CN110305092B - 愈创木烷倍半萜及其制备和应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于医药科技领域，涉及从瑞香科瑞香属植物芫花的根中提取分离的六个新的愈创木烷倍半萜类化合物genkwanoid A(1)，genkwanoid B(2)，genkwanoid C(3)，genkwanoid D(4)，genkwanoid E(5)，genkwanoid F(6)，结构如下。本发明所述化合物是采用ODS柱层析、HP20柱层析、硅胶、HPLC等色谱方法得到的。本发明还涉及化合物1‑6在制备抗AD药物中的应用。本发明制备方法简单，重现性好，所得化合物纯度高，获得的化合物具有明显的对H₂O₂诱导的人SH‑SY5Y细胞氧化损伤的神经保护活性。

Description

愈创木烷倍半萜及其制备和应用

技术领域

本发明属于医药技术领域，涉及愈创木烷倍半萜及其制备和应用。具体涉及从植物芫花的根中提取分离得到的6个愈创木烷倍半萜及该类化合物在制备抗AD药物中的应用。

背景技术

芫花(Daphne genkwa Sieb.et Zucc.)为瑞香科瑞香属植物，为广泛分布于中国和韩国的一种传统中草药。芫花的花蕾自古就被用于治疗泻水逐饮，解毒杀虫，用于水肿胀满，胸腹积水，痰饮积聚，气逆喘咳，二便不利，外治芥藓秃疮，冻疮。对芫花花蕾的研究表明芫花中含有多种化学成分，包括二萜，黄酮，木脂素及香豆素类等化合物。而对芫花的根的化学成分研究较少，研究表明芫花根中含有双黄酮类化合物。本发明所涉及的倍半萜类化合物是通过对芫花根提取制备获得，具有很好的神经保护活性。本发明所涉及的化合物及其活性，迄今为止尚未见有专利或文献报道。

发明内容

本发明提供6个倍半萜类化合物及其制备方法；

本发明还提供所述倍半萜类化合物在制备神经保护药物中的用途；

本发明所述六个从瑞香科瑞香属植物芫花的根中提取分离得到的倍半萜类化合物，结构如下：

本发明的制备技术方案包括如下步骤：

(1)取干燥的芫花根以70％-80％工业乙醇回流提取2-3次,合并提取液浓缩得到浸膏。所得浸膏先后采用石油醚，乙酸乙酯，正丁醇萃取。乙酸乙酯部分经硅胶柱色谱，以二氯甲烷/三氯甲烷-甲醇系统进行梯度洗脱，共收集到4个馏分(A-D)。

(2)馏分A经HP20柱色谱，以乙醇水梯度洗脱，共收集到2个馏分(A1–A2)。

(3)馏分A1，A2经ODS柱色谱，以乙醇水梯度洗脱，共收集到3个馏分(A1-1，A2-1，A3-1)。

(4)馏分A1-1，A2-1和A3-1分别经硅胶柱色谱，收集馏分得到A-1-1-1—A-1-1-3,A-2-1-1—A-2-1-16以及A-3-1-1—A-3-1-14。

(5)馏分A-1-1-1经反相HPLC，以CH₃CN-H₂O洗脱，得到化合物1；馏分A-2-1-2经反相HPLC，以CH₃CN-H₂O洗脱，得到化合物2和3；馏分A-2-1-4经反相HPLC，以CH₃CN-H₂O洗脱，得到化合物4；馏分A-1-1-2经反相HPLC，以CH₃CN-H₂O洗脱，得到化合物5；馏分A-2-1-6经反相HPLC，以CH₃CN-H₂O洗脱，得到化合物6。

其中，

步骤(1)中二氯甲烷/三氯甲烷-甲醇的梯度为：100:1-1:1,具体为：100:1，50:1，30:1，20:1，10:1，5:1，3:1，1:1。

步骤(2)中乙醇水的梯度为：50％-90％。

步骤(3)中乙醇水的梯度为：30％-90％，具体为30％,40％,50％,60％,70％,80％,90％。

步骤(4)中硅胶柱色谱的条件为：石油醚-乙酸乙酯梯度为50:1-1:1，具体为50:1，30:1，20:1，10:1，5:1，3:1，1:1。

步骤(5)中色谱的流动相为：45％-55％的CH₃CN-H₂O。

所得的化合物经过系统结构鉴定，结果如下：

化合物1：黄色油状物(二氯甲烷)，[α]20D+93(c 0.1MeOH)；HRESIMS给出准分子离子峰[M+Na]⁺峰m/z 271.1313(calcd for C₁₅H₂₀O₃Na,271.1305)，结合¹H-NMR、¹³C-NMR推测其分子式为C₁₅H₂₀O₃，计算不饱和度为6。

