CN100556908C - 具抑制肿瘤细胞生长活性的艾里莫芬双内酯二聚体及用途 - Google Patents
具抑制肿瘤细胞生长活性的艾里莫芬双内酯二聚体及用途 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一个结构新颖的艾里莫芬双内酯二聚体及其制备方法，以及该天然产物对六种人体肿瘤细胞株如人原髓细胞白血病细胞(HL-60)、鼻咽癌细胞(CNE)、口腔上皮癌细胞(KB)、人肺癌细胞(A549)、人肝癌细胞(BEL-7404)和人子宫颈癌细胞(Hela)肿瘤细胞生长抑制活性的筛选。由于该倍半萜双内酯二聚体具有一定的抑制口腔上皮癌细胞(KB)和人肝癌细胞(BEL-7404)肿瘤细胞生长活性，可预期作为抗肿瘤的药物用途。
Description
技术领域
本发明属于天然药物化学和药理学技术领域。具体而言，本发明涉及一个艾里莫芬双内酯二聚体的制备以及该天然产物对六种人体肿瘤细胞株如人原髓细胞白血病细胞(HL-60)、鼻咽癌细胞(CNE)、口腔上皮癌细胞(KB)、人肺癌细胞(A549)、人肝癌细胞(BEL-7404)和人子宫颈癌细胞(Hela)肿瘤细胞生长抑制活性筛选。该天然产物被发现具有一定的抑制肿瘤细胞生长活性，可预期作为抗肿瘤药物用途。
技术背景
目前，由于工业发展带来的环境污染等问题，人类的生存环境质量不断下降，肿瘤疾病的发病率和致死率也不断上升。然而目前临床所用的细胞毒性抗肿瘤药物的选择性不高，导致对正常细胞的恶性杀伤，限制了该类药物的普遍使用性。因此，寻找和发现新的选择性高的细胞毒性抗肿瘤药物是世界范围内的研究热点。我们也致力于这类药物的研究。
黑紫橐吾Ligularia atroviblacea(Franch.)Hand.-Mazz.是菊科橐吾属植物，云南民间用于清热解毒及治疗感冒、咳嗽用。本发明人在对菊科橐吾属植物和菊科千里光属的提取及化学成分研究中，曾经发现其中含有大量的艾里莫芬烷内酯，如近年来发明人发现岩生千里光中的艾里莫芬烷内酯具有对肿瘤细胞HL-60，A549和KB株均有一定的细胞毒性(赵昱等，Chinese Chemical Letters，2002年，13卷第4期，333-334页)。此外，本发明人还报道了鸡足千里光的几个艾里莫芬烷内酯也对KB肿瘤细胞株和A549细胞株有一定的细胞毒性(赵昱等，Chinese Chemical Letters，2002年，13卷第8期，754-757页；赵昱等，ChineseChemical Letters，2005年，16卷第3期，362-364页)。但是，对于黑紫橐吾的化学成分研究和生物活性研究尚未见报道。据此，发明人对其进行了生物追踪的化学分离及结构鉴定，得到了本发明中所述的具有新颖结构的艾里莫芬双内酯二聚体化合物；并根据全世界尤其是中国的常发肿瘤疾病谱及肿瘤细胞的敏感性，选择了口腔上皮癌细胞(KB)、人肝癌细胞(BEL-7404)肿瘤细胞株作为体外细胞毒活性药理评价的指标。结果显示，该艾里莫芬双内酯二聚体有抑制上述人体肿瘤细胞生长的作用，由此完成本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种具有抑制人体肿瘤细胞生长活性的艾里莫芬双内酯二聚体，具体而言，本发明提供了式(1)所示的艾里莫芬双内酯二聚体：
式(1)化合物：8α-[艾里莫芬烷-3′，7′(11′)-二烯-12′，8′α；15′，6′α-二内酯]-艾里莫芬烷3，7(11)-二烯-12，8α；15，6α-二内酯。
本发明的另一目的是提供了式(1)化合物用于抑制人体肿瘤细胞生长活性的用途；以及据此活性将式(1)化合物制备成防治肿瘤疾病药物的用途。
本发明的再一目的是提供了一种用于抑制人体肿瘤细胞生长活性的药物组合物。
橐吾属植物中一般富含艾里莫芬烷内酯，其提取方法多为有机溶剂浸泡抽提或者回流提取，回收溶剂后，所得浸膏进行溶剂分配和/或各种层析方法，结合重结晶技术纯化而得。
本发明中的药材可以是黑紫橐吾Ligularia atroviblacea(Franch.)Hand.-Mazz.的任一部位，即可以是其根、茎、叶、种子、皮、果实，也可以是它们的混合物。优选其地下部分。
