD-FMK逆转EM-2联合EPI导致的细胞增殖抑制(MTT法检测结果)。
图9EM-2对MDA-MB-231细胞和SKBR3细胞自噬的影响,浓度梯度(A)和时间梯度(B)。
图10EM-2联合EPI抑制乳腺癌细胞的自噬流。
图11EM-2联合EPI增加乳腺癌细胞中ROS的积累。A:流式细胞仪检测结果;B:统计分析结果。
图12EM-2和EPI诱导MDA-MB-231细胞和SKBR3细胞的DNA损伤。A、B分别为:γ-H2AX表达随着EM-2(A)和EPI(B)作用于乳腺癌细胞呈时间依赖性增加;C、D分别为:p-ATM、p53和γ-H2AX蛋白的表达水平随着EM-2(C)和EPI(D)浓度的增加呈浓度依赖性增加。
图13EM-2联合EPI诱导乳腺癌细胞DNA损伤及细胞凋亡。A:western blot检测EM-2联合EPI作用于MDA-MB-231和SKBR3细胞0,2,4,8h,γ-H2AX蛋白的表达水平;B:EM-2联合EPI作用于乳腺癌细胞时,DNA损伤相关蛋白p-ATM、p53和γ-H2AX的表达水平;C:NAC逆转EM-2联合EPI致乳腺癌细胞DNA损伤(免疫印迹实验结果);D:NAC逆转EM-2联合EPI致乳腺癌细胞增殖抑制(MTT检测结果);E,F:NAC逆转EM-2联合EPI致乳腺癌细胞凋亡(流式细胞仪检测结果)。
图14EM-2抑制MDA-MB-231/EPI(耐药)细胞增殖并诱导细胞凋亡。A:MTT检测结果;B:western blot检测结果。
图15EM-2联合EPI致MDA-MB-231/EPI增殖抑制及细胞凋亡。A:EPI对MDA-MB-231、MDA-MB-231/EPI细胞的增殖抑制作用(MTT检测结果);B:EPI单药或联合EM-2对MDA-MB-231/EPI细胞的增殖抑制作用(MTT检测结果);C:EPI单药或联合EM-2对MDA-MB-231/EPI细胞IC50的比较;D:EM-2联合EPI抑制MDA-MB-231/EPI增殖(克隆形成抑制实验);E、F分别为:EPI单药或联合EM-2对MDA-MB-231/EPI细胞凋亡的影响(流式细胞术检测结果)组;G:EPI单药或联合EM-2对MDA-MB-231/EPI细胞凋亡的影响(Westernblot检测结果);H:Z-VAD-FMK逆转EM-2联合EPI导致的乳腺癌细胞凋亡(Western blot检测结果);I:Z-VAD-FMK逆转EM-2联合EPI导致的乳腺癌细胞增殖抑制(MTT检测结果)。
具体实施方式
为了能够更清楚地理解本发明的技术内容,特举以下实施例结合附图详细说明。应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件,例如Sambrook等人,分子克隆:实验室手册(NewYork:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂,均为市售产品。
本课题组前期运用多种色谱分离手段从白花地胆草全草中分离得到了25个化合物,并且应用波谱和化学方法鉴定了这25个化合物的结构,其中包括2β-methoxy-2-deethoxy-phantomolin(EM-2),EM-2单体的化学分子式C20H24O6,结构鉴定如式(I)所示,用DMSO溶解为10mM的母液,放置-80℃保存。
EM-2为白色粉末(甲醇),易溶于甲醇、氯仿等大极性有机溶剂,不溶于石油醚、乙酸乙酯等小极性有机溶剂。薄层层析后,香草醛-浓硫酸显紫色;红外光谱显示该化合物含有羰基(1770,1716cm-1),紫外光谱显示其在208nm处有最大吸收;HR-ESI-MSm/z:383.1465[M+Na]+(C20H24O6Na理论计算值为383.1465),提示该化合物的分子量为360,其分子式为C20H24O6,不饱和度为9。
1H NMR(400MHz,CDCl3)谱中显示在低场区δH 5.44~6.28有6个烯质子氢;在高场区δH 1.69~1.94有9个甲基氢,提示该化合物中有3个甲基;δH 6.12(1H,s)、5.66(1H,s)和1.94(3H,s)提示该化合物中含有1个异丁烯酰基侧链;δH 3.17(3H,s)为1个甲氧基质子信号;低场两个烯质子信号δH 6.27(1H,d,J=2.6Hz)和5.75(1H,d,J=2.6Hz)结合红外光谱在1770cm-1处的吸收峰,提示分子中含有一α-亚甲基-γ-内酯基团。
