KR20100026030A - 항암 유효성분 추출물, 그 추출방법 및 이를 이용한 항암제 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 세계적으로 약 350종의 쑥 중 아테미시닌(Artemisinin)을 유일하게 함유하고 있는 개똥쑥(Artemisia annua L)으로부터 추출되는 항암 유효성분 추출물, 그 추출방법 및 이를 이용한 항암제에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 개똥쑥에 포함되어 있는 아테미시닌(Artemisinin)과 그 유도 화합물들이 항암 생체반응에 대한 메카니즘(Mechanism)이 밝혀졌음에도 어떠한 방법으로 개똥쑥으로부터 유효성분을 추출할 것인가라는 문제에 대한 해결방안을 제시하고, 그 제시된 방안을 통해 추출된 추출물들의 배합으로 암세포에 대한 세포독성 효과가 높은 항암제를 제공할 수 있는 개똥쑥의 항암 유효성분 추출물, 그 추출방법 및 이를 이용한 항암제에 관한 것이다.
개똥쑥, 추출, 항암, 아테미시닌, 아테미신닌 산, 화합물, 유방암
Description
본 발명은 개똥쑥에 포함되어 있는 항암 활성성분의 추출에 대한 추출방법, 그 방법에 의해 추출된 추출물 및 이 추출물의 배합을 통해 조성된 혼합물을 유효성분으로 하는 항암제에 관한 것이다.
세계적으로 쑥은 약 350종이 자생하는 것으로 알려져 있으며, 그 중 약 1000년에 걸쳐 말라리아 감염을 치료하는 민간요법으로서 쑥 중 유일하게 개똥쑥이 사용되어 왔다.
1970년대 까지만 해도 중국군의 말라리아 사망자는 매년 2000명에 달할 정도로 가장 시급히 해결하여야할 국가적 과제였으며, 이에 군 직속 말라리아 연구소가 설립되어 본격적인 개똥쑥에 관한 현대적 연구가 본격화되어 세계가 놀랄 만한 연구 성과를 성취하게 되었다. 그러나 그 성과, 즉 수많은 쑥 종류들 중에서 유독 개 똥쑥에만 함유된 화합물인 아테미시닌(Artemisinin)을 세계 최초로 발견하게 되었으며 그 구조식도 밝히는 개가를 1980년대 말에 와서야 서방 세계에 알려 지게 되었다.
개똥쑥의 항말라리아 성분인 아테미시닌(Artemisinin)은 세스쿼터핀 락톤 페록사이드(sesquiterpene lactone peroxide)의 구조 화합물로 엔도페록사이드(endoperoxide) 기(moiety)를 포함하고 있고, 그 엔도페록사이드(endoperoxide) 기에 의한 화학작용이 말라리아 치료에 사용되고 있다.
상기 아테미시닌(Artemisinin)의 엔도페록사이드 메카니즘(endoperoxide mechanism)은 암세포 독성에 응용하여 항암제로서 활발한 연구가 진행되고 있으며, 이에 대한 첫 연구자는 워싱턴대학교(University of Washington) 연구자들이다.
현재 개똥쑥으로부터 추출분리한 화합물 중 항암치료제로 연구되고 있는 것에는 아테미시닌(Artemisinin) 및 이의 합성유도체 화합물이 있다.
개똥쑥에는 여러 종류의 터페노이드(terpenoids)와 플레보노이드(flavornoids) 화합물들이 함유되어 있다. 특히 아테아뉴인 B(arteannuin B)는 아테미시닌(Artemisinin) 함량에 비하여 많게는 약 20배 정도 많이 함유되어 있고, 아테미신닌 산(artemisinic acid)의 경우에는 약 1/5 - 1/3량이 함유되어 있다. 다시 말하면 개똥쑥 함유 화합물 중 90% 이상이 상기 세 가지 터페노이드(terpenoids)로 구성되어 있다는 것이다.