式(1)化合物具有重要的生物活性，首期测试其对两株人体肿瘤细胞即口腔上皮癌细胞株(KB)和人肝癌细胞(BEL-7404)的细胞毒活性体外试验发现：该艾里莫芬双内酯二聚体对人体肿瘤细胞生长具有抑制作用(具体见实施例)，有可能发展成为新的防治肿瘤药物。
本发明的式(1)化合物或其可药用盐及其溶剂化物可以与药学上常用的辅料或载体结合，制备得到具有肿瘤细胞生长抑制活性从而可以用于防治肿瘤疾病的药物组合物。上述各类药物组合物可以采用注射剂、片剂、胶囊剂、气雾剂、栓剂、膜剂、滴丸剂、外用搽剂、软膏剂等剂型药物，还可以采用现代制药界所公知的控释或缓释剂型或纳米制剂。
本发明的式(1)化合物或其可药用盐及其溶剂化物可以与现已上市的抗肿瘤药物，如铂类药物顺铂(DDP)、喜树碱类药物伊立替康(Irinatecan，CPT-11)、长春花碱类药物失碳长春花碱(Vinorebine，NVB诺维本)、脱氧胞昔类药物吉西他滨(Gemcitabine，Gemzar健择)、足叶乙甙(Etoposide)、紫杉醇(Paclitaxel)等联合使用，制备得到防治肿瘤疾病类药物组合物。该类药物组合物可以采用注射剂、片剂、胶囊剂、气雾剂、栓剂、膜剂、滴丸剂、外用搽剂、软膏剂等剂型药物，还可以采用现代制药界所公知的控释或缓释剂型或纳米制剂。
具体实施方式
为了更好地理解本发明的实质，下面首先用实施例的形式说明式(1)化合物制备的过程，实施例给出了代表性化合物的部分物理和化学及波谱学数据。必须说明，本发明的实施例是用于说明本发明而不是对本发明的限制。根据本发明的实质对本发明进行的简单改进都属于本发明要求保护的范围。
实施例1：式(1)化合物：8α-[艾里莫芬烷-3′，7′(11′)-二烯-12′，8′α；15′，6′α-二内酯]-艾里莫芬烷3，7(11)-二烯-12，8α；15，6α-二内酯的制备
样品地下部分晒干粉碎(干重5.0公斤)后用95％工业酒精沸水下热提两次，提取液冷却后合并，经减压浓缩得389克棕褐色粘稠状初提物。用蒸馏水制成悬浮液后依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇分配萃取。各有机层减压蒸干后分别得26克，127克，89克，水层为147克。
取乙酸乙酯萃取浸膏120克，用150克200-300目硅胶拌样挥干溶剂后经硅胶柱层析(2500克)，用氯仿-甲醇系统梯度洗脱(0∶1→1∶0)。经薄层TLC检测后合并成14个粗组分(F1-F14)。F7(21克)过MCI(00克)柱，用水-甲醇系统梯度洗脱，70％甲醇洗脱部位(4.8克)过硅胶柱(100克)用石油醚-丙酮系统(8∶1，6∶1和4∶1)梯度洗脱，6∶1洗脱部位(492毫克)经过重结晶的式(1)化合物(29毫克)。
式(1)化合物为无色片状结晶，HR-ESI-MS给出其分子式C30H30O8，其分子离子峰出现在m/z 536.2276[M+NH4]+(计算值：536.2284)，但是在电离质谱EI-MS中基峰仅为259，正好为其分子量的一半。在13C-NMR和DEPT谱可以看出，该化合物只有15个碳(2×CH3，3×CH2，3×CH，7×C)，因此可以推断该化合物为由两个相同的结构单元构成的对称结构[Y C Lin等，A novel bisesquiterpenoid，biatractylolide，from the Chinese herbal plantAtractylodes macrocephala，Journal of Natural Products，1997，60，27-28]。下面首先对结构单元进行解析：IR谱显示结构中具有一个饱和内酯基以及一个α，β-不饱和内酯基团(1765，1746，1675cm-1)。