表1 NMR data of EM-2(in CDCl3,400MHz for1H,δ in ppm,J in Hz)
13CNMR(100MHz,CDCl3)谱和DEPT谱显示该化合物共有20个碳信号,包括7个季碳、6个次甲基碳、3个亚甲基碳和4个甲基碳。其中低场δC169.1和165.8提示该化合物中含有2个羰基;δC125-140不饱和区含有8个碳信号提示分子中含有4个双键;δC114.2、85.9、79.4和76.7提示分子中含有4个连氧碳信号,其中δC114.2为连2个氧碳信号;另外,δC49.7为一甲氧基信号;高场δC28.6、18.4和13.1为3个甲基碳信号。综合以上信息,推测该化合物为带有异丁烯酰基侧链的倍半萜内酯类化合物。
1.实验材料与方法
细胞株:人乳腺癌细胞株MDA-MB-231、SKBR3由暨南大学基础医学院生化实验室保存培养。人乳腺癌表阿霉素耐药细胞株MDA-MB-231/EPI购买自上海佰晔生物科技中心。
方法:MTT实验、细胞克隆形成实验检测EM-2(IC20)联合EPI对乳腺癌细胞存活和增殖能力的影响;流式细胞术检测细胞凋亡和细胞内ROS水平;western blot检测细胞内凋亡、自噬、内质网应激、DNA损伤等相关通路蛋白的表达水平;此外,Caspase家族蛋白抑制剂Z-VAD-FMK,自噬阻断剂Bafilomycin A1(Baf-A1)和chloroquine(CQ),内质网应激阻断剂4-Phenylbutyric acid(4-PBA)和ROS清除剂N-acetyl cysteine(NAC)分别用来进一步检测相关信号通路的改变。
MTT实验:(1)取对数生长期的细胞,用胰酶消化后,制成细胞悬液并计数,取每孔5000-10000个细胞接种于96孔细胞培养板,每孔加入100μL的培养液,置于细胞培养箱(37℃,5%CO2)中培养。
(2)待细胞贴壁后,每孔加入100μL含相应浓度药物的培养液,分别培养24h,48h和72h。
(3)用药时间到后,将20μLMTT(5mg/mL)加入96孔板中,并将其放置在37℃的培养箱中继续培养4h。
(4)4h后,用真空泵抽吸96孔板中的上清,然后每孔加入100μL的DMSO,并将96孔板震荡10min。
(5)将96孔板置于酶标仪上,设置OD值为570nm,检测每孔的吸光值,导出数据并计算细胞存活率。存活率(%)=(实验组的平均OD值/对照组的平均OD值)×100%。化疗增敏倍数=单用时化疗药物IC50/联合用药时化疗药物IC50。
Annexin V-FITC/PI双染色检测细胞凋亡水平:(1)将对数生长期的细胞用胰酶消化,重悬并计数,以每孔2.0×105个细胞接种于6孔板中,每孔加入培养液2mL,
(2)贴壁后,按实验要求,用含有不同药物浓度的培养液处理细胞24h。
(3)轻轻地收集细胞(含上清液),防止对细胞造成机械损伤;用500μL胰酶进行消化,再加入1mL培养液终止消化,收集至离心管中离心(1000rpm/min,5min)。
(4)去除上清,用PBS重悬后转移至1.5mL EP管中离心(1000rpm/min,5min)。
(5)去除上清,按照凋亡试剂盒进行实验操作,每个EP管中加入Binding Buffer250μL,AnnexinV-FITC和PI各2.5μL,小心吹打混匀,避免对细胞造成机械损伤,室温下避光孵育15min。将细胞转移至流式管中进行上机检测,并对凋亡情况进行分析。
DCFH-DA探针检测细胞内活性氧水平:(1)将对数生长期的细胞进行消化,重悬计数后,以每孔4.0×105个细胞接种于6孔板中。
(2)贴壁后,按照实验要求加入不同药物作用细胞24h。
(3)轻轻地收集含上清液的细胞,用500μL胰酶消化,再加入1mL的收集液终止消化,再收集至离心管中,离心(1000rpm/min,5min)。
(4)用1×PBS将细胞重悬后,1600rpm/min,5min下进行离心操作,收集沉淀。
(5)加入200μL DCFH-DA染液混匀,避光15min。
(6)将细胞用500μL 1×PBS重悬,1600rpm/min,5min离心,收集沉淀。
(7)加入300μL 1×PBS,轻轻混匀,转移到96孔板中上机。
免疫印迹实验:(1)蛋白提取及蛋白浓度测定