상기 아테미시닌(Artemisinin)의 암세포에 대한 독성은 괄목할 효과를 보이고 있으며,
다만 그 결과가 아테미시닌(Artemisinin)의 용해도(solubility of artemisinin: in water(0.46 ㎎/㎖, 37℃))가 낮아 Iron Transferin에 의한 페록사이드 메카니즘(peroxide mechanism)으로만 설명되고 있다. P-388, A-549, Ht-29, MCF-7 and KB tumour cells(P-388: Mouse Lymphocytic leukemia cell(쥐 백혈병 세포), A-549: Human lung carcinoma cell(인간 폐암 세포), Ht-29: Human colon cancer cell(인간 결장암 세포; 대장암 세포), MCF-7: Human breast cancer cell(인간 유방암 세포), KB: Human oral cancer cell(인간 구강암 세포))에 대한 효과가 특히 우수하며 백혈병, 골수암, 임파종에 대하여는 90% 이상의 치유효과가 보고되고 있다. 그러나 테르페노이드(terpenoids) 화합물 중 함량의 주종을 이루고 있는 디옥시아테미시닌(Deoxyartemisinin), 아테미신닌 산(artemisinic acid), 아테아뉴인 B(arteannuin B) 성분은 상기 암세포에 대한 독성 효과가 없다는 실험결과를 보고 하고 있다.[참고문헌: Henry Lai, Tomikazu Sasaki & Narendra P Singh; Ashley Publications (2005) 9(5):995-1007 및 Am.J.Trop.Med.Hyg.;The American Society of Tropical Medicine and Hygiene;70(2), 2004, pp.128-132]
1980년 이후 서방 세계에 아테미시닌(Artemisinin)이 알려진 이후 수많은 선진국에서 집중적으로 연구하여 왔으며 말라리아는 물론 종양(Tumor)에 탁월한 항암 작용이 있음이 학문적으로 밝혀졌고 또한 아테미시닌(Artemisinin)의 생체 내에서의 항암 대사작용(Metabolism)이 밝혀졌다.
현재 세계적 연구현황은 아테미시닌(Artemisinin)과 그 유도 화합물들의 항암 생체반응에 대한 메카니즘(Mechanism)은 거의 밝혀졌으나 두 가지 관문이 남아 있으며, 그 첫 번째 관문은 쑥에서 어떠한 방법으로 유효성분을 추출할 것인가의 문제이며, 두 번째 관문으로는 아테미시닌(Artemisinin)을 비롯하여 아테아뉴인 B(arteannuin B), 아테미신닌 산(artemisinic acid) 등의 플라즈마(plasma) 농도와 잔류시간 관계와 생체에 흡수되어 암세포를 죽일 수 있는 활성화 문제와 암세포에 집중적 공격 문제이다.
이미 알려진 결과는 아테미시닌(Artemisinin)이 플라즈마(plasma) 내에서 활성화되기 위하여는 Fe 이온이 필수적이다. 그러므로 현재의 중심과제는 Fe transferin의 물질을 찾는 것이다. 다시 말해 생체내부에서 흡수된 아테미시닌(Artemisinin)을 활성화하며 암세포까지에 전달시킬 수 있는 아테미시닌(Artemisinin) 활성 전달 유기결합담체(transferrin-targeted)를 찾는 일이다. 기존의 약물 전달 노하우(know-how)로서는 극히 해결하기 어려운 난제임에 틀림이 없다.
개똥쑥을 이용한 항암제에 대한 연구는 대한민국등록특허 10-0529600(공고일자 2005.11.22)에 개시된 바 있으나, 상기 특허는 개똥쑥에서 추출된 아테미시닌(Artemisinin)을 화학적으로 가수분해하여 얻어지는 디옥소아테미신닌 유사체를 합성하는 방법으로 이량체 혹은 삼량체로 합성하여 얻어지는 화합물의 항암특성에 관한 것으로서, 개똥쑥 자체의 자연 상태로 함유된 성분 중에서 아테미시닌(artemisinin), 아테미신닌 산(artemisinic acid), 아테아뉴인 B(arteannuin B)의 암세포독성과 이들 화합물들의 조합성분들의 암세포 독성에 대한 기술에 대해서는 개시하고 있지 않다.
본 발명의 목적은 개똥쑥의 아테미시닌(Artemisinin)과 그 유도 화합물들의 항암 생체반응에 대한 메커니즘(Mechanism)이 거의 밝혀졌음에도 추출이 용이하지 않은 개똥쑥의 항암 활성물질을 효율적으로 추출하기 위한 방법 및 그 추출물의 제공과, 그 추출된 추출물-아테미시닌(Artemisinin), 아테미신닌 산(Artemisinic acid) 및 아테아뉴인 B(arteanniun B)-의 배합에 의해 조성된 혼합물을 유효성분으로 하여, 암세포에 대한 독성효과가 높은 항암제의 제공에 있다.
특히 종래에는 이루어지지 않았던 개똥쑥 추출성분 중 아테미신닌 산(Artemisinic acid), 아테아뉴인 B(arteanniun B) 및 조합성분에 대한 유방암 세포독성 실험과 그 효과를 확인하고자 함에 있다.