1H-NMR谱和13C-NMR谱与化合物8β-氢-艾里莫芬烷-3，7(11)-二烯-12，8α；15，6α-二内酯[8β-H-eremophil-3，7(11)-dien-12，8α；15，6α-diolide]非常相似[Y F Han等，Sequiterpenes，nortriterpenes and other constituents from Ligularia tongolensis，Chemical andPharmaceutical Bulletin，2005，53，1338-1341；YF Han等，Two new eremophilanolides fromLigularia tongolensis，Chinese Chemical Letters，2005，16，1053-1055]，通过仔细比对，确定式(1)化合物也属于艾里莫芬烷类化合物，通过1H-1HCOSY，HMQC，HMBC等二维数据准确无误的确定化合物的结构单元即为化合物8β-氢-艾里莫芬烷-3，7(11)-二烯-12，8α；15，6α-二内酯且立体构型未变，所以式(1)化合物为两个8β-氢-艾里莫芬烷-3，7(11)-二烯-12，8α；15，6α-二内酯分子结合而成的二聚体。
8β-氢-艾里莫芬烷-3，7(11)-二烯-12，8α；15，6α-二内酯：无色针晶；C15H16O4；熔点m.p.：230-231℃；[α]D 20：+34.0°(氯仿；c0.25)；紫外光谱UVλmax(氯仿)：221nm；红外光谱IRvmax KBr(cm-1)：1766，1739，1681，1446；电喷雾质谱ESI-MS m/z：261[M+H]+；核磁共振氢谱1H-NMR(氘代氯仿，400MHz)δ1.41(3H，单峰，H-14)，1.06(1H，多重峰，H-9a)，1.72(1H，多重峰，H-1a)，1.98(3H，宽单峰，H-13)，2.03(1H，多重峰，H-1b)，2.12(1H，多重峰，H-10β)，2.16(1H，多重峰，H-2a)，2.21(1H，多重峰，H-9b)，2.37(1H，多重峰，H-2b)，4.70(1H，双双峰J＝9.2，2.8Hz，H-8β)，5.14(1H，宽单峰，H-6β)，6.84(1H，三重峰，J＝3.2Hz，H-3)；核磁共振碳谱13C-NMR(氘代氯仿，100MHz)δ9.4(q，C-13)，21.7(t，C-1)，21.9(t，C-2)，26.9(q，C-14)，32.9(t，C-9)，33.5(d，C-10)，43.9(s，C-5)，81.7(d，C-6)，77.3(d，C-8)，125.2(s，C-11)，129.5(s，C-4)，136.9(d，C-3)，155.9(s，C-7)，168.3(s，C-15)，173.4(s，C-12)。
式(1)化合物：8α-[艾里莫芬烷-3′，7′(11′)-二烯-12′，8′α；15′，6′α-二内酯]-艾里莫芬烷3，7(11)-二烯-12，8α；15，6α-二内酯；无色片晶；C30H30O8；[α]D 20+39.0°(氯仿；c0.20)；紫外光谱UVλmax(氯仿)nm：221；红外光谱IRvmax KBr(cm-1)：1765，1746，1675；高分辨电喷雾质谱HR-ESI-MS m/z：536.2276(计算值Calc.For[M+NH4]+536.2284)；核磁共振氢谱1H-NMR(氘代氯仿，400MHz)δ1.48(6H，单峰，H-14和H-14′)，1.31(2H，多重峰，H-9a和H-9′a)，1.69(2H，多重峰，H-2a和H-2′a)，1.97(6H，双峰，J＝2.4Hz，H-13和H-13′)，2.05(2H，多重峰，H-2b和H-2′b)，2.17(2H，多重峰，H-1a和H-1′a)，2.34(2H，多重峰，H-1b和H-1′b)，2.39(2H，多重峰，H-9b和H-9′b)，2.58(2H，多重峰，H-10β和H-10′β)，5.12(2H，宽单峰，H-6β和H-6′β)，6.83(2H，三重峰，J＝3.2Hz，H-3和H-3′)；核磁共振碳谱13C-NMR(氘代氯仿，100MHz)δ10.1(q，C-13和C-13′)，21.2(t，C-1和C-1′)，21.9(t，C-2和C-2′)，26.2(q，C-14和C-14′)，32.1(d，C-10和C-10′)，35.2(t，C-9和C-9′)，44.3(s，C-5和C-5′)，82.9(d，C-6和C-6′)，87.3(s，C-8和8′)，128.5(s，C-11和C-11′)，129.9(s，C-4和C-4′)，136.7(d，C-3和C-3′)，157.4(s，C-7和C-7′)，168.4(s，C-12和C-12′)，170.9(s，C-15和C-15′)。