①取出经药物处理后的6孔板,将孔里的培养液上清吸出,每孔用1mL的1×PBS洗2遍。注意操作轻柔,以免将贴壁的细胞冲洗下,洗去残余培养液。
②每孔加入250μL的胰酶将细胞消化,用1mL的培养基终止消化,转移至15mL的离心管中,在1000rpm,5min条件下进行离心操作。
③去除上清,用1×PBS轻柔地重悬细胞于1.5mL的EP管中,在1000rpm,5min下离心。
④去除上清,全程将细胞放置于冰上操作,加入提前配置好的RIPA裂解工作液(60-150μL),每隔5min用涡旋器震荡,30min后,在12000rpm,4℃,15min条件下进行离心操作。
⑤将上清液转移至新的1.5mLEP管中,注意冰上操作。
⑥按照生工BCA法蛋白质浓度测定试剂盒说明书测定蛋白浓度:根据样本的数目,计算出所需的BCA工作液总体积,按照配比适量BCA液(A∶B∶C=25∶24∶1),混匀后即可。标准蛋白按照0、0.5、1、2、4、6、8、10μg/mL的浓度稀释后,取100μL标准蛋白与100μL稀释后的样品加入到96孔板中,再加入BCA工作液,置于37℃温箱中孵育30min。冷却至室温后,使用酶标仪在562nm波长下读取读数,并计算出相应的蛋白浓度。
⑦计算并配平各蛋白浓度,按计算出来的表,先加入Buffer A,再加入Sample,最后加入5×SDS,混匀。
⑦放置100℃金属浴加热5min至蛋白完全变性后,放置室温冷却,-20℃保存。
(2)制分离胶和浓缩胶:按照western blot制胶表配制分离胶和浓缩胶,聚丙烯酰胺凝胶的上层是浓缩胶,浓度为5%,下层胶是分离胶,浓度为8%到15%,可以根据实验目的不同的蛋白分子量配制不同浓度的分离胶。安装好制胶架,等待上样。
(3)电泳:将蛋白样品置于金属浴中加热5min,混匀,根据实验要求设计上样顺序,上样完成后将基础电泳仪电源的电压调至80V,插上电源进行电泳,30min后,当样品进入分离胶后,将电压调至120V。待样品进入凝胶底部时,电泳结束,电泳总时间约为1小时30分钟。
(4)转膜:转膜前,用甲醇浸泡PVDF膜1min,在1×转膜液中将电泳后的胶进行“夹心饼”操作,依次为海绵、滤纸片、聚丙烯酰胺胶、PVDF膜、滤纸片、海绵,呈三明治状结构,可借助滚轴赶走气泡。将电转仪插上电源,电流调至250mA,时间约为2小时。
(5)孵育抗体与显影:
①转膜结束后,将PVDF膜用5%脱脂牛奶浸泡,用摇床在室温条件下慢摇1小时。
②取出PVDF膜,用1×TBST在摇床上快洗3次,10min/次,洗完后加入一抗在4℃冰箱慢摇过夜。
③一抗孵育完毕后,将一抗回收。1×TBST快洗3次,10min/次。再使用加入5%脱脂牛奶按1∶10000稀释二抗,置于摇床慢摇1小时。
④二抗孵育完毕后,用1×TBST在摇床上快洗3次,10min/次。
⑤配制ECL发光液,将配制的发光液均匀滴加在PVDF膜上,使用Bio-Rad发光仪进行曝光显影。
表2免疫印迹实验相关抗体及其供应商
统计与与分析:使用GraphPad Prism 8、SPSS软件进行数据处理与分析,MTT、克隆形成实验结果,流式细胞术检测细胞凋亡实验结果,ROS水平检测结果等实验数据均为三次独立实验结果得出,统计值用均数±标准差,各组间的均数比较用方差分析,两组之间的均数比较用t检验,检验水准为a=0.05。
实施例1
EPI作为蒽环类化疗药物常被临床用于治疗乳腺癌,我们通过MTT、细胞克隆、western blot、Baf-A1和CQ阻断实验研究EPI乳腺癌细胞的作用及其作用机制。
使用MTT检测EPI对乳腺癌MDA-MB-231和SKBR3细胞的增殖抑制作用。如图1中A所示,用DMSO(0.04%)作对照,EPI分别处理MDA-MB-231,SKBR3细胞48h,得出50%抑制率对应的药物浓度(IC50)分别为0.417±0.558μM;0.316±0.011μM。细胞克隆形成实验结果如图1中B所示,使用0.04%DMSO和不同浓度的EPI处理MDA-MB-231和SKBR3细胞7天,发现随着EPI药物浓度的上升,细胞克隆形成的抑制效果越显著,细胞克隆数目也越来越少。通过western blot实验检测EPI分别作用于MDA-MB-231和SKBR3细胞24h后Caspase家族蛋白表达量的变化。结果如图1中C所示,随着EPI浓度的增加,Caspase-9、Caspase-3和PARP的蛋白表达下降,CL-Caspase-9和CL-Caspase-3和CL-PARP的蛋白水平上升。以上结果说明EPI对乳腺癌MDA-MB-231和SKBR3细胞具有较好的增殖抑制及诱导凋亡的作用。