¹H-NMR(600MHz,CDCl₃)中，δ_H 1.99(3H,d,J＝2.2Hz)，δ_H 1.04(3H,d,J＝7.4Hz)为两个甲基氢信号，δ_H 4.85(1H,br s)4.87(1H,br s)为末端双键氢信号，δ_H 4.00(1H,d,J＝13.7Hz),4.42(1H,d,J＝13.7Hz)为连氧磁不等同的CH₂上偕偶氢信号，δ_H 4.36(1H,s)为连氧叔碳且无偶合的氢信号。¹³C-NMR(100MHz,CDCl₃)显示出15个碳信号，提示化合物1为倍半萜。δc 207.5为孤立的羰基碳信号，δ_C 110.4，146.4为末端双键碳信号，δ_C 129.5，150.9为另一双键碳信号，δ_C 63.6,74.7,86.4为连氧碳信号。通过HSQC谱将全部碳氢直接相关信号进行了全归属。

通过HMBC谱发现，H-2(δ_H 4.69)与C-1(δ_C 150.9),C-4(δ_C 37.1),C-5(δ_C43.9)相关，H-7(δ_H 3.35),H-9(δ_H 4.36)与C-8(δ_C 207.5)相关确定了羰基的位置。H-9(δ_H 4.36)到C-13(δ_C 63.6)，H-12(δ_H 4.85,4.87)到C-7(δ_C 53.8)到C-11(δ_C146.4),C-13(δ_C 63.6)的相关证实了六元氧环的存在。H₃-15(δ_H 1.04)与C-3(δ_C41.9),C-4(δ_C 37.1),C-5(δ_C 43.9)相关，H₃-14(δ_H 1.99)与C-1(δ_C 150.9),C-9(δ_C86.4),C-10(δ_C 129.5)相关确定了甲基的位置。根据以上相关信息建立了化合物1的平面结构。化合物1为愈创木烷型倍半萜。

通过NOESY谱确定了化合物1的相对构型，H₃-15(δ_H 1.04)与H-3β(δ_H1.61)相关,H-3α(δ_H 1.90)与H-5(δ_H 2.37)相关,H-5(δ_H 2.37)与H-7(δ_H 3.35)相关,H-4(δ_H 2.24)与H-2(δ_H 4.69)相关。因此确定化合物1的相对构型为2R*,4S*,5S*,7R*,9R*。

由于化合物1的2位为一个仲醇，采用改良Mosher法确定了化合物1的绝对构型，如下所示，分别通过R-和S-MTPA与化合物1反应脱水分别成R-和S-MTPA酯，然后分别测试其氢谱，将S-MTPA酯的氢化学位移减去R-MTPA酯的氢化学位移,差值如图所示，因此化合物1的2位羟基的绝对构型为R型，因此化合物1的绝对构型为2R,4S,5S,7R,9R。为进一步确定其绝对构型，通过化合物1的计算比旋光度与实测比旋光度进行比对，采用密度泛函理论(DFT)在B3LYP/6-311++G(2d,p)水平下进行计算，从而得到计算比旋光度值。化合物1绝对构型存在两种可能：2R,4S,5S,7R,9R与其对映异构体。化合物1的实测旋光为+93.0，2R,4S,5S,7R,9R构型的计算旋光值为+109.4,其对应异构体为-109.4.因此，化合物1的绝对构型进一步确定为2R,4S,5S,7R,9R。

化合物1的改良Mosher法

经scifinder数据库检索，化合物1为未报道的新化合物，命名为genkwanoid A。

化合物2：黄色油状物(二氯甲烷)，[α]20D+17(c 0.1MeOH)；HRESIMS给出准分子离子峰[M+Na]⁺峰m/z 255.1357(calcd for C₁₅H₂₀O₂Na,255.1356)，结合¹H-NMR、¹³C-NMR推测其分子式为C₁₅H₂₀O₂，计算不饱和度为6。

