WO2012100723A1 - 青蒿素b在制备抗肿瘤药物中的应用 - Google Patents

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于荣敏
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Yu Rongmin
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    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia

Definitions

  • the invention relates to the field of biomedicine, and particularly relates to an artemisinin compound, that is, the application of artemisinin B in the preparation of an antitumor drug.
  • Artemisinin is a sesquiterpene lactone compound containing a peroxy bridge structure extracted from the leaves of the genus Artemisia annua L. in 1971 by Chinese researchers. Since then, various artemisinin derivatives such as Art eSUna te, Dihydroartemisinin, and Artemether have been developed. These drugs have significant pharmacological effects against malaria, anti-schistosomiasis, and anti-toxoplasmosis.
  • artemisinin compounds also have anti-tumor effects: it can inhibit the growth of a variety of solid tumors, has obvious cytotoxicity against a variety of tumor cells, and has low toxicity to normal tissue cells, so artemisinins Compounds have become one of the hottest natural drugs currently studied internationally. Studies have shown that artemisinin compounds have certain inhibitory or killing effects on various tumor cells including leukemia, breast cancer, cervical cancer, ovarian cancer, gastric cancer, colon cancer, liver cancer, pancreatic cancer and lung cancer in vitro. . Previous studies have shown that leukemia and colon cancer cells are sensitive to artemisinin compounds, but not to small cell lung cancer cells (Efferth T, Dunstan H, Sauerbrey A, et al.
  • Artemisinin B is the most abundant juniper lactone in Artemisia annua L., and was reported in 1987 by Akihila et al. (Akhila A, Thakur RS, Popli SP. Biosynthesis of artemisinin in artemisiaannua [J]. Phytochemist, 1987, 26: 1 927). [3H, 1 C-22] Labeling (3RS) - Conversion of MVA to artemisinin and artemisinin B. Artemisinin B is an important intermediate in the biosynthesis of artemisinin. Brown (Brown GD. Cadinanes from Artemisia annua that may be intermediates in the biosythesis of artemisinin [J].
  • Artemisinin B shows good anti-tumor activity and low toxicity, and has potential development value as an anti-tumor drug.
  • a primary object of the present invention is to provide a novel use of an artemisinin compound, artemisinin B, in the preparation of an antitumor drug.
  • Another object of the present invention is to provide a process for the preparation of artemisinin B.
  • a further object of the present invention is to provide a method of application of artemisinin B.
  • An artemisinin compound, artemisinin B has the following structural formula:
  • a method for preparing artemisinin B comprising the steps of:
  • the Artemisia annua L. was soaked in acetone (petroleum ether-ethyl acetate, chloroform) for 48 hours, and the mixture was repeated twice.
  • the extracts were combined, evaporated to dryness under reduced pressure, and the residue was dissolved in chloroform.
  • the chloroform solution is extracted three times with 5% N C0 3 , and the extracted chloroform layer is replaced (Detailed Article 26) After evaporation to dryness, the obtained chloroform layer was separated by silica gel column chromatography.
  • the above artemisinin B can be used as a preparation of an antitumor drug.
  • the tumor is leukemia, liver cancer, cervical cancer, lung cancer, breast cancer, colon cancer, and gastric cancer.
  • artemisinin B has a specific inhibitory effect on proliferation, apoptosis and cell cycle of human tumor cells cultured in vitro, suggesting that it can be used for tumor treatment.
  • Artemisinin B can effectively inhibit the proliferation of cancer cells such as leukemia, liver cancer, cervical cancer, lung cancer, breast cancer, colon cancer and gastric cancer.
  • Artemisinin B is less toxic to normal cells and has a specific inhibitory effect only on cancer cells.
  • Methylazozolium salt Colorimetric assay for the inhibition of proliferation of eight tumor cell lines
  • each solid tumor cell line was treated with cisplatin as a positive control
  • K562 cell line was treated with Adriamycin (for injection).
  • Doxorubicin hydrochloride (ADR) was used as a positive control.
  • the proliferation inhibition effect of the drug on 8 tumor cell lines was examined by conventional methylazozolium salt (MTT) colorimetry.