发明人通过免疫印迹验证EPI对MDA-MB-231和SKBR3细胞自噬流的影响。Westernblot结果如图2中A所示,随着EPI浓度的增加,LC3-II型蛋白的表达量逐渐增加,而p62的表达水平逐渐下降,Beclin-1蛋白表达水平基本不变,说明EPI诱导乳腺癌细胞发生自噬。接着,如图2中B、C所示,我们通过MTT检测自噬阻断剂bafilomycinA1(Baf-A1)和chloroquine(CQ)分别预处理MDA-MB-231和SKBR3细胞4h,再联合EPI继续培养44h,发现(EPI+,Baf-A1+)、(EPI+,CQ+)组分别与(EPI+,Baf-A1-)、(EPI+,CQ-)组相比,前者的细胞存活率降低。最后,western blot观察Baf-A1和CQ作用于乳腺癌细胞4h,再加入EPI继续培养20h,westernblot观察自噬及相关凋亡蛋白的表达水平。结果如图2中D、E所示,(EPI+,Baf-A1+)、(EPI+,CQ+)组与(EPI+,Baf-A1-)、(EPI+,CQ-)组相比,前者的p62和LC3-II表达增加,凋亡相关蛋白PARP、Caspase-3表达减少,CL-PARP、CL-Caspase-3表达增加。
以上结果说明自噬阻断剂Baf-A1和CQ联合EPI增加了乳腺癌细胞的毒性并促进凋亡。以上结果说明,EPI诱导乳腺癌细胞发生的自噬,是一种保护性机制,而自噬阻断剂Baf-A1和CQ联合EPI作用于乳腺癌细胞时,通过阻断自噬流诱导不完整自噬的发生,提高MDA-MB-231和SKBR3细胞对EPI的敏感性并促进凋亡。
结论:(1)EPI对乳腺癌细胞具有增殖抑制及诱导凋亡作用。(2)EPI诱导乳腺癌细胞发生保护性自噬,而自噬阻断剂Baf-A1和CQ联合EPI作用于乳腺癌细胞时,通过阻断自噬流诱导不完整自噬的发生,提高MDA-MB-231和SKBR3细胞对EPI的敏感性并促进凋亡。
实施例2
发明人课题组前期研究发现白花地胆草单体EM-2是一种新型自噬阻断剂,通过阻断自噬流,诱导肝癌Huh-7、肺癌A549和乳腺癌MCF-7细胞发生凋亡。随后,发明人通过MTT、细胞克隆及western blot、Annexin V-FITC/PI染色、Z-VAD-FMK阻断实验研究EM-2(即式(I)所示倍半萜内酯类化合物)对乳腺癌细胞的作用以及作用机制。通过MTT、细胞克隆形成、western blot、Annexin V-FITC/PI染色、Z-VAD-FMK阻断实验研究EM-2和/或EPI对乳腺癌细胞细胞增殖或凋亡的影响。
发明人使用MTT检测EM-2对乳腺癌MDA-MB-231和SKBR3细胞的增殖抑制作用。用DMSO(0.04%)作对照,EM-2分别处理MDA-MB-231,SKBR3细胞24h,48h,72h对应的20%抑制率对应的药物浓度(IC20)和50%抑制率对应的药物浓度(IC50),如图3和表3所示,结果显示EM-2对乳腺癌MDA-MB-231和SKBR3细胞具有显著的增殖抑制作用,细胞存活率随着EM-2作用浓度和时间的增加而下降。
发明人使用MTT检测EPI作用于MDA-MB-231和SKBR3细胞48h的增殖抑制效果,对比EM-2联合EPI的增殖抑制效果。(EM-2+,EPI+)组先给予EM-2对MDA-MB-231和SKBR3细胞的IC20(分别为:5.211±0.492μM、0.959±0.071μM)培养细胞4h,后给予不同浓度的EPI继续培养细胞44h;(EM-2-,EPI+)组给予不同浓度的EPI作用于MDA-MB-231和SKBR3细胞48h,MTT检测细胞存活率。结果如图4中A所示,(EM-2+,EPI+)组与(EM-2-,EPI+)组相比,前者IC50值显著降低。随后,发明人继续验证EM-2(IC20)联合其他临床常用的乳腺癌化疗药物,如顺铂(DDP)、卡铂(CBP)、氟尿嘧啶(5-FU)和紫杉醇(PTX)是否同样具有增效抗肿瘤作用。结果如图4中B、C、D、E和表4所示,EM-2(IC20)联合5种常用化疗药物(EPI、DDP、CBP、5-FU、PTX)作用48h,其中EM-2(IC20)联合EPI具有显著的协同抗乳腺癌增殖作用,且增敏倍数最高,在MDA-MB-231和SKBR3细胞中分别增敏37.909和33.889倍。