상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 염화메틸렌을 이용하여 개똥쑥에서 추출되어 암세포 독성 효과가 있는 항암 유효성분 추출물과,
개똥쑥을 염화메틸렌(Dichloromethane)으로 환류추출(Reflux)하여 염화메틸렌 추출물을 얻는 단계와,
그 염화메틸렌 추출물을 실리카 칼럼 크로마토그래피에 넣고, 여기에 유기용매를 가하여 용출액을 얻은 다음 그 용출액으로부터 상기 실리카 칼럼 크로마토그래피를 통해 분획을 얻는 1차 분리단계와,
상기 분획을 고성능액체크로마토그래피(HPLC)를 이용하여 유효성분을 분리하는 2차 분리단계를 포함하는 개똥쑥의 항암 유효성분 추출 방법 및 그 추출된 추출물을 유효성분으로 하는 항암제를 발명의 주요 기술적 구성으로 한다.
상기 추출방법의 환류추출은 염화메틸렌(Dichloromethane)을 추출용매로 하여 최초 1회 3시간 동안 개똥쑥을 환류추출한 후 1시간씩 2회 환류추출하여 감압 여과한 후 그 여액을 40 ~ 60℃에서 감압농축한다.
그리고 1차 분리단계의 유기용매는 헥산(Hexane), 에틸아세테이트(Ethyl acetate) 또는 메틸알코올(Methyl alcohol) 중 선택되는 어느 1종 단독 또는 2종 이상의 혼합인 것을 사용한다.
또한, 상기 언급된 추출방법에 의해 추출된 유효성분은 하기 화학식 1의 분자량 282.1467의 아테미시닌(Artemisinin; C15H22O5), 하기 화학식 2의 분자량 248.14의 아테아뉴인(arteannuin B; C15H20O3), 하기 화학식 3의 분자량 234.16의 아 테미신닌 산(artemisinic acid ; C15H22O2)이다.
그리고, 개똥쑥의 추출물을 유효성분으로 하는 항암제는 상기 아테미시닌, 아테아뉴인 B 또는 아테미신닌 산의 어느 1종 단독 또는 2종 이상의 혼합으로 조성된 혼합물을 유효성분으로 하여 제조되거나,
또는 상기 아테미시닌, 아테아뉴인 B, 아테미신닌 산 외에 개똥쑥 추출과정에서 추출가능한 디하이드로아테미신닌 산(Dihydroartmisinic acid), 알파-에폭시디하이드로아테미신닌 산(a-Epoxydihydroartemisinic acid), 아테아뉴인 L(Arteannuin L), 아테아뉴인 N(Arteannuin N), 디하이드로아테아뉴인 B(Dihydroarteannuin B), 3,3',7-트리메틸케르세틴(3,3',7-Trimethylquercetin), 3,4',7-트리메틸케르세틴(3,4',7-Trimethylquercetin)으로 부터 선택되는 어느 1종 단독 또는 2종 이상의 혼합으로 조성된 혼합물을 유효성분으로 하여 제조된다.
좀더 구체적으로 상기 항암제의 성분 간 혼합비율을 살펴보면, 아테미신닌(Artemisinin) 1 ~ 99wt%, 아테아뉴인 B(arteannuin B) 1 ~ 99wt%의 혼합으로 조 성되거나,
아테미시닌(Artemisinin) 1 ~ 99wt%, 아테미신닌 산(artemisininic acid) 1 ~ 99wt%의 혼합으로 조성되거나,
아테아뉴인 B(arteannuin B) 1 ~ 99wt%, 아테미신닌 산(artemisininic acid) 1 ~ 99wt%의 혼합으로 조성되거나,
또는 아테미시닌(Artemisinin) 1 ~ 98wt%, 아테아뉴인 B(arteannuin B) 1 ~ 98wt%, 아테미신닌 산(artemisininic acid) 1 ~ 98wt%의 혼합으로 조성된다.
그리고, 아테미시닌(Artemisinin) 1 ~ 91wt%, 디하이드로아테미신닌 산(Dihydroartmisinic acid) 1 ~ 91wt%, 아테미신닌 산(Artemisinic acid) 1 ~ 91wt%, 알파-에폭시디하이드로아테미신닌 산(a-Epoxydihydroartemisinic acid) 1 ~ 91wt%, 아테아뉴인 L(Arteannuin L) 1 ~ 91wt%, 아테아뉴인 N(Arteannuin N) 1 ~ 91wt%, 디하이드로아테아뉴인 B(Dihydroarteannuin B) 1 ~ 91wt%, 아테아뉴인 B(Arteannuin B) 1 ~ 91wt%, 3,3',7-트리메틸케르세틴(3,3',7-Trimethylquercetin) 1 ~ 91wt%, 3,4',7-트리메틸케르세틴(3,4',7-Trimethylquercetin) 1 ~ 91wt%의 혼합으로 조성된다.