  • Artemisinin B was first dissolved in DMSO to prepare a mother liquor of 100 mM, and stored at room temperature. The maximum final volume administered at the time of use was ⁇ 1%, which was diluted to a serial concentration with 1640 complete medium. Positive control drug concentration setting: cisplatin was 1.22
  • doxorubicin is 0.125, 0.25, 0.5, 1 ⁇ .
  • human cervical cancer cells Hela
  • human lung cancer cells A549)
  • human breast cancer cells MCF-7
  • human liver cancer cells HepG-2
  • human colon cancer cells HT-29
  • Human lung adenocarcinoma cells SPC-A-1
  • human gastric cancer cells SGC-1
  • a single cell suspension with a cell concentration of 2 ⁇ 10 5 /mL was seeded in 96-well plates at 100 ⁇ per well. Different concentrations of drug culture were added, and the experimental group, the positive control group, the negative control group and the blank group were respectively set, and each group had 3 duplicate wells.
  • the cells were cultured in a 37 ° C, 5% CO 2 incubator, and the growth of the cells was observed under an inverted microscope. After continuous culture for 48 h, add 5 mg/mL ⁇ 20 ⁇ per well, continue to culture for 4 h, add 200 ML DMSO per well, shake at room temperature and vortex at low speed, and read each well at 570 nm on an automatic reading microplate reader. The absorbance (OD) value at the location. The average of each well (OD) value was calculated and the half-inhibitory concentration (IC 5 o ) of the drug on the tumor cells was calculated.
  • the half-inhibitory concentration (IC 5Q ) of artemisinin B on different tumor cell lines is shown in Table 1 - Artemisinin B has a value of 1 ⁇ : 50 for each tumor cell line.
  • artemisinin B on human cervical cancer cells (Hda), human lung cancer cells (A549), human breast cancer cells (MCF-7), human hepatoma cells (He P G-2), human colon cancer cells (HT-29), human lung adenocarcinoma cells (SPC-A-1), human gastric cancer cells (SGC-1), and human chronic myeloid leukemia cells (K562) have obvious Inhibition of proliferation.
  • the IC 5 o value of artemisinin B on cancer cells is in the range of 16.03-174.2 ⁇ .
  • L-02 cells were treated with 18.75, 37.5, 75, 150, 300 ⁇ M of artemisinin for 48 h according to the method of experiment 1.1, and human embryonic hepatocytes L were determined by methyl azozolium salt (MTT) colorimetry.
  • MTT methyl azozolium salt
  • the experimental results are shown in Fig. 1.
  • Artemisinin 0 was prepared according to the method of experiment U, and ⁇ 562 cells were treated for 48 h. The apoptosis was detected by flow cytometry FITC-Annexin V/PI fluorescent double staining. Centrifuge at 1000 rpm/min for 5 min, and wash the cells twice with PBS at room temperature. The supernatant was removed, and the apoptosis buffer containing Annexin V and PI was added, mixed and incubated for 20 min in the dark, and immediately detected by flow cytometry. Based on the detection data of early and late apoptosis, the apoptotic rate AP was calculated and compared. The result is shown in Figure 2.
  • artemisinin B can block K562 cells in GQ/phase, thereby inhibiting tumor cell proliferation.
  • artemisinin B has a function of inhibiting cell proliferation, inducing apoptosis, and arresting cells in VG phase of human chronic myeloid leukemia cells.
  • the artemisinin compound artemisinin B of the present invention can be used for the preparation of anti-tumor, particularly human cervical cancer cells (Hela), human lung cancer cells (A549), human breast cancer cells (MCF-7). , drug combination of human hepatoma cells (HepG-2), human colon cancer cells (HT-29), human lung adenocarcinoma cells (SPC-A-1) and human chronic myeloid leukemia cells (K562) Things.
  • the artemisinin B of the present invention can also be used as an active ingredient of an antitumor pharmaceutical composition, or can be formulated into various pharmaceutically acceptable solid preparations with other pharmaceutically acceptable compounding agents and excipients.
  • the invention includes solid preparations such as tablets, soft capsules, pellets, film coating preparations, hard capsules and the like.