¹H-NMR(600MHz,CDCl₃)中，δ_H 1.77(3H,s)，δ_H 0.80(3H,d,J＝7.1)为两个甲基氢信号，δ_H 4.81(1H,br s)4.83(1H,br s)为末端双键氢信号，δ_H 3.96(1H,d,J＝13.7),4.35(1H,o)为连氧磁不等同的CH₂上偕偶氢信号，δ_H 4.34(1H,o)为连氧叔碳且无偶合的氢信号。¹³C-NMR(100MHz,CDCl₃)显示出15个碳信号，提示化合物2为倍半萜。δ_C 208.2为孤立的羰基碳信号，δ_C 109.9，146.9为末端双键碳信号，δ_C 123.2，149.1为另一双键碳信号，δ_C63.5,86.2为连氧碳信号。以上碳氢信号与化合物1极为相近，差异在于化合物2缺少一个连氧氢信号，表明化合物1,2具有相同的母核。通过HSQC谱将全部碳氢直接相关信号进行了全归属。

通过HMBC谱发现，H₂-2(δ_H 2.26,2.41)与C-1(δ_C 149.1),C-3(δ_C 31.8),C-5(δ_C43.9)相关，H-7(δ_H 3.31),H-9(δ_H 4.34)与C-8(δ_C 208.2)相关确定了羰基的位置。H-9(δ_H4.34)到C-13(δ_C 63.5)，H-12(δ_H 4.81,4.83)到C-7(δ_C 54.0)到C-11(δ_C146.9),C-13(δ_C63.5)的相关证实了六元氧环的存在。H₃-15(δ_H 0.80)与C-3(δ_C31.8),C-4(δ_C 38.4),C-5(δ_C43.9)相关，H₃-14(δ_H 1.77)与C-1(δ_C 149.1),C-9(δ_C86.2),C-10(δ_C 123.2)相关确定了甲基的位置。另外，如图所示，通过¹H-¹H COSY谱将化合物2的部分连接片段进行了确认。从H-2α(δ_H 2.26)到H-3α(δ_H 1.63),H-3α(δ_H 1.63)到H-4(δ_H 2.1),H-4(δ_H 2.19)到H-5(δ_H2.34),H-5(δ_H 2.34)到H-6α(δ_H 2.11),H-6β(δ_H 1.47),H-6β(δ_H 1.47)到H-7(δ_H 3.31),H-15(δ_H 0.80)到H-4(δ_H 2.19)均存在¹H-¹H COSY相关。根据以上相关信息建立了化合物2的平面结构。化合物2为愈创木烷型倍半萜。

通过NOESY谱确定了化合物2的相对构型，H₃-15(δ_H 0.80)与H-3β(δ_H1.41)相关,H-3α(δ_H 1.63)与H-5(δ_H 2.34)相关,H-5(δ_H 2.34)与H-7(δ_H 3.31)相关。因此确定化合物2的相对构型为4S*,5S*,7R*,9R*。

化合物2的绝对构型是通过化合物2的计算比旋光度与实测比旋光度进行比对确定的，采用密度泛函理论(DFT)，在B3LYP/6-311++G(2d,p)水平下分别对4S,5S,7R,9R构型和其对映异构体进行计算。化合物2的实测旋光为+17.0，4S,5S,7R,9R构型的计算旋光值为+162.8,其对应异构体为-162.8。因此，化合物2的绝对构型进一步确定为4S,5S,7R,9R。

经scifinder数据库检索，化合物2为未报道的新化合物，命名为genkwanoid B。

化合物3：黄色油状物(二氯甲烷)，[α]20D+210(c 0.1MeOH)；HRESIMS给出准分子离子峰[M+Na]⁺峰m/z 269.1149(calcd for C₁₅H₁₈O₃Na,269.1148)，结合¹H-NMR、¹³C-NMR推测其分子式为C₁₅H₁₈O₃，计算不饱和度为7。

¹H-NMR(600MHz,CDCl₃)中，δ_H 2.34(1H,d,J＝2.7)，0.84(1H,d,J＝7.1)为两个甲基氢信号，δ_H 4.90(1H,s)4.90(1H,s)为末端双键氢信号，δ_H 4.07(1H,d,J＝14.3),4.40(1H,d,J＝14.3)为连氧磁不等同的CH₂上偕偶氢信号，δ_H 4.39(1H,o)为连氧叔碳且无偶合的氢信号。¹³C-NMR(100MHz,CDCl₃)显示出15个碳信号，提示化合物3为倍半萜。δ_C 138.6,145.3,207.0为α,β-不饱和酮碳信号，δ_C 110.6，145.5为末端双键碳信号，δ_C 65.2,87.1为连氧碳信号。以上碳氢信号与化合物1极为相近，差异在于化合物3缺少一个连氧氢信号，增加了一个羰基碳信号，且1,10位双键碳信号有较大变化，推测2位为羰基，与1,10位形成α,β-不饱和酮结构。通过HSQC谱将全部碳氢直接相关信号进行了全归属。