이상에서 살펴본 바와 같이, 본 발명에 따른 개똥쑥의 유효성분 추출방법은 종래 추출이 어려웠던 개똥쑥의 유효성분, 즉 아테미시닌(Artemisinin), 아테아뉴 인 B(arteannuin B), 아테미신닌 산(artemisinic acid)을 용이하게 추출할 수 있고, 이와 같은 성분들은 암세포, 특히 유방암세포(MCF-7)에 대한 세포독성이 강한 것으로 이들 물질의 혼합으로 조성된 혼합물을 유효성분으로 하는 항암제는 세포독성효과가 매우 뛰어나다는 효과를 갖는다.
이하, 상기 기술적 구성을 더욱 구체적인 내용을 통해 살펴보고자 한다.
실시 예 1 : 개똥쑥의 유효성분 분리
< 환류추출(Reflux) >
환류추출을 통해 개똥쑥 성분 추출이 이루어지며, 그 환류추출 과정은 건조 중량이 862g인 개똥쑥(Artemisia annua)을 염화메틸렌(Dichloromethane)으로 최초 1회 3시간 동안 환류추출한 후, 다시 1시간씩 2회 환류추출하여 감압 여과한 후 그 여액을 40 ~ 60℃에서 감압농축하여 염화메틸렌 추출물(crude extract) 57.8g을 얻는다.
<1차 분리과정>
상기 염화메틸렌 추출물 57.8g 중 선택된 25.3g을 실리카 칼럼 크로마토그래피(Vacuum Silica gel flash column chromatography)를 통해 분획을 얻는다.
좀더 구체적으로는, 염화메틸렌 추출물 25.3g을 실리카 칼럼 크로마토그래피에 넣고, 여기에 유기용매를 가하여 용출액을 얻은 다음 그 용출액으로부터 상기 실리카 칼럼 크로마토그래피를 통해 9개의 분획을 얻게 된다. 이때 사용되는 유기용매의 분획 별 조건은 다음의 표 1과 같다.
표 1.
분획별
용매조건(각 용매별 700
mL
)
| 분획 | 헥산 (Hexane) | 아세트산 에틸 (Ethyl acetate) | 메틸 알코올 (Methyl alcohol) |
| Fr1 | 10 | 1 | - |
| Fr2 | 5 | 1 | |
| Fr3 | 2.5 | 1 | |
| Fr4 | 1 | 1 | |
| Fr5 | 0 | 1 | |
| Fr6 | - | 20 | 1 |
| Fr7 | 10 | 1 | |
| Fr8 | 5 | 1 | |
| Fr9 | 0 | 1 |
그리고, 상기 1차 분리과정을 통해 얻게 된 9개의 분획은 아래의 표 2와 같다.
여기에서 분획물의 분획원리는 기본적으로 분자량의 크기가 비슷한 화합물들이 일정 분획물에 함께 포함분리되므로 이를 재차 각각의 화합물로 분리하기 위하여는 time-lap을 늘려 재차 각 분획을 수집하게 되며, 시간차이를 두어 분리하는 분획물 중에는 성분화합물이 전혀 포함되지 않은 분획이 생기기도 하며, 분획 중 아무 성분도 없는 것은 화합물이 표시되지 않는다.
표 2. 1차 분리과정을 통해 얻은 분획
| 순번 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 |
| 분획 | Fr1 | Fr2 | Fr3 | Fr4 | Fr5 | Fr6 | Fr7 | Fr8 | Fr9 |
| 중량 | 5.1g | 5.0g | 1.2g | 1.9g | 1.4g | 1.1g | 0.5g | 0.4g | 0.6g |
상기 1차 분리과정을 통해 얻은 표 2의 9개의 분획에 대해 고성능 액체크로마토그래피(High Perfomance Liquid Chromatography; HPLC)를 통해 분석한 결과, 2번 및 3번 분획이 다양한 세스쿼터핀(sesquiterpene)을 함유함을 알 수 있었다.
따라서, 상기 2번 및 3번 분획으로부터 테르펜류(terpenoid) 분리를 위한 분리과정을 다시 수행한다.
<2차 분리과정>
2차 분리과정은 1차 분리과정의 2번 및 3번 분획에 대해 이루어진다.
상기 2번 분획은 총 5.0g 중 0.2g만을 선택하여 분리를 수행한다. 이때 분리장치는 Prep HPLC(Gilson사)을 이용하며, Prep HPLC의 분석조건으로는 isocratic 80% 아세토니트릴(acetonitrile)(0.1% 트리플르오르아세트산(TFA)을 섞은 물)을 전처리용 이동 상으로 사용하여 유속(Flow rate) 7.0 ㎖/min으로 흘려주어 R1 검출기(Detector)를 이용하여 파장을 측정하고, 칼럼은 Luna 15μ C18(2) 100A 칼럼으로 한다. 2번 분획 0.2g에 대한 Prep HPLC(Gilson사)의 크로마토그램(Chomatogram)은 도 1과 같다.
