KR100651650B1

KR100651650B1 - 아위로부터 분리된 세스키테르펜 화합물을 포함하는 항암제 조성물

Info

Publication number: KR100651650B1
Application number: KR1020000060039A
Authority: KR
Inventors: 유시용; 이정옥; 최상운; 박성희; 김영섭; 김성기
Original assignee: 한국화학연구원
Priority date: 2000-10-12
Filing date: 2000-10-12
Publication date: 2006-11-30
Also published as: WO2002030438A1; KR20020029210A; US20040043083A1; JP2004510823A

Abstract

본 발명은 유효성분으로서 아위(Ferulae Resina)로부터 분리된 세스키테르펜(sesquiterpene) 화합물인 갈바닉산, 카라타비시놀, 움벨리프레논, 파네시페롤 B, 파네시페롤 C 및 이들의 혼합물로 이루어진 그룹으로부터 선택된 어느 하나를 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 함유하는 항암제 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 조성물은 폐암, 난소암, 흑색종, 중추신경계 종양, 결장암, 백혈병 등 각종 악성종양의 예방 및 치료제로 사용될 수 있다.

Description

아위로부터 분리된 세스키테르펜 화합물을 포함하는 항암제 조성물{ANTI-CANCER COMPOSITION COMPRISING SESQUITERPENE COMPOUNDS ISOLATED FROM FERULAE RESINA}

본 발명은 아위(阿魏, Ferulae Resina, Asafoetida)로부터 분리된 세스키테르펜(sesquiterpene) 화합물을 포함하는 항암제 조성물에 관한 것이다.

배양된 암세포주에 대한 시험관내 (in vitro) 세포증식 저해효과를 지표로 하여 식물 및 미생물의 추출물로부터 우수한 세포증식 저해물질을 추출분리하고 나아가 이를 유용한 항암제로 발전 개발시켜 나가고자 하는 연구방식은 오랫동안 많은 학자들이 추구해왔던 가장 보편적인 연구개발 형식으로서 오늘날 가장 널리 통용되고 있는 택솔(taxol), 빈블라스틴(vinblastin), 캠토테신(camptothecin) 등의 항암제들은 모두 이러한 연구방식에 따라 식물의 추출물로부터 분리된 약제들이다.

한편, 아위(阿魏, Ferulae Resina, Asafoetida)(大韓藥典외 生藥規格集, 1987)는 중국, 중앙아시아 등지에 자생하는 미나리과(Umbelliferae)에 속하는 다년생초본 아위(Ferula assafoetida L.) 및 동속식물의 뿌리 및 근경으로부터 얻은 삼출액, 즉 수지상 유액(Resin)을 건조한 것을 칭하며 한방에서는 주로 적체, 어혈, 충적 등의 치료목적으로 사용했으며, 또한 기관지염, 백일해, 천식에 자극성거담제로도 사용되어 왔다(中藥大辭典弟 1券, 小學館, 上海科學術出版社, p. 2(1985)). 아위로부터 분리된 갈바닉산과 그 나트륨염은 적혈구 응집반응과 혈소판 응집반응을 억제한다고 알려져 있다(Mansurov M. M., Martirosov M. S., 1990, Farmakol Toksikol, 53, 51; Mansurov M. M., Martirosov M. S., 1988, Farmakol Toksikol 51, 47). 또한 갈바닉산은 사염화메탄 주사로 야기된 간독성 과정을 개선하는 효과가 보고되어 있다(Syrov V. N., Khushbaktova Z. A., Nabiev A. N., 1990, Farmakol Toksikol. 53, 41).

그러나, 갈바닉산을 비롯한 본 발명의 세스키테르펜 화합물들이 인간 암세포주들에 대하여 강력한 세포증식 저해효과를 나타내어 항암제로서 유용하다는 사실은 아직 보고된 바 없다.

본 발명의 목적은 천연물로부터 분리된 화합물을 포함하는 항암제 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 항암제 조성물은 아위(Ferula assafoetida L.) 혹은 동속 식물들의 침출액으로부터 분리된 하기 화학식 1 내지 5의 갈바닉산(galbanic acid; 화학식 1), 카라타비시놀(karatavicinol; 화학식 2), 움벨리프레닌(umbelliprenin; 화학식 3), 파네시페롤 B(farnesiferol B; 화학식 4), 파네시페롤 C(farnesiferol C; 화학식 5), 이들의 약제학적으로 허용되는 염 및 이들의 혼합물로 이루어진 그룹으로부터 선택된 어느 하나를 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 함유한다.

상기 화합물들은 A549 (인간 폐암 세포주), SK-OV-3 (인간 난소암 세포주), SK-MEL-2 (인간 흑색종 세포주), XF498 (인간 중추신경계 암 세포주) 및 HCT-15 (인간 결장암 세포주) 등의 인체 기원 암세포주들에 대하여 탁월한 세포증식 저해효과를 나타내므로 각종 암의 예방 및 치료제로서 유용하다.