通过实验发现,EM-2(IC20)联合EPI对乳腺癌细胞作用48h具有高效的抗肿瘤作用,下一步发明人使用MTT检测,EM-2(IC20)联合EPI作用24h和72h对乳腺癌细胞存活能力的影响。如图5中A、B和表5所示,EM-2(IC20)联合EPI在MDA-MB-231和SKBR3细胞作用24h和72h同样具有良好的抗肿瘤和增敏作用,分别增敏22.054、21.130、19.534、35.000倍。为了进一步确证EM-2联合EPI对MDA-MB-231和SKBR3细胞的增殖抑制效果,发明人进行了细胞克隆形成实验,结果如图5中C所示,分别使用DMSO(0.04%)、EM-2(0.5μM)、EPI(0.25μM)、EM-2(0.5μM)联合EPI(0.25μM)处理MDA-MB-231细胞7天和使用0.04%DMSO、EM-2(1μM)、EPI(0.1μM)、EM-2(1μM)联合EPI(0.1μM)处理SKBR3细胞7天,结果发现低浓度的EM-2联合EPI作用于MDA-MB-231和SKBR3细胞的克隆形成的抑制效果显著,细胞克隆数目也越来越少。以上结果说明,EM-2联合EPI具有高效的抗乳腺癌增殖作用。
据文献报道,通过不同的序贯给药方式,会使肿瘤细胞产生不同的效应。发明人使用MTT法检测,EM-2(IC20)联合EPI不同的给药方式作用于MDA-MB-231和SKBR3细胞48h的细胞毒性。结果如图6和表6所示,先给予EM-2作用4h后给予EPI作用44h(EM-2→EPI)组的给药方式,优于先给予EPI作用4h后给予EM-2作用44h(EPI→EM-2)组和EPI与EM-2同期作用48h(EPI+EM-2)组。各联合处理组的方差分析显示差异有统计学意义,(EM2→EPI)、(EPI→EM-2)和(EPI+EM-2)组均较(EM-2-,EPI+)组具有统计学意义(p<0.001)。
结果说明,EM-2(IC20)联合EPI不同的给药方式对乳腺癌MDA-MB-231和SKBR3细胞具有不同的增殖抑制效果,其中EM2→EPI的序贯给药方式对乳腺癌细胞具有最显著的增殖抑制作用,且增敏倍数最高。
随后,发明人通过western blot实验检测EM-2分别作用于MDA-MB-231和SKBR3细胞24h后Caspase家族蛋白表达量的变化。结果如图7所示,随着EM-2浓度的提升,Caspase-9、Caspase-3、PARP的蛋白表达下降,而CL-Caspase-9、CL-Caspase-3和CL-PARP的蛋白水平上升。结果说明EM-2通过Caspase依赖性通路诱导MDA-MB-231和SKBR3细胞发生凋亡。
发明人还使用Annexin V-FITC/PI双染色检测细胞凋亡水平,研究EM-2联合EPI是否通过Caspase依赖性通路增加细胞凋亡。结果如图8中A、B所示,相比(EM-2-,EPI+)组,(EM-2+,EPI+)组能明显增加乳腺癌细胞的凋亡率,MDA-MB-231细胞凋亡率从11.29%上升至36.36%,SKBR-3细胞凋亡率从37.86%上升至52.44%。接着,发明人进一步从蛋白水平检测EM-2联合EPI作用MDA-MB-231和SKBR3细胞24h后Caspase家族蛋白的表达量变化。结果如图8中C所示,Caspase-9、Caspase-3和PARP的蛋白表达下降,而CL-Caspase-9、CL-Caspase-3和CL-PARP的蛋白水平上升。说明EM-2联合EPI可以显著激活乳腺癌细胞的Caspase级联反应。同时,Z-VAD-FMK是Caspase家族蛋白的抑制剂,发明人先使用终浓度为20μM的Z-VAD-FMK预处理MDA-MB-231和SKBR3细胞4h,再使用EM-2联合EPI处理24h,westernblot检测总Caspase蛋白的表达水平。结果如图8中D所示,Z-VAD-FMK能够逆转EM-2联合EPI导致的Caspase-9、Caspase-3和PARP的切割和CL-Caspase-9、CL-Caspase-3和CL-PARP激活。最后,发明人通过MTT检测,药物处理后各分组的细胞活力。实验结果如图8中E所示,(Z-VAD-FMK-,(EM2+EPI)+)组与(Z-VAD-FMK+,(EM2+EPI)+)组相比,后者的细胞活性更高。