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Description

青蒿素 B在制备抗肿瘤药物中的应用
技术领域
本发明涉及生物医药领域， 具体涉及一种青蒿素类化合物， 即青蒿素 B在制备抗肿瘤药 物中的应用。
背景技术
恶性肿瘤是常见的且严重威胁人类生命和生活质量的主要疾病之一， 2000年全球新发 癌症病例约为 1000万， 死亡 620万， 现患病例 2240万。 20世纪后期近 30年以来癌症病发 率一直呈上升趋势，按目前趋势世界卫生组织 (WHO)预测，至 2020年随着全球人口达 80亿， 将有 2000万新发癌症病例， 其中死亡人数将达到 1200万， 癌症将成为新世纪人类的第一杀 手。 统计表明， 我国常见人类生命健康的恶性肿瘤有： 肺癌、 胃癌、 食管癌、 肠癌、 肝癌、 宫颈癌、 乳腺癌、 白血病、 恶性淋巴瘤、 鼻咽癌等十大肿瘤。 化疗、 放疗、 手术治疗是当今 治疗肿瘤的主要手段， 但毒副作用较大。 能否找到既能杀伤肿瘤细胞， 毒副作用又比较小的 药物及治疗方法在肿瘤治疗中显得尤其重要。 目前恶性肿瘤的药物治疗以化学药品为主， 但 化学药品的开发费用昂贵， 毒副作用大， 多有不同程度的致突变性。 因此， 人们把目光转向 天然抗肿瘤药物的研发上， 试图从天然成分中寻找毒副作用小、 作用独特的抗肿瘤药物。
青蒿素 (Artemisinin)是我国研究人员 1971年从菊科植物黄花蒿叶中提取分离到的一种含 有过氧桥结构的倍半萜内酯类化合物。 此后陆续开发出青蒿琥酯 (ArteSUnate)、 双氢青蒿素 (Dihydroartemisinin), 蒿甲醚 (Artemether)等多种青蒿素衍生物。 这类药物具有显著的抗疟疾、 抗血吸虫、 抗弓形虫等药理作用。
近年研究表明青蒿素类化合物也具有抗肿瘤的作用： 它可以抑制多种实体瘤生长，对多 种肿瘤细胞有明显的细胞毒性， 且对正常组织细胞的毒性很低， 因此青蒿素类化合物已经成 为了目前国际上研究的热点天然药物之一。研究表明，青蒿素类化合物在体外对包括白血病、 乳腺癌、 宫颈癌、 卵巢癌、 胃癌、 结肠癌、 肝癌、 胰腺癌、 肺癌等在内的多种肿瘤细胞都具 有一定的抑制或杀伤作用。 以往研究显示， 白血病及结肠癌细胞对青蒿素类化合物敏感，而非 小细胞肺癌细胞对其耐受 （Efferth T, Dunstan H， Sauerbrey A ,et al. The anti-malarial artesunate is also active against cancer[J].Int J Oncol,2001, 18(4):767-773. ) , 提示青蒿素类化合物对不同组 织来源的肿瘤细胞具有一定的选择杀伤性， 但具体机制尚未完全明确。 Hou (Hou JM, WangD S, ZhangRW, WangH. Experimental therapy of hepatoma with artemisinin and its derivatives: in vitro and in vivo activity, cheraosensitization, and mechanisms of action [J]. Clin CancerRes, 2008,14(17): 5519-30. )等证明青蒿琥酯和二氢青蒿素都能有效引发肝癌 HepG-2细胞和 Hep3B
1
替换页（细则第 26奈） 细胞 Go/G,期阻滞,引起肿瘤细胞凋亡。