상기 화합물들은 아위 또는 동속 식물들의 침출액으로부터의 유기용매, 예를 들어 메탄올을 이용하여 얻은 추출액으로부터 분리할 수 있다. 보다 상세하게는, 아위 또는 동속 식물의 침출액을 메탄올 등의 유기 용매로 추출한 추출액을 디클로로메탄으로 분획하여 디클로로메탄 가용분획을 얻고, 이를 디클로로메탄과 메탄올의 혼합용액을 용출액으로 사용하는 실리카겔 컬럼 크로마토그래피에 의해 분획하여 암 세포 증식 저해효과가 우수한 추출물 분획을 얻는다. 이때 디클로로메탄과 메탄올의 혼합용액은 디클로로메탄과 메탄올이 50:1 내지 100:1(v/v)의 비율로 혼합된 것을 사용하는 것이 바람직하다. 이렇게 하여 얻어진 활성 분획들로부터 n-헥산과 에틸 아세테이트 혼합 용액을 용출액으로 사용하여 실리카겔 컬럼 크로마토그래피를 반복 수행함으로써 상기 화학식 1 내지 5의 갈바닉산, 카라타비시놀, 움벨리프레닌, 파네시페롤 B 및 파네시페롤 C를 얻을 수 있다.
상기 화학식 1 내지 5의 화합물의 약학적으로 허용되는 염으로서는, 알칼리 금속염(예: 나트륨염, 칼륨염 등), 알칼리토 금속염(예: 마그네슘염, 칼슘염 등)과 같은 무기금속염, 암모늄염, 유기염기염(예: 트리메틸아민염, 트리에틸아민염, 피리딘염, 피콜리딘염 등) 등을 예로 들 수 있다.

본 발명의 조성물을 사용하여 통상적인 방법에 따라 약학 제형을 제조할 수 있다. 제형의 제조에 있어, 활성 성분을 담체와 함께 혼합 또는 희석하거나, 용기 형태의 담체내에 봉입시키는 것이 바람직하다. 담체가 희석제로 사용되는 경우에는 활성 성분에 대한 비히클, 부형제 또는 메디움으로 작용하는 고형, 반고형 또는 액상의 물질일 수 있다. 따라서, 제형은 정제, 환제, 분제, 새세이, 엘릭시르, 현탁 제, 유제, 용액제, 시럽제, 에어로졸, 연질 또는 경질 젤라틴 캅셀제, 멸균 주사제, 멸균 분제 등의 형태일 수 있다.

적합한 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제형은 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제, 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 조성물은 포유 동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 잘 알려진 방법을 사용하여 제형화될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 경구, 경피, 피하, 정맥 또는 근육을 포함한 여러 경로를 통해 투여될 수 있다. 사람의 경우 활성 화합물의 통상적인 1일 투여량은 1 내지 1,000 ㎎/㎏ 체중, 바람직하게는 10 내지 100 ㎎/㎏ 체중의 범위일 수 있고, 1회 또는 수회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나, 활성 성분의 실제 투여량은 치료할 질환, 투여 경로, 환자의 연령, 성별 및 체중, 및 질환의 중증도 등의 여러 관련 인자에 비추어 결정되어야 하는 것으로 이해되어야 하며, 따라서, 상기 투여량은 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것이 아니다.

이하에서 본 발명을 실시예에 의거하여 보다 구체적으로 설명한다. 단, 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명이 이들만으로 한정되는 것은 아니다.

참고예: 인체 기원 암세포주에 대한 세포증식저해효과 시험

A549 (인간 폐암 세포주), SK-OV-3 (인간 난소암 세포주), SK-MEL-2 (인간 흑색종 세포주), XF498 (인간 중추신경계 암 세포주) 및 HCT-15 (인간 결장암 세포주) 등 5종의 인체 기원 암세포주를 미국 NCI (국립암연구센터)로부터 분양받아 계대배양하여 사용하였으며, 암세포 증식 저해효과는 미국 NCI 및 기타 여러 검정기관에서 약물의 일차적 항암효과의 측정방법으로 가장 널리 사용하는 SRB (sulfrhodamine B) 방법 (Skehan, P. et al., (1990) J. Natl. Cancer. Inst., 82, 1107)에 준하여 다음과 같이 측정하였다.

1) 계대중의 암세포들을 트립신-CDTA 용액으로 처리하여 용기 부착면으로부터 분리시키고, 96-웰 편평 바닥 마이크로플레이트 (Falcon)에 각 웰당 세포수가 각각 5 x 10³(A549, HCT-15), 1 x 10⁴(SK-MEL-2, XF498) 및 2 x 10⁴(SK-OV-3)이 되도록 희석하여 분주하였다. 이들을 CO₂배양기속에서 24시간 배양하여 세포가 웰의 바닥면에 부착(anchor)되도록 한 후 흡입기로 배지를 제거하고 배지에 녹여둔 검체를 농도별로 각각의 웰속에 넣어주고 48 시간동안 계속 배양하였다.