13C-NMR谱中，原为化合物8β-氢-艾里莫芬烷-3，7(11)-二烯-12，8α；15，6α-二内酯的C-8(δ77.3)信号向低场移动至δ87.3，提示两个结构单元在C-8和C-8′处相连形成二聚体。综述所述，式(1)化合物的结构最终被鉴定为8α-[艾里莫芬烷-3′，7′(11′)-二烯-12′，8′α；15′，6′α-二内酯]-艾里莫芬烷3，7(11)-二烯-12，8α；15，6α-二内酯{8α-[Eremophil-3′，7′(11′)-dien-12′，8′α；15′，6′α-diolide]-eremophil-3，7(11)-dien-12，8α；15，6α-diolide}。
本发明还用该艾里莫芬双内酯二聚体对两种肿瘤细胞株生长的抑制作用的药理实验结果，说明其在抗肿瘤药物研究领域中的新用途。药理实施例给出了代表性化合物的部分活性数据。必须说明，本发明的药理实施例是用于说明本发明而不是对本发明的限制。根据本发明的实质对本发明进行的简单改进都属于本发明要求保护的范围。
药理实施例1：式(1)化合物对KB细胞的细胞毒活性
KB(口腔上皮癌)细胞用RPMI1640培养基培养，培养基中含10％的胎牛血清，100U/mL青霉素和100U/mL的链霉素。细胞以每孔5×103的浓度加入到96孔板中，在37℃含5％CO2潮湿空气的培养箱中培养24小时。
细胞存活率的测定用改良MTT法。细胞经过24小时的孵育后，分别将新配的式(1)化合物的二甲亚砜溶液以浓度梯度加入到各孔中，使孔中式(1)化合物最终浓度分别为100μg/mL，33.3μg/mL，11.1μg/mL和3.7μg/mL。72小时后，加入10μL MTT(5mg/mL)的磷酸盐缓冲液，再继续在37℃培养4小时后，离心5分钟除去未转化的MTT，每孔中加入200μL二甲亚砜，以溶解还原的MTT晶体甲臜(formazan)，所形成的formazan用酶标仪在570nm波长下比色，细胞存活率由样品相对于对照品的比值计算。其中式(1)化合物对KB细胞半抑制浓度(IC50)由剂量效应曲线得到。
式(1)化合物的IC50为：3.23×10-5M；阳性对照顺铂对KB细胞的IC50为5.19×10-6M。
实验结论：KB细胞是测试化合物对肿瘤细胞的细胞毒性的有效工具和评价指标。本实验表明此艾里莫芬双内酯二聚体对KB细胞具有较强的细胞毒性，有可能发展成为新的具有抗肿瘤作用的药物。
药理实施例2：式(1)化合物对BEL-7404细胞的细胞毒活性
BEL-7404(人肝癌)细胞用RPMI 1640培养基培养，培养基中含10％的胎牛血清，100U/mL青霉素和100U/mL的链霉素。细胞以每孔5×103的浓度加入到96孔板中，在37℃含5％CO2潮湿空气的培养中培养24小时。
细胞存活率的测定用改良MTT法，具体方法如药理实施例1。其中式(1)化合物对BEL-7404细胞半抑制浓度(IC50)由剂量效应曲线得到。
式(1)化合物的IC50为：2.55×10-4M；而阳性对照顺铂对BEL-7404细胞的IC50为2.62×10-5M。
实验结论：本实验表明此艾里莫芬双内酯二聚体对BEL-7404细胞具有较强的细胞毒性，有可能发展成为新的具有抗肝癌及相关肿瘤作用的药物。
Claims (5)
1.一种艾里莫芬双内酯二聚体，其特征是：具有式(1)所示结构的8α-[艾里莫芬烷-3’，7’(11’)-二烯-12’，8’α；15’，6’α-二内酯]-艾里莫芬烷3，7(11)-二烯-12，8α；15，6α-二内酯；
2.根据权利要求1所述的艾里莫芬双内酯二聚体在制备抑制口腔上皮癌KB细胞、人肝癌BEL-7404细胞生长活性药物中的应用。
3.根据权利要求1所述的艾里莫芬双内酯二聚体在制备防治人口腔上皮癌、肝癌相关的肿瘤疾病药物中的应用。
4.一种用于防治肿瘤疾病的药物组合物，其含有作为活性成分的治疗有效量的权利要求1所述之艾里莫芬双内酯二聚体或其可药用盐和可药用辅料。
5.根据权利要求4所述的药物组合物，其制剂形式是注射剂、片剂、胶囊剂、气雾剂、栓剂、膜剂、滴丸剂、外用搽剂、软膏剂、控释或缓释剂或纳米制剂。
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