상기 2번 분획에 대한 분리과정을 통하여 얻은 지방산 유도체 및 일반 페놀성 화합물을 제외하고, 3종의 세스쿼터핀을 확보하였으며 이는 아래의 표 3과 같다.
표 3. 표 1의 2번 분획에 대한 3종의
세스쿼터핀
| 순번 | 1 | 2 | 3 |
| 분획 | Fr2-9 | Fr2-13 | Fr2-14 |
| 중량 | 23.9mg | 7.4mg | 6.5mg |
| 화학식 |  |
 |
 |
다음으로, 상기 3번 분획 1.2g에 대한 분리를 수행하는 것으로, 그 분리조건은 다음과 같다.
시료 전처리를 위해 고상추출(Solid Phase Extraction)(5g/20㎖ Giga Tubes samples, strata C18-E)이 이루어지며, 이때 용매는 80% 아세토니트릴(Acetonitrile)(0.1% 트리플르오르아세트산(TFA)을 섞은 물)을 사용한다.
Prep HPLC의 분석조건으로는 isocratic 68% 아세토니트 릴(acetonitrile)(0.05% 트리플르오르아세트산(TFA)을 섞은 물)을 전처리용 이동 상으로 사용하여 유속(Flow rate) 7.0 ㎖/min으로 흘려주어 R1 검출기(Detector)를 이용하여 파장을 측정하고, 칼럼은 Luna 15μ C18(2) 100A column(250×21.0mm, 15micron, phenomenex)를 사용한다. 3번 분획 1.2g에 대한 Prep HPLC(Gilson사)의 크로마토그램(Chomatogram)은 도 2와 같다.
상기 3번 분획을 분리한 결과 12개의 소분획을 획득하였으며, 이는 다음의 표 4와 같다.
표 4. 표 1의 3번 분획의 분리과정을 통해 얻은
소분획
| 순번 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 |
| 분획 | Fr3-1 | Fr3-2 | Fr3-3 | Fr3-4 | Fr3-5 | Fr3-6 | Fr3-7 | Fr3-8 | Fr3-9 | Fr3 -10 | Fr3 -11 | Fr3 -12 |
| 중량 | 10.6 mg | 37.3 mg | 74.0 mg | 24.9 mg | 87.3 mg | 62.1 mg | 21.1 mg | 25.0 mg | 66.7 mg | 10.2 mg | 5.4 mg | 4.6 mg |
상기 12개의 소분획 중 5번 및 6번 소분획이 다양한 세스쿼터핀(sesquiterpene)을 함유하여, 상기 5번, 6번 두 분획에 대한 분리과정을 다시 수행하여 3개의 소분획을 다음 표 5와 같이 획득한다.
이때 Prep HPLC의 분석조건으로는 isocratic 60% 아세토니트릴(acetonitrile)(0.05% 트리플르오르아세트산(TFA)을 섞은 물)을 전처리용 이동 상으로 사용하여 유속(Flow rate) 4.0 ㎖/min으로 흘려주어 R1 검출기(Detector)를 이용하여 파장을 측정하고, 칼럼은 Luna 10μ C18(2) 100A column(250×10.0 mm, 10micron, phenomenex)를 사용한다. 소분획 Fr3-5(83.3mg)와 Fr3-6(62.1mg)의 정제 과정에서의 Prep HPLC(Gilson사)의 크로마토그램(Chomatogram)은 도 3과 같다.
표 5. 표 4의 5번 및 6번 분획의 분리과정을 통해 얻은
소분획
| Fr3-5 | Fr3-6 | ||
| 순번 | 1 | 2 | 3 |
| 분획 | Fr3-5-1 | Fr3-5-2 | Fr3-6-2 |
| 중량 | 25.3mg | 35.9mg | 30.2mg |
<3차 분리과정>
상기 표 5의 3개의 소분획에 대한 분리를 수행한다.
이때 Prep HPLC의 분석조건으로는 isocratic Hexane과 Ethyl acetate를 2.5:1비율로 혼합한 용액을 전처리용 이동 상으로 사용하여 유속(Flow rate) 4.0 ㎖/min으로 흘려주어 R1 검출기(Detector)를 이용하여 파장을 측정하고, 칼럼은 Luna 10μ silica(2) 100A column(250 × 10.0mm, 10micron, phenomenex)를 사용한다.
그리고, 상기 표 5의 3개의 소분획에 대한 분리를 수행한 결과 획득한 7개의 세스쿼터핀은 다음 표 6과 같다.