2) 48시간동안의 배양을 마친 후 각 웰속의 배지를 흡입 제거하고 10 % 트리클로로아세트산 (TCA) 용액을 각 웰당 10 ㎕씩 가하고 1 시간동안 상온에서 방치하여 세포들을 고정시킨 다음 물로 5-6회 세척하여 과잉의 TCA 용액을 완전제거하고 건조시켰다.

3) 각 웰당 100 ㎕씩의 SRB 염색용액 (1 % 아세트산 중의 0.4 % 설포로다민) 을 가하여 30분간 염색하고 과잉의 염색액은 1 % 아세트산으로 5-6회 반복 세척하여 제거한 후 상온에서 건조시켰다.

4) 각 웰당 100 ㎕씩의 10 mM 트리스마 염기(Trisma base (unbuffered)) 용액을 가한 후 타이터 플레이트 진탕기(titer plate shaker)로 10분간 진탕하여 세포에 염색된 염색액을 용출시키고 마이크로플레이트 리더(microplate reader)를 이용하여 520 nm에서의 흡광도치(absorbance)를 측정하였다.

5) 검체용액을 넣어준 검체군의 암세포 증식율 (% cell growth, 항암활성 의 역)은 다음수식에 따라 산출하였다. 즉 검체용액 대신 동량의 배지를 넣어준 대조군의 세포수(C)와 0 시간(zero time)의 세포수(Tz) 및 검체군의 세포수(T)를 각각 각군의 흡광도치로부터 환산하였다. 검체군의 암세포 증식율 (% cell growth)은 Tz>T인 경우에는 수학식 1로, Tz<T인 경우에는 수학식 2로 계산하였다.

6) 각각의 농도에서 측정한 검체군의 암세포 증식율을 바탕으로하여 LOTUS 프로그램의 데이터 회귀(data regression)를 사용하여 검체가 해당 암세포의 증식을 50 % 저해하는 농도 (ED₅₀)를 계산하였다.

실시예 1: 아위로부터 화합물 1 내지 5의 분리

아위 1.2 Kg을 메탄올 20 L에 넣고 3시간씩 3회 반복 환류교반하여 식힌 후 여과하고 여액을 감압농축하여 메탄올 추출물 460 g을 얻었다.

이를 적당량의 증류수에 분산시킨 후 n-헥산, 디클로로메탄 및 n-부탄올로 단계적으로 용매분획하여 56 g의 헥산 가용분, 290 g의 디클로로메탄 가용분 및 50 g의 n-부탄올 가용분을 얻었다. 디클로로메탄 가용분 5 g을 취하여 디클로로메탄 100 ml에 녹여 실리카겔 [Merck, Kieselgel 60, 70-230 mesh, 300 g] 컬럼(Φ= 3.0 x 80 cm)을 이용하여 일정비율의 디클로로메탄과 메탄올의 혼합용액으로 단계적으로 용출시켜 총 4개의 분획(Fr. 1 - Fr. 4)으로 나누었다. 즉, 최초 디클로로메탄 2 L로 용출된 Fr. 1 (480 mg), 다음 디클로로메탄과 메탄올의 100 : 1 혼합용액 2 L로 용출된 Fr. 2 (2,050 mg), 디클로로메탄과 메탄올의 50 : 1 혼합용액 2 L로 용출된 Fr. 3 (570 mg) 및 디클로로메탄과 메탄올의 10 : 1 혼합용액 2 L로 용출된 Fr. 4 (980 mg)으로 나누었다. 이들 각 분획들의 인체 기원 암세포주에 대한 세포 증식 저해효과를 참고예의 방법으로 조사한 결과, Fr.2와 Fr.3이 A549 세포주에 대한 ED₅₀값이 각각 약 8 ㎍/㎖과 9 ㎍/㎖로서 우수한 세포 증식 저해효과를 보여주었다.