以上实验说明,在总Caspase抑制剂的作用下,EM-2联合EPI所引起MDA-MB-231和SKBR3细胞凋亡的程度得到逆转,进一步说明,EM-2联合EPI通过Caspase依赖性通路诱导乳腺癌细胞发生凋亡。
结论:(1)EM-2对乳腺癌细胞具有增殖抑制作用。(2)EM-2的IC20浓度联合5种化疗药物(EPI、DDP、CBP、5-FU、PTX)作用48h,其中EM-2(IC20)联合EPI具有显著的协同抗乳腺癌细胞增殖作用,且增敏倍数最高,在MDA-MB-231和SKBR3细胞中分别增敏37.909和33.889倍。(3)EM-2(IC20)联合EPI在MDA-MB-231和SKBR3细胞作用24h和72h同样具有良好的抗肿瘤和增敏作用,分别增敏22.054、21.130、19.534、35.000倍。(4)EM-2(IC20)联合EPI不同的序贯给药方式对乳腺癌MDA-MB-231和SKBR3细胞具有不同的增殖抑制效果,其中EM2→EPI(给予EM-2作用4h,再加入EPI作用44h)的序贯给药方式对乳腺癌细胞具有最显著的增殖抑制作用,且增敏倍数最高。(5)EM-2通过Caspase依赖性通路诱导乳腺癌细胞发生凋亡。(6)EM-2联合EPI通过Caspase依赖性通路诱导乳腺癌细胞发生凋亡。
实施例3
通过Western blot实验研究EM-2和/或EPI对乳腺癌细胞自噬的影响。发明人通过免疫印迹验证EM-2对MDA-MB-231和SKBR3细胞自噬流的影响。结果如图9中A、B所示,LC3-II型蛋白和p62表达水平呈浓度和时间依赖性增加,而Beclin-1蛋白表达水平基本不变,说明EM-2通过阻断乳腺癌细胞的自噬流,诱导不完整自噬的发生。
随后,发明人通过Western blot验证EM-2联合EPI对乳腺癌细胞自噬流的影响。Western blot结果如图10所示,发明人用EM-2分别作用于MDA-MB-231和SKBR3细胞4h后,再加入EPI继续培养20h。与(EPI+、EM-2-)组相比,(EPI+、EM-2+)组中p62和LC3-II的表达水平升高,这说明EM-2作用类似自噬阻断剂(Baf-A1、CQ),联合EPI通过阻断自噬流诱导不完整自噬的发生,提高乳腺癌MDA-MB-231和SKBR3细胞对EPI的敏感性。
综上所述:(1)EM-2阻断乳腺癌细胞的自噬流。(2)EPI激活乳腺癌细胞的自噬。(3)EM-2通过阻断自噬流诱导不完整自噬的发生,提高乳腺癌MDA-MB-231和SKBR3细胞对EPI的敏感性。
实施例4
发明人通过DCFH-DA探针检测、western blot、Annexin V-FITC/PI染色、MTT、NAC阻断实验研究EM-2和/或EPI对乳腺癌细胞内ROS的水平以及DNA损伤的影响。
发明人使用流式细胞仪检测EM-2、EPI、EM-2联合EPI分别作用于MDA-MB-231和SKBR3细胞24h后,细胞内ROS水平的变化,结果如图11中A、B所示,EM-2和EPI均能提高MDA-MB-231和SKBR3细胞内的平均荧光强度,二者联合作用时,细胞内的平均荧光强度分别由4888升高至13003;2706上升至13535。说明EM-2联合EPI增加乳腺癌细胞内ROS的水平。
为了进一步探究EM-2和EPI是否诱导MDA-MB-231和SKBR3细胞发生DNA损伤,我们使用EM-2和EPI分别作用于MDA-MB-231和SKBR3细胞2,4,8h,western blot检测γ-H2AX蛋白的表达水平。γ-H2AX是DNA发生双链断裂(double-stranded breaks,DSBs)时位于断裂点附近的组蛋白H2AX产生的磷酸化形式,是检验DNA双链断裂和细胞DNA损伤的金标准。结果如图12中A、B所示,γ-H2AX表达随着EM-2和EPI作用于乳腺癌细胞呈时间依赖性增加。接着,发明人检测DNA损伤相关通路蛋白的表达水平,结果如图12中C、D所示,p-ATM、p53和γ-H2AX蛋白的表达水平随着EM-2和EPI浓度的增加呈浓度依赖性增加,说明EM-2和EPI均能诱导MDA-MB-231和SKBR3细胞发生DNA损伤。