표 6. 표 5의 1, 2 및 3번 분획의 분리과정을 통해 얻은 7종의
세스쿼터핀
| 순번 | 1 | 2 | 3 | 4 |
| 분획 | Fr3-5-1-1 | Fr3-5-1-2 | Fr3-5-2-1 | Fr3-5-2-2 |
| 중량 | 2.9mg | 1.0mg | 7.0mg | 6.9mg |
| 화학식 |  |
 |
 |
 |
| 순번 | 5 | 6 | 7 | |
| 분획 | Fr3-6-2-2 | Fr3-6-2-3 | Fr3-6-2-4 | |
| 중량 | 7.8mg | 1.8mg | 2.4mg | |
| 화학식 |  |
 |
 |
|
개똥쑥의 염화메틸렌 추출물의 주성분 분리과정을 통해 분리된 화합물은 표 3 및 표 6의 총 10개로서 이를 정리하면 아래의 표 7과 같다.
표 7. 개똥쑥의
염화메틸렌
추출물의 주성분 분리과정을 통해 분리된 화합물
| 순번 | 1 | 2 | 3 | 4 |
| 분획 | Fr2-9 | Fr2-13 | Fr2-14 | Fr3-5-1-1 |
| 중량 | 23.9mg | 7.4mg | 6.5mg | 2.9mg |
| 화학 식 | Artemisinin |  |
 |
 |
| 순번 | 5 | 6 | 7 | 8 |
| 분획 | Fr3-5-1-2 | Fr3-5-2-1 | Fr3-5-2-2 | Fr3-6-2-2 |
| 중량 | 1.0mg | 7.0mg | 6.9mg | 7.8mg |
| 화학 식 |  |
 |
 |
 |
| 순번 | 9 | 10 | ||
| 분획 | Fr3-6-2-3 | Fr3-6-2-4 | ||
| 중량 | 1.8mg | 2.4mg | ||
| 화학 식 |  |
 |
||
시험 예 1: 암세포 독성 측정
상기 표 7의 10종의 화합물의 MCF-7 유방암 세포에 대한 암세포 독성에 대한 측정은 다음 과정을 거쳐 이루어진다.
유방암 세포인 MCF-7 Cells을 5%의 CO2 농도가 유지되는 배양기에서 37℃로 배양한다. 그리고 D-PBS로 3 ~ 4회 세척한 후 trypsin-EDTA 500㎕를 주입한다. 다시 배양기에서 37℃로 5분간 배양한 후 10mL 배지에 재현탁(resuspension)한다.
다음으로는 유방암 세포인 MCF-7 Cells을 96개의 well에 씨딩(seeding)하고, 각 셀에는 100㎕ 셀 현탁(1×105 cells/mL)을 첨가한다. 그리고 5%의 CO2 농도가 유지되는 배양기에서 37℃로 24시간 동안 배양한다.
그리고, 희석 및 샘플을 첨가하여 5%의 CO2 농도가 유지되는 배양기에서 37℃로 24시간 동안 배양한 후에 10% CCK 용액으로 염색한 후, 37℃에서 1시간 동안 배양하고, 최종적으로 Optical density(OD)는 microplate reader(Model 550 microplate reader, Bio-Rad, Richmond, USA)를 이용하여 405nm에서 측정한다.
상기와 같은 개똥쑥에서 단리된 화합물의 유방암세포에 대한 세포독성 효과를 측정한 결과는 아래의 표 8과 같다.
표 8. 유방암세포(
MCF
-7)의 암세포 독성에 대한 측정결과
| MCF7 | 화합물 | lC50(㎛) |
| 1 | Artemisinin | 10㎍/㎖ 30% 억제 |
| 2 | Dihydroartemisinic acid | <200 |
| 3 | Artemisinic acid | 10㎍/㎖ 40% 억제 |
| 4 | α-Epoxydihydroartemisinic acid | <200 |
| 5 | Arteannuin L | <200 |
| 6 | Arteannuin N | 148.36 |
| 7 | Dihydroarteannuin B | 150.95 |
| 8 | Arteannuin B | 10㎍/㎖ 40% 억제 |
| 9 | 3,3',7-Trimethylquercetin | 101.72 |
| 10 | 3,4',7-Trimethylquercetin | 73.52 |
상기 화합물(compound) 1, 3 및 8은 30㎍/㎖의 농도의 고농도에서는 유방암세포에 대하여 50% 이상의 성장 억제효과가 기대되고 있다. 그리고 상기 10종의 화합물에 대한 분석결과는 도 4 내지 도 11에 나타내었다.
상기 화합물 1, 3 및 8은 단독으로 사용하게 될 경우에는 항암 효과가 떨어지는 것으로 나타나며, 아테미시닌(Artemisinin) 자체의 활성화 문제가 생체 내에서 어렵다는 결론과 재발률이 높다는 결론에 이르게 되었다. 즉, 상기 화합물 1, 3 및 8은 아래의 표 8에서 보는 바와 같이, 아테아뉴인 B(arteannuin B), 아테미신닌 산(Artemisinic acid)의 화합물들은 아테미시닌(Artemisinin)의 활성화를 촉진한다.