Fr.2와 Fr.3을 사용하여 각각 전술한 바와 같은 요령으로, 즉 세포 증식 저해효과가 우수한 분획을 다시 컬럼 크로마토그라피를 통하여 몇 개의 소분획으로 나누고 이중 우수한 효과를 보여주는 소분획을 다시 몇 개의 소소분획으로 나누어 나가는 조작을 유효성분의 분리가 이루어질 때까지 단계적으로 반복하였다. 즉 Fr.2와 Fr.3을 n-헥산과 에틸아세테이트 혼합용액 (혼합비; 4:1 ∼ 1:1을 단계적으로 사용)을 용출액으로하여 실리카겔 컬럼 크로마토그라피를 반복적으로 수행하여 최종적으로 Fr.2로부터 움벨리프레닌(umbelliprenin) [화학식 3, 무색 침상결정, mp 61℃, C₂₄H₃₀O₃, MW 366] 70 mg 및 파네시페롤 B(farnesiferol B)[화학식 4, 무색 침상결정, mp 112℃, [α]_D+10 (c, 1.0 in CHCl₃) C₂₄H₃₀O₄, MW 382] 120 mg을 얻었으며, Fr.3 로부터 갈바닉산(galbanic acid) [화학식 1, 무색 침상 결정, mp 87∼89℃, [α]_D-20 (c, 1.0 in CHCl₃), C₂₄H₃₀O₅, MW 398] 500 mg, 카라타비시놀(karatavicinol) [화학식 2, 무색 결정, mp 50℃, [α]_D-4 (c, 1.0 in CHCl₃), C₂₄H₃₂O₅, MW 400] 50 mg 및 파네시페롤 C(farnesiferol C) [화학식 5, 무색 침상결정, mp 82℃, [α]_D-36 (c, 1.0 in CHCl₃), C₂₄H₃₀O₄, MW 382] 400 mg을 얻었다. 이들 각 화합물들의 각종 분광학(¹H-NMR, ¹³C-NMR, MS) 및 이화학적 특성 (mp, [α]_D) 조사결과 등을 종합하여 이미 문헌 (화학식 1; Appendino, G et al., 1994, Phytochemistry, 35, 183, 화학식 2; Veselovskaya, NV et al., 1982, Khim. Prir. soedin. 18, 397-8, 화학식 3; Chartterjee, A et al., 1961, J. Chem. Soc., 2246, 화학식 4, 화학식 5; Caglioti, L et al., 1958, Helv. Chim. Acta, 2278)에 보고된 바 있는 이들 화합물들의 그것들과 비교분석하여 화학식 1 내지 화학식 5의 구조를 규명하였다.

실시예 2 : 화합물 1 내지 5의 인체기원 암세포 증식 저해효과

참고예의 방법에 따라, 실시예 1에서 얻은 아위의 메탄올 추출물 및 화합물 1 내지 5의 암세포 증식 저해효과를 A549를 비롯한 5종의 인체기원 암세포주에 대하여 검정하여 각 암세포주에 대한 50 % 증식저해 농도(ED₅₀)를 표 1에 나타내었으며 대조약물로는 현재 임상에서 가장 널리 쓰이고 있는 시스플라틴을 사용하였다.

화합물 1 내지 5의 암세포 증식 저해효과

	ED₅₀(㎍/㎖)
	A549	SK-OV-3	SK-MEL-2	XF498	HCT-15
아위 메탄올 추출물	11.5	18.6	13.0	11.2	12.0
화합물 1	8.9	14.5	12.3	13.0	9.7
화합물 2	5.6	11.6	5.7	7.5	7.0
화합물 3	8.9	9.4	6.7	5.3	4.1
화합물 4	7.2	10.0	7.1	7.1	4.3
화합물 5	4.2	7.2	3.9	5.4	4.3
시스플라틴	1.8	1.5	1.2	1.4	3.2

상기 표 1에서 볼 수 있는 바와 같이, 화합물 1 내지 5는 각종 암세포주에 대하여 우수한 세포 증식 저해효과를 나타내며, 특히 화합물 5는 매우 우수한 효과를 나타낸다. 또한, 간 독성, 신장 독성 등의 심각한 부작용이 보고되어 있는 시스플라틴과 달리 한방에서 오랫동안 사용되어 온 아위에 포함되어 있는 본 발명의 화합물들은 안전성이 검증된 것으로 부작용을 거의 나타내지 않을 것으로 기대된다.

전술한 바와 같이 아위로부터 분리된 세스키테르펜 화합물들, 즉, 갈바닉산, 카라사비시놀, 움벨리프레논, 파네시페롤 B 및 파네시페롤 C는 인체기원 암세포주에 대하여 탁월한 세포증식 저해효과를 나타내므로 폐암, 난소암, 흑색종, 중추신경계 종양, 결장암, 백혈병 등 각종 악성종양의 예방 및 치료제로 사용될 수 있다.

Claims

유효성분으로서 아위(Ferulae Resina)로부터 분리된 갈바닉산, 카라타비시놀, 움벨리프레논, 파네시페롤 B, 파네시페롤 C, 이들의 약제학적으로 허용되는 염 및 이들의 혼합물로 이루어진 그룹으로부터 선택된 어느 하나를 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 함유하는 항암제 조성물.
제1항에 있어서,

폐암, 난소암, 흑색종, 중추신경계 종양 또는 결장암의 예방 및 치료를 위한 항암제 조성물.