之后,发明人探究了EM-2联合EPI对乳腺癌的抗肿瘤作用是否通过增加细胞内ROS的水平从而诱发DNA损伤。发明人使用western blot检测EM-2联合EPI作用于MDA-MB-231和SKBR3细胞2,4,8h,γ-H2AX蛋白的表达水平。结果如图13中A所示,γ-H2AX呈时间依赖性增加。接着如图13中B所示,EM-2联合EPI作用于乳腺癌细胞时,DNA损伤相关蛋白p-ATM、p53和γ-H2AX的表达水平明显增加,说明EM-2联合EPI诱导乳腺癌细胞发生DNA损伤。随后,发明人使用终浓度为10μM抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸(NAC)对MDA-MB-231和SKBR3细胞进行预处理4h,然后用EM-2联合EPI处理24h,检测γH2AX、p53和PARP蛋白的表达变化。免疫印迹实验结果如图13中C所示,NAC能明显逆转EM-2联合EPI诱导的p53、γ-H2AX和CL-PARP蛋白的激活,同时PARP表达增加。然后发明人使用MTT检测NAC与EM-2联合EPI处理48h后细胞的存活情况,如图13中D所示,EM-2联合EPI促进的细胞存活率可以被NAC所逆转。最后,发明人使用流式细胞仪检测细胞凋亡水平,如图13中E、F所示,相比((EM-2+EPI)+,NAC-)组,((EM-2+EPI)+,NAC+)组能明显减少乳腺癌细胞的凋亡率,MDA-MB-231细胞凋亡率从22.24%下降至11.01%,SKBR-3细胞凋亡率从91.37%下降至77.29%。因此,以上实验说明,EM-2联合EPI的抗肿瘤作用,通过增加乳腺癌细胞内ROS的积累诱发DNA损伤。
综上所述,(1)EM-2联合EPI增加乳腺癌细胞内ROS的水平。(2)EM-2诱导乳腺癌细胞发生DNA损伤。(3)EPI诱导乳腺癌细胞发生DNA损伤。(4)EM-2联合EPI通过增加乳腺癌细胞内ROS的积累诱发DNA损伤。
实施例5
发明使用MTT检测EM-2对MDA-MB-231/EPI细胞(EPI耐药的MDA-MB-231乳腺癌细胞)的作用,如图14中A所示,EM-2作用于MDA-MB-231/EPI细胞48h的IC20为4.191±0.323μM,IC50为10.078±0.636μM,说明EM-2同样对MDA-MB-231/EPI细胞具有增殖抑制作用。接着,发明人用western blot检测不同浓度的EM-2作用MDA-MB-231/EPI细胞24h后Caspase家族蛋白的表达量变化。结果如图14中B所示,随着EM-2浓度的提升,Caspase-9、Caspase-3和PARP的蛋白表达下降,而CL-Caspase-9、CL-Caspase-3和CL-PARP的蛋白水平上升。说明EM-2诱导MDA-MB-231/EPI细胞发生Caspase依赖性凋亡。
以上实验说明,EM-2同样对MDA-MB-231/EPI细胞具有增殖抑制作用,并诱导MDA-MB-231/EPI细胞发生Caspase依赖性凋亡。
基于EM-2(IC20)联合EPI对乳腺癌MDA-MB-231和SKBR3细胞具有高效的抗肿瘤作用,发明人猜想EM-2(IC20)与EPI联用有望逆转乳腺癌细胞对EPI耐药。首先,采用MTT法检测MDA-MB-231/EPI细胞对EPI的耐药程度。结果如图15中A所示,EPI作用于MDA-MB-231/EPI细胞48h的IC50为2.499±0.174μM,而MDA-MB-231细胞的IC50为0.417±0.056μM,较基础水平增加5.993倍,证明MDA-MB-231/EPI细胞是EPI耐药细胞。接着,验证EM-2联合EPI对耐药细胞的影响,EM-2(IC20)作用于MDA-MB-231/EPI细胞4h,再加入不同浓度的EPI继续培养细胞44h,MTT检测细胞的存活率。如图15中B、C所示,(EM-2+,EPI+)组的IC50为0.095±0.019μM,比较(EM-2-,EPI+)组的IC50为2.499±0.174μM,联合增敏26.305倍。