표 9. 개똥쑥의 유방암세포(
MCF
-7)에 대한 세포독성 효과(
IC
50
(㎍/
mL
))
| 화합물 | 세포독성 |
| Artemisinin | *** |
| Artemisinic acid | 21.65 |
| Arteannuin B | 46.35 |
| Artemisinin + Artemisinic acid(동비율) | 6.9 |
| Artemisinic acid + Arteannuin B(동비율) | 31.03 |
| Artemisinin + Arteannuin B(동비율) | 67.22 |
| Artemisinin + Artemisinic acid + Arteannuin B(동비율) | 71.45 |
| Compounds 1 thru 10(동비율) | >200 |
그리고, 상기 세포독성 효과는 화합물의 처리농도에 따라 12.5, 25, 50, 100, 200 ㎍/mL로 처리하였으나, 처리농도의 변화에 별 영향을 보이지 않았으며, 다만 artemisinin의 경우에는 용해도가 낮아 12.5 ㎍/mL 이상의 농도에서는 불가능하다.( *** artemisinin이 25 ㎍/mL 이상에서 녹지 않고 석출됨.)
상기 표 9와 관련하여 개똥쑥의 유효성분의 구체적인 혼합비율에 따른 유방암세포(MCF-7)에 대한 세포독성을 하기 표 10에 기재하였다.
표 10. 개똥쑥의 유효성분 혼합비율에 따른 유방암세포(
MCF
-7)에 대한 세포독성 효과(IC
50
(㎍/
mL
))
| 화합물 | 세포독성 |
| Artemisinin 45 wt%+ Artemisinic acid 55 wt% | 6.9 |
| Artemisinic acid 45 wt%+ Arteannuin B 55 wt% | 30.01 |
| Artemisinin 55 wt% + Arteannuin B 45 wt% | 62.33 |
| Artemisinin 33 wt%+Artemisinic acid 33 wt%+Arteannuin B 34wt% | 69.45 |
| Compounds 1 thru 10 각 10wt% | >200 |
도 1은 본 발명에 따른 개똥쑥 염화메틸렌 추출물의 분리과정의 분획(Fr2)의 크로마토그램(Chomatogram).
도 2는 본 발명에 따른 개똥쑥 염화메틸렌 추출물의 분리과정의 분획(Fr3)의 크로마토그램(Chomatogram).
도 3은 본 발명에 따른 개똥쑥 염화메틸렌 추출물의 분리과정의 분획(Fr3-5 및 Fr3-6)의 크로마토그램(Chomatogram).
도 4는 본 발명에 따른 아테미시닌(Artemisinin) 화합물의 분석결과.
도 5는 본 발명에 따른 디하이드로아테미신닌 산(Dihydroartemisinic acid) 화합물의 분석결과.
도 6은 본 발명에 따른 아테미신닌 산(Artemisinic acid) 화합물의 분석결과.
도 7은 본 발명에 따른 알파-에폭시디하이드로아테미신닌 산(α-epoxydihydroartemisinic acid) 화합물의 분석결과.
도 8은 본 발명에 따른 아테아뉴인 L(Arteannuin L) 화합물의 분석결과.
도 9는 본 발명에 따른 아테아뉴인 N(Arteannuin N) 화합물의 분석결과.
도 10은 본 발명에 따른 디하이드로아테뉴인 B(Dihydroarteannuin B) 화합물의 분석결과.
도 11은 본 발명에 따른 아테아뉴인 B(Arteannuin B) 화합물의 분석결과.
Claims (11)
- 개똥쑥에서 염화메틸렌을 이용하여 추출된 암세포 독성 효과가 있는 아래의 화학식 1, 화학식 2 또는 화학식 3인 것을 특징으로 하는 항암 유효성분 추출물.[화학식 1]
[화학식 2]
[화학식 3]
- 개똥쑥을 염화메틸렌(Dichloromethane)으로 환류추출(Reflux)하여 염화메틸렌 추출물을 얻는 단계와,그 염화메틸렌 추출물을 실리카 칼럼 크로마토그래피에 넣고, 여기에 유기용매를 가하여 용출액을 얻은 다음 그 용출액으로부터 상기 실리카 칼럼 크로마토그래피를 통해 분획을 얻는 1차 분리단계와,상기 분획을 고성능액체크로마토그래피(HPLC)를 이용하여 유효성분을 분리하는 2차 분리단계를 통해 암세포 독성 효과가 있는 청구항 1의 화학식 1, 화학식 2, 화학식 3이 추출됨을 특징으로 하는 항암 유효성분 추출방법.