青蒿素 B是黄花蒿中最丰富的杜松交酯， 1987年 Akihila等（Akhila A,Thakur RS,Popli SP. Biosynthesis of artemisinin in artemisiaannua[J].Phytochemist, 1987,26: 1 927)报道了 [3H, 1 C-22] 标记 （3RS ) -MVA到青蒿素和青蒿素 B的转化。 青蒿素 B是青蒿素生物合成过程中的重要 中间体， 1996年 Brown (Brown GD. Cadinanes from Artemisia annua that may be intermediates in the biosythesis of artemisinin[J].Phytochemistry，1994，36(3):637-641 )从青蒿的地上生长部分中分 离出了新颖的开环杜松垸和二羟基杜松交酯， 用 和 13CN R光谱学鉴定了其结构， 并提 出了由青蒿素 B和青蒿酸通过二羟基杜松交酯和 4,5开环杜松垸的醇烯互变体生物合成青蒿 素的机理。 目前未见关于青蒿素 B抗肿瘤活性的报道。
青蒿素由于在油中和水中的溶解度低、难以制成合适的剂型等不足，对其结构迸行改造， 寻找合适的青蒿素衍生物工作成为当今研究的热点。 目前已发现不少抗疟抗肿瘤活性更高的 衍生物。 我们的前期研究结果显示： 青蒿素 B显示出良好的抗肿瘤活性和较低的毒性， 具有 作为抗肿瘤药物潜在的开发价值。
发明内容 本发明的首要目的在于提供了一种青蒿素类化合物， 即青蒿素 B在制备抗肿瘤药物中的 新用途。
本发明的另一目的在于提供青蒿素 B的制备方法。
本发明的再一目的在于提供青蒿素 B的应用方法。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种青蒿素类化合物青蒿素 B， 结构式如下图：
Figure imgf000004_0001
青蒿素 B的制备方法， 其特征在于包括以下步骤：
黄花蒿用丙酮 （石油醚 -乙酸乙酯， 氯仿）浸泡提取 48小时， 重复 2次， 提取液合并， 减压蒸干， 回收丙酮， 残渣用氯仿溶解。 氯仿液用 5%的 N C03萃取 3次， 萃取后的氯仿层 替换页 (细则第 26奈） 蒸干， 得到的氯仿层样品用硅胶柱层析分离， 石油醚-乙酸乙酯梯度洗脱。 合并得到的青蒿素
B粗品， 用石油醚结晶， 即得青蒿素 B纯品。
上述青蒿素 B可用作制备抗肿瘤药物。
所述肿瘤为白血病、 肝癌、 宫颈癌、 肺癌、 乳腺癌、 结肠癌和胃癌。
本发明通过药理药效学实验证明， 青蒿素 B对体外培养的人肿瘤细胞具有特异性的抑制 增殖、 诱导凋亡、 影响细胞周期等作用， 提示可以用于肿瘤治疗。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及有益效果：
( 1 )青蒿素 B 能有效抑制白血病、 肝癌、 宫颈癌、 肺癌、 乳腺癌、 结肠癌和胃癌等癌 细胞的增殖。
(2)青蒿素 B对正常细胞的毒性较低， 仅对癌细胞具有特异性的抑制作用。
( 3 )青蒿素 B的水溶性较好， 生物利用度高。 附图说明 图 1、 青蒿素 B对正常细胞株 L-02的毒性作用的结果图； 图 2、流式细胞术分析青蒿素 B不同浓度处理组对 K562细胞凋亡的影响 (X土 S.D.,n=3;vS空白 对照， /^Ο. Οδ, ^/^Ο. ΟΙ), 其中 Α图为流式图， B图为各处理组凋亡比率趋势图； 图 3、流式细胞术分析青蒿素 B不同浓度处理组 K562细胞各期分布 (X土 S.D.,n=3;VS空白对照， *^<0. 05, **P<0. 01), 其中 A图为流式图， B图为各处理组细胞周期分布图。
具体实施方式 下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述。 以下是本发明的药理药效学实验及结果。 实验所用细胞系均购自美国 ATCC公司， 并由 暨南大学药学院天然产物化学教研室保存。 实验所用青蒿素 B由上述方法制备。 实施例 1、 青蒿素 B体外对肿瘤细胞特异性的增殖抑制作用