为了进一步确证EM-2联合EPI对MDA-MB-231/EPI细胞的增殖抑制效果,发明人进行了细胞克隆形成实验。如图15中D所示,发明人分别使用0.04%的DMSO、EPI(1μM)、EM-2(1μM)、EM-2(1μM)联合EPI(1μM)作用于MDA-MB-231/EPI细胞7天,发现EM-2联合EPI作用时,细胞克隆形成的抑制效果显著,细胞克隆数目显著减少。随后,发明人验证EM-2联合EPI对MDA-MB-231/EPI细胞凋亡的影响。如图15中E、F所示,Annexin V-FITC/PI双染色检测细胞凋亡水平,相比(EM-2-,EPI+)组,(EM-2+,EPI+)组能明显增加MDA-MB-231/EPI的凋亡率,细胞凋亡率从10.48%上升至25.83%。Western blot检测EM-2联合EPI作用于MDA-MB-231/EPI细胞24h,Caspase家族蛋白的表达量变化。结果如图15中G所示,EM-2联合EPI作用于MDA-MB-231/EPI细胞时,Caspase-9、Caspase-3和PARP的蛋白表达下降,而CL-Caspase-9、CL-Caspase-3和CL-PARP的蛋白水平上升。同时,如图15中H所示,Z-VAD-FMK(20μM)能够逆转EM-2联合EPI导致的Caspase-9、Caspase-3和PARP的切割和CL-Caspase-9、CL-Caspase-3和CL-PARP激活。最后,MTT结果如图15中I所示,Z-VAD-FMK(20μM)能逆转EM-2联合EPI作用于MDA-MB-231/EPI细胞48h的细胞存活率。说明,EM-2联合EPI通过诱导MDA-MB-231/EPI细胞发生Caspase依赖性凋亡。
以上实验说明,EM-2联合EPI对MDA-MB-231/EPI细胞同样具有高效的抗肿瘤作用,EM-2提高MDA-MB-231/EPI细胞对EPI的敏感性,诱导细胞发生Caspase依赖性凋亡并逆转MDA-MB-231/EPI细胞对EPI耐药。
上述结果提示:(1)EM-2抑制MDA-MB-231/EPI细胞增殖并诱导凋亡。(2)EM-2(IC20)联合EPI对MDA-MB-231/EPI细胞同样敏感,联合作用时增敏26.305倍,并逆转MDA-MB-231细胞对EPI的耐药。(3)EM-2联合EPI诱导MDA-MB-231/EPI细胞发生Caspase依赖性凋亡。
综上所述:1.EM-2(IC20)联合EPI对乳腺癌MDA-MB-231和SKBR3细胞具有高效的抗肿瘤增殖及诱导凋亡作用。(1)EM-2(IC20)联合5种化疗药物(EPI、DDP、CBP、5-FU、PTX)作用48h,其中EM-2(IC20)联合EPI具有显著的协同抗乳腺癌细胞增殖作用,且增敏倍数最高,在MDA-MB-231和SKBR3细胞中分别增敏37.909和33.889倍。(2)EM-2(IC20)联合EPI在MDA-MB-231和SKBR3细胞作用24h和72h同样具有良好的抗肿瘤和增敏作用,分别增敏22.054、21.130、19.534、35.000倍。(3)EM-2(IC20)联合EPI不同的序贯给药方式对乳腺癌MDA-MB-231和SKBR3细胞具有不同的增殖抑制效果,其中EM2→EPI的序贯给药方式对乳腺癌细胞具有最显著的增殖抑制作用,且增敏倍数最高。
2.EM-2联合EPI通过以下途径发挥抗肿瘤作用:(1)EM-2联合EPI通过阻断自噬流诱导不完整自噬的发生,诱导乳腺癌细胞凋亡。(2)EM-2联合EPI通过持续激活内质网应激,诱导乳腺癌MDA-MB-231和SKBR3细胞发生Caspase依赖性凋亡。(3)EM-2联合EPI诱导的自噬流阻断,增加乳腺癌MDA-MB-231和SKBR3细胞内ROS的水平,从而诱发DNA损伤,促进细胞凋亡。
3.EM-2(IC20)不仅提高了乳腺癌MDA-MB-231和SKBR3细胞对EPI的敏感性,也提高了表阿霉素(EPI)耐药的乳腺癌MDA-MB-231/EPI细胞对EPI的敏感性,EM-2(IC20)联合EPI可以逆转MDA-MB-231/EPI细胞对EPI的耐药。
以上所述的实施例仅为阐述性例子,其描述较为具体和详细,但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是,对于本领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明构思的前提下,还可以做出若干变形和改进、修饰、替代、组合、简化,均应为等同的置换方式,这些都属于本发明的保护范围。
Claims (5)
5.根据权利要求4所述的药物组合物,其特征在于,其剂型选自:注射剂、片剂或胶囊。
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