- 제 2항에 있어서,환류추출은 염화메틸렌(Dichloromethane)을 추출용매로 하여 최초 1회 3시간 동안 개똥쑥을 환류추출한 후 1시간씩 2회 환류추출하여 감압 여과한 후 그 여액을 40 ~ 60℃에서 감압농축하는 것임을 특징으로 하는 항암 유효성분 추출방법.
- 제 2항에 있어서,유기용매는 헥산(Hexane), 에틸아세테이트(Ethyl acetate) 또는 메틸알코올(Methyl alcohol) 중 선택되는 어느 1종 또는 2종 이상으로 조성되는 것임을 특징으로 하는 항암 유효성분 추출방법.
- 제 1항의 화학식 1의 아테미시닌(Artemisinin), 화학식 2의 아테아뉴인 B(arteannuin B) 또는 화학식 3의 아테미신닌 산(artemisinic acid)중 선택되는 어느 1종 또는 2종 이상으로 조성되는 것임을 특징으로 하는 항암 유효성분 추출물을 이용한 항암제.
- 제 5항에 있어서,아테미시닌(Artemisinin) 1 ~ 99wt%와 아테아뉴인 B(arteannuin B) 1 ~ 99wt%의 혼합으로 조성되는 것임을 특징으로 하는 항암 유효성분 추출물을 이용한 항암제.
- 제 5항에 있어서,아테미시닌(Artemisinin) 1 ~ 99wt%와 아테미신닌 산(artemisininic acid) 1 ~ 99wt%의 혼합으로 조성되는 것임을 특징으로 하는 항암 유효성분 추출물을 이용한 항암제.
- 제 5항에 있어서,아테아뉴인 B(arteannuin B) 1 ~ 99wt%와 아테미신닌 산(artemisininic acid) 1 ~ 99wt%의 혼합으로 조성되는 것임을 특징으로 하는 항암 유효성분 추출물을 이용한 항암제.
- 제 5항에 있어서,아테미시닌(Artemisinin) 1 ~ 98wt%와 아테아뉴인 B(arteannuin B) 1 ~ 98wt%와 아테미신닌 산(artemisininic acid) 1 ~ 98wt%의 혼합으로 조성되는 것임을 특징으로 하는 항암 유효성분 추출물을 이용한 항암제.
- 제 5항의 아테미시닌(Artemisinin), 아테아뉴인 B(arteannuin B), 아테미신닌 산(artemisininic acid)과 이외에 개똥쑥으로부터 추출되는 디하이드로아테미신닌 산(Dihydroartmisinic acid), 알파-에폭시디하이드로아테미신닌 산(a-Epoxydihydroartemisinic acid), 아테아뉴인 L(Arteannuin L), 아테아뉴인 N(Arteannuin N), 디하이드로아테아뉴인 B(Dihydroarteannuin B), 3,3',7-트리메틸케르세틴(3,3',7-Trimethylquercetin), 3,4',7-트리메틸케르세틴(3,4',7-Trimethylquercetin) 중 선택되는 어느 1종 또는 2종 이상으로 조성되는 것임을 특징으로 하는 항암 유효성분 추출물을 이용한 항암제.
- 제 11항에 있어서,아테미시닌(Artemisinin) 1 ~ 91wt%, 아테아뉴인 B(arteannuin B) 1 ~ 91wt%, 아테미신닌 산(artemisininic acid) 1 ~ 91wt%, 디하이드로아테미신닌 산(Dihydroartmisinic acid) 1 ~ 91wt%, 알파-에폭시디하이드로아테미신닌 산(a-Epoxydihydroartemisinic acid) 1 ~ 91wt%, 아테아뉴인 L(Arteannuin L) 1 ~ 91wt%, 아테아뉴인 N(Arteannuin N) 1 ~ 91wt%, 디하이드로아테아뉴인 B(Dihydroarteannuin B) 1 ~ 91wt%, 3,3',7-트리메틸케르세틴(3,3',7-Trimethylquercetin) 1 ~ 91wt%, 3,4',7-트리메틸케르세틴(3,4',7-Trimethylquercetin) 1 ~ 91wt%의 혼합으로 조성되는 것임을 특징으로 하는 항암 유효성분 추출물을 이용한 항암제.
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|---|---|---|---|---|
| CN102408431A (zh) * | 2011-11-29 | 2012-04-11 | 中国中医科学院中药研究所 | 青蒿素b的制备方法及其新用途 |
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| CN104031062A (zh) * | 2014-06-30 | 2014-09-10 | 施佩蓓 | 一种青蒿素的生产方法 |
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| KR20230067131A (ko) * | 2021-11-09 | 2023-05-16 | 주식회사 씨앤비바이오 | 개똥쑥 추출물부터 분리된 신규 화합물을 함유한 화장료 조성물 |
-
2008
- 2008-08-29 KR KR1020080084839A patent/KR20100026030A/ko active IP Right Grant
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