1.1 甲基偶氮唑盐 （MTT) 比色法测定药物对 8种肿瘤细胞株的增殖抑制作用 在本实验中， 各实体瘤细胞株以顺铂为阳性对照， K562细胞株以 Adriamycin (注射用盐 酸多柔比星 ADR)为阳性对照， 采用常规的甲基偶氮唑盐（MTT) 比色法考察了药物对 8种 肿瘤细胞株的增殖抑制作用。
先将青蒿素 B用 DMSO溶解配置成 100 mM 的母液， 常温储存。 使用时给药的最大终 体积≤1%，用 1640完全培养基将其稀释成系列浓度。阳性对照药物浓度设定：顺铂均为 1.22、
替换页（细则第 2 6条) 3.67、 11.1 Κ 33.33μΜ,阿霉素为 0.125、 0.25、 0.5、 1μΜ。取对数生长期的人宫颈癌细胞（Hela)、 人肺癌细胞（A549)、人乳腺癌细胞（MCF-7)、人肝癌细胞（HepG-2)、人结肠癌细胞 (HT-29)、 人肺腺癌细胞（SPC-A-1 )和人胃癌细胞（SGC-1 )用完全培养基调整细胞浓度为 4xl04个 /mL 的单细胞悬液， 人慢性髓细胞白血病细胞（K562)调整细胞浓度为 2χ105个 /mL的单细胞悬 液， 接种于 96孔板， 每孔 100 μί。 加入不同浓度药物培养， 分别设置实验组、 阳性对照组、 阴性对照组和空白组， 每组 3个复孔。置 37°C、 5%C02培养箱内培养， 倒置显微镜下观察细 胞生长情况。 连续培养 48 h后每孔加 5 mg/mL的 ΜΤΤ 20 μί， 继续培养 4 h后每孔加入 200 ML DMSO, 室温避光低速震荡后在自动读数酶标仪上读取各孔在 570 nm波长处的吸光度 (OD)值。 计算各孔（OD)值的平均数， 并计算药物对肿瘤细胞的半数抑制浓度（IC5o )。
青蒿素 B对不同肿瘤细胞株的半数抑制浓度（IC5Q )结果如表 1所示- 青蒿素 B对各肿瘤细胞株的 1<：50值
细胞系 ΙΟ50 (μΜ)
青蒿素 B 顺铂 Adriamycin
Hela 21.90±2.23 5.46±0.37
A549 62.21±7.07 4.50±0.80
MCF-7 73.62±6.25 12.85±1.23
HepG-2 24.33±2.98 12.65±1.10
HT-29 16.03±2.12 9.89±0.83
SPC-A-1 174.21±14.49 19.21±1.50
SGC-1 151.30±13.91 12.59±0.90
K562 21.11±0.55 0.27±0.12 由表 1的结果可见， 青蒿素 B对人宫颈癌细胞 （Hda)、 人肺癌细胞 （A549)、 人乳腺癌 细胞（MCF-7)、 人肝癌细胞（HePG-2)、 人结肠癌细胞 (HT-29)、 人肺腺癌细胞 （SPC-A-1 )、 人胃癌细胞 （SGC-1 )和人慢性髓细胞白血病细胞（K562) 都有明显的抑制增殖作用。 青蒿 素 B对癌细胞的 IC5o值在 16.03-174.2 ΙμΜ的范围内。
1.2青蒿素 Β对正常细胞人胚肝细胞 （L-02) 的体外毒性试验。
按实验 1.1的方法， 用 18.75、 37.5、 75、 150、 300 μΜ的青蒿素 Β处理 L-02细胞 48 h 后， 采用甲基偶氮唑盐 （MTT) 比色法测定人胚肝细胞 L-02的生长状况， 计算各孔（OD) 值的平均数， 按下述公式计算细胞存活率， 实验结果见图 1。
细胞存活率％=实验组 OD值 /阴性对照组 OD值 xl 00%
图 1结果显示， 正常细胞人胚肝细胞 L-02对青蒿素 B远远不如肿瘤细胞株对其敏感， 其
4
替换页（细则第 26奈) 半数抑制浓度 （IC5()) >300μΜ。 说明药物体外毒性很低。 因此， 青蒿素 Β对肿瘤细胞具有 特异性的增殖抑制作用。
实施例 2、 青蒿素 Β体外对人慢性髓细胞白血病细胞（Κ562) 的抗肿瘤实验
