CN102260234B - 愈创木烷型倍半萜的制备方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于医药技术领域，具体为一种愈创木烷型倍半萜的制备方法及应用。该愈创木烷型倍半萜化合物为15-羟基-2-氧-愈创木-3-烯-1α，5α，6β，7α，10α，11β氢-12，6-内酯(15-hydroxy-2-oxo-guaia-3-en-1α，5α，6β，7α，10α，11βH-12，6-olide)，从大叶盘果菊全草中提取分离得到。经实验研究表明，该化合物对多种人体肿瘤细胞具有良好的抑制活性，因此，可以用于制备抗肿瘤药物。
Description
技术领域
本发明属医药技术领域，具体涉及一种从植物大叶盘果菊中分离得到的一个愈创木烷型倍半萜类化合物：15-羟基-2-氧-愈创木-3-烯-1α，5α，6β，7α，10α，11β氢-12，6-内酯(15-hydroxy-2-oxo-guaia-3-eh-1α，5α，6β，7α，10α，11βH-12，6-olide，化合物1)的制备方法和应用。
背景技术
大叶盘果菊(Prenanthes macrophylla Franch.)为菊科(Compositae)盘果菊属(Prenanthes)植物，是中国的特有植物。本属植物全世界约40种，主要分布于热带和温带地区，我国约有16种，其中1种可做药用，有治痈疮肿毒，活血止血的功效。目前对该属植物化学成分报道较少，其主要含有三萜、倍半萜、植物甾醇等。菊科植物富含倍半萜内酯等成分，现代药理研究表明，倍半萜内酯类化合物具有很好的活性，如抗肿瘤、抗炎、抗氧化等。目前，国内外除本实验室曾对大叶盘果菊的石油醚萃取部位化学成分进行研究外，尚未见其化学成分及相关药理活性的报道。
为充分开发利用这一我国特有的植物资源，发明人对大叶盘果菊全草的化学成分及活性进行系统、深入的研究，分离鉴定出一个愈创木烷型倍半萜。体外抗肿瘤活性筛选表明，该化合物有较强的细胞毒活性，为后续深入的研究奠定基础。
发明内容
本发明提供了一个愈创木烷型倍半萜化合物15-hydroxy-2-oxo-guaia-3-eh-1α，5α，6β，7α，10α，11βH-12，6-olide的制备方法及其在制备抗肿瘤药物中的应用，其化学结构式见附图。本发明化合物可按以下步骤制备：
大叶盘果菊干燥全草，粉碎后经95％乙醇室温浸泡提取，减压浓缩去醇得总浸膏。总浸膏用水悬浮后依次用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇进行萃取，得到石油醚、乙酸乙酯和正丁醇3个萃取层。正丁醇层上硅胶柱层析，用乙酸乙酯-甲醇极性梯度洗脱，最后用甲醇冲柱，TLC检测合并成分相同部分。倍半萜富集流分过Sephadex LH-20柱，氯仿-甲醇极性梯度洗脱，经TLC检测，取有土黄色斑点的组分，上硅胶小柱，用石油醚-乙酸乙酯极性梯度洗脱，部分组分有白色粉末析出，再经制备型高效液相色谱仪纯化得该化合物纯品。
具体实施方式
下面的实施例可以使专业技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。根据本发明的实质对本发明进行的简单改进都属于本发明要求保护的范围。
实施例1：本发明化合物的提取、分离及结构鉴定
(1)、提取：取5.5kg大叶盘果菊干燥全草，粉碎后经95％乙醇室温浸泡提取4次，每次7天。减压浓缩去醇后，得浸膏320g。浸膏用水悬浮后依次用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇进行萃取，得到石油醚部分60g，乙酸乙酯部分80g和正丁醇部分130g。
(2)、分离：正丁醇层用等量硅胶拌样上硅胶柱层析，用乙酸乙酯-甲醇(1∶0～0∶1)极性梯度洗脱，最后用甲醇冲柱，合并成分相同部分后共得8个组分(Fr I～FrⅧ)。FrⅢ过SephadexLH-20柱，氯仿-甲醇极性梯度洗脱，经TLC检测，取有土黄色斑点的组分，用等量硅胶拌样，上硅胶小柱(200-300目)，用石油醚-乙酸乙酯极性梯度洗脱，待溶剂挥发后有白色粉末析出。白色粉末用甲醇溶解后经制备型高效液相色谱仪，以甲醇-水为洗脱剂分离得该化合物纯品。本发明化合物的结构鉴定
化合物1：无色针晶(乙酸乙酯)，5％硫酸乙醇溶液显土黄色。EI-MS(m/z)：264[M+]。13C-NMR和DEPT谱显示有2×CH3，3×CH2，7×CH，3×C共计15个碳信号，初步推断该化合物为倍半萜。13C-NMR可见δ211.6为α，β不饱和酮羰基的碳信号，一对双键信号δ129.2和186.2，其中186.2由于与酮羰基共轭使其移向低场。在δ180.4为另一羰基碳信号，δ83.4为一个与氧相连的碳信号，结合NMR谱和质谱推出分子式为C15H20O4，不饱和度为6。1H-NMR谱中出现两个甲基二重峰δ1.19(3H，d，J＝6.8Hz)，0.77(3H，d，J＝7.6Hz)，结合质谱和生源关系，提示该化合物具有愈创木烷型倍半萜内酯的结构特征。
本发明化合物的波谱学数据如下：
EI-MS(m/z)：264[M+]，246[M-H2O]，233，218，206，191，177，163，135，123，107，91，79，69，61，55，43；1H-NMR(400MHz，CD3OD，ppm)：δ6.30(1H，s，H-3)，4.61(1H，brd，J＝20Hz，H-15)，4.50(1H，dd，J＝9，10Hz，H-6)，3.25(1H，m，H-5)，2.82(1H，dd，J＝4，6.8Hz，H-1)，2.55(1H，m，H-9)，2.42(1H，m，H-11)，1.95(1H，m，H-9)，1.86(1H，m，H-8)，1.69(1H，m，H-9)，1.58(1H，m，H-8)，1.19(3H，d，J＝6.8Hz，H-13)，0.77(3H，d，J＝7.6Hz，H-14)。13C-NMR(100MHz，CD3OD，ppm)：δ211.6(C-2)，186.2(C-4)，180.4(C-12)，129.2(C-3)，83.4(C-6)，63.0(C-15)，54.9(C-1)，52.2(C-7)，52.1(C-5)，42.5(C-11)，35.6(C-10)，35.5(C-9)，26.2(C-8)，15.1(C-14)，12.9(C-13)。
以上光谱数据与文献报道的数据一致，因此鉴定化合物1为15-hydroxy-2-oxo-guaia-3-en-1α，5α，6β，7α，10α，11βH-12，6-olide。(Christian Z.，Ernst P.E.，Karl.O.，et al.New Taxonomically Significant Sesquiterpenoids from Leontodon autumnalis.J NatProd，2003，63(6)：812-816.)
实施例2：本发明化合物对人肿瘤细胞系的增殖抑制作用
方法：分别取对数生长期的人肿瘤细胞系K-562、HL-60、MOLT-4和NB4细胞，接种于96孔培养板上，每孔接种分别为量为6000/150μL、6000/150μL、12000/150μL和12000/150μL。实验设药物实验组、阴性对照组和空白对照孔。药物实验组每孔加不同浓度的本发明化合物50μL，每个浓度做3个复孔；阴性对照组每孔加营养液50μL，共设6个复孔；空白对照孔只加营养液200μL，用于仪器调零。作用72h后，离心弃上清，每孔加二甲基亚砜(DMSO)150μL，震荡5min，待结晶完全溶解后，用酶标仪(BIO-RAD产品)在570nm波长处测定每个小孔的吸光度值(A570)，各组取平均值，计算抑制率：IR＝(1-实验组A570/对照组A570)×100％。用SPSS12.0进行统计学分析，并计算IC50。实验重复一次。
结果：见表1和表2。
表1不同浓度化合物1对肿瘤细胞的增殖抑制作用
※：与对照组A570比较，P＜0.05。
表2化合物1对肿瘤细胞的半数抑制浓度
上述实验结果表明，化合物1对多种人肿瘤细胞(K-562、HL-60、MOLT-4和NB-4)均具有显著的增殖抑制作用，并呈剂量依赖性；作用72h的IC50分别为4.49、3.85、4.72和4.47mg/L，说明化合物1具有抗肿瘤作用。因此，化合物1可以用于制备抗肿瘤药物。
Claims (2)
1.具有下述化学结构式的愈创木烷型倍半萜类化合物的制备方法：15-羟基-2-氧-愈创木-3-烯-1α，5α，6β，7α，10α，11β氢-12，6-内酯（15-hydroxy-2-oxo-guaia-3-en-1α,5α,6β,7α,10α,11βH-12,6-olide，化合物1）：
特征在于：其具体步骤如下：
大叶盘果菊干燥全草，粉碎后经95%乙醇室温浸泡提取，减压浓缩去醇得总浸膏，用水悬浮后依次用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇进行萃取，得到石油醚、乙酸乙酯和正丁醇3个萃取层，正丁醇层经反复硅胶柱和SephadexLH-20柱分离，再经制备型高效液相色谱仪纯化得该化合物纯品。
2.根据权利要求1所述的化合物在制备抗肿瘤药物中的应用。
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