2.1 青蒿素 Β在体外诱导人慢性髓细胞白血病细胞 （Κ562)凋亡
按实验 U的方法， 分别配制好 0、 10、 20、 40μΜ的青蒿素 Β, 处理 Κ562细胞 48 h后， 采用流式细胞术 FITC-Annexin V/PI荧光双染检测细胞凋亡。 1000 rpm/min离心 5 min, 室温 下 PBS离心洗涤细胞两次。 去上清， 加 ΙΟΟμί含 Annexin V和 PI的凋亡缓冲液， 混匀后避 光孵育 20 min， 立即流式细胞仪检测。根据早期和晚期凋亡的检测数据， 计算凋亡率 AP， 并 进行分析比较。 结果如图 2所示。
图 2的结果显示， 青蒿素 B以剂量依赖的方式诱导细胞凋亡。 药物处理的细胞凋亡率均 高于对照组 6.67%，加药 48 h后 10 μΜ组， 20 μΜ组， 40 μΜ组的凋亡率分别为 10.06%、24.57% 和 41.2%。 因此， 青蒿素 Β在体外对 Κ562具有诱导凋亡作用， 即其具有抗肿瘤作用。
2.2青蒿素 Β体外影响人慢性髓细胞白血病细胞（Κ562) 的周期
按实验 L1的方法， 分别配制好 0、 10、 20、 40μΜ的青蒿素 Β， 处理 Κ562细胞 48 h后， 采用流式细胞术 PI单染检测药物对细胞周期的影响。 1000 rpm/min离心 5 tnin, 室温下 PBS 离心洗涤两次， 去上清， 用 300 含 10%胎牛血清的 PBS重悬细胞， 再逐滴加入 70%的冷 乙醇 700ML， 边加边轻轻振荡， 以防止细胞团块形成， 4'C固定过夜。 离心去上清， PBS进行 离心沉淀， 去除固定液。 加入适量 PBS制成细胞悬液， 加入 RNase使其终浓度为 50 g/mL， 37°C水浴消化 1 h， 再加入 PI (终浓度为 10 g/mL)染液混匀， 置 4°C避光 30 min, 1 h内上机。 检测前用 300目尼龙网筛过滤除去细胞团块， 每份 1 X 10s个细胞， 488 nm处显红色荧光。 检测并进行细胞周期分析比较。 结果如图 3所示。
图 3的结果显示， 加药处理后， 加药组细胞周期与对照组相比， Go/G,期细胞比例变化明 显，加药 48 h后 10 μΜ组， 20 μΜ组， 40 μΜ组的 Go/G,期细胞比例分别上升至 42%、 48.1% 、 59.8%, 相对于空白对照组具有显著差异。
因此， 青蒿素 B能将 K562细胞阻滞在 GQ/ 期， 从而抑制肿瘤细胞增殖。
综合实施例 1和实施例 2的体外实验结果可见， 青蒿素 B对于人慢性髓细胞白血病细胞 具有抑制细胞增殖、 诱导细胞凋亡、 阻滞细胞于 VG,期的作用。
综上所述， 本发明的青蒿素类化合物青蒿素 B， 可用于制备抗肿瘤， 特别是人宫颈癌细 胞（Hela)、 人肺癌细胞（A549)、 人乳腺癌细胞（MCF-7)、 人肝癌细胞（HepG-2)、 人结肠 癌细胞 (HT-29)、 人肺腺癌细胞（SPC-A-1 )和人慢性髓细胞白血病细胞（K562) 的药物化合 物。 本发明的青蒿素 B也可以作为抗肿瘤药物组合物的活性成分， 或与其他药用配合剂和或 赋形剂等制成各种药用固体制剂。 包括片剂、 软胶囊、 微丸、 薄膜包衣制剂、 硬胶囊等固体 制剂等。
6
替换页（细则第 26奈)

Claims

、 具有以 药物中的应用。
Figure imgf000009_0001
、 如权利要求 1所述的应用， 其特征在于， 所述肿瘤为白血病、 肝癌、 宫颈癌、 肺癌、 乳腺 癌、 结肠癌和胃癌等。
、 如权利要求 1所述， 青蒿素 B的制备过程。
、 药物组合， 包括青蒿素 B与其他药用配合剂、 赋形剂或载体等制成的各种药物组合。
替换页（细则第 26条)
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