通过HMBC谱发现，H₂-3(δ_H 2.09,2.43)and H-4(δ_H 2.35)到C-2(δ_C 206.9)相关证明2位为羰基。H-7(δ_H 3.39),H-9(δ_H 4.39)与C-8(δ_C 207.0)相关确定了羰基的位置。H-9(δ_H 4.39)到C-13(δ_C 65.2)，H-12(δ_H 4.90,4.90)到C-7(δ_C 53.9)到C-11(δ_C 145.5),C-13(δ_C 65.2)的相关证实了六元氧环的存在。H₃-15(δ_H 0.84)与C-3(δ_C48.3),C-4(δ_C 31.4),C-5(δ_C 43.3)相关，H₃-14(δ_H 2.34)与C-1(δ_C 145.3),C-9(δ_C87.1),C-10(δ_C 138.6)相关确定了甲基的位置。根据以上相关信息建立了化合物3的平面结构，化合物3为愈创木烷型倍半萜。

通过NOESY谱确定了化合物3的相对构型，如图所示，H₃-15(δ_H 0.84)与H-3β(δ_H2.09)相关,H-3α(δ_H 2.43)与H-5(δ_H 2.74)相关,H-5(δ_H 2.74)与H-7(δ_H3.39)相关。因此确定化合物3的相对构型为4S*,5S*,7R*,9R*。

为确定化合物3的绝对构型，采用密度泛函理论(DFT)，在B3LYP/6-311++G(2d,p)水平下分别对4S,5S,7R,9R构型和其对映异构体的比旋光度进行计算。化合物3的实测旋光为+210.0，4S,5S,7R,9R构型的计算旋光值为+149.1,其对应异构体为-149.1。因此，化合物3的绝对构型进一步确定为4S,5S,7R,9R。

经scifinder数据库检索，化合物3为未报道的新化合物，命名为genkwanoid C。

化合物4：黄色油状物(二氯甲烷)，[α]20D+23(c 0.1MeOH)；HRESIMS给出准分子离子峰[M+Na]⁺峰m/z 271.1304(calcd for C₁₅H₂₀O₃Na,271.1305))，结合¹H-NMR、¹³C-NMR推测其分子式为C₁₅H₂₀O₃，计算不饱和度为6。

¹H-NMR(600MHz,CDCl₃)中，δ_H 1.77(3H,s)，δ_H 0.81(3H,d,J＝7.1)甲基氢信号，δ_H4.86(1H,br s),4.87(1H,br s)为末端双键氢信号，δ_H 4.21(1H,d,J＝12.3),4.28(1H,d,J＝12.3)为连氧CH₂的偕偶氢信号，δ_H 4.04(1H,d,J＝14.1),4.44(1H,d,J＝14.1)为连氧磁不等同的CH₂上偕偶氢信号，δ_H 4.71(1H,s)为连氧叔碳且无偶合的氢信号。¹³C-NMR(100MHz,CDCl₃)显示出15个碳信号，提示化合物4为倍半萜。δ_C 208.3为孤立的羰基碳信号，δ_C 109.9，146.3为末端双键碳信号，δ_C 127.8，153.0为另一双键碳信号，δ_C 63.7,64.6,86.2为连氧碳信号。以上碳氢信号与化合物2极为相近，差异在于化合物4缺少一个甲基信号，增加一个连氧碳信号(δ_H 4.21，4.28，δ_C 63.7)表明化合物化合物4与2具有相同的母核,其中一个甲基变为羟甲基。通过HSQC谱将全部碳氢直接相关信号进行了全归属。

通过HMBC谱发现，H-7(δ_H 3.33),H-9(δ_H 4.71)与C-8(δ_C 208.3)相关确定了羰基的位置。H-9(δ_H 4.71)到C-13(δ_C 64.6)，H-12(δ_H 4.86,4.87)到C-7(δ_C 54.3)，C-11(δ_C146.,3),C-13(δ_C 64.6)的相关证实了六元氧环的存在。H₃-15(δ_H 0.81)与C-3(δ_C 31.7),C-4(δ_C 38.1),C-5(δ_C 45.3)相关确定了甲基的位置，H₂-14(δ_H 4.21，4.28)与C-1(δ_C153.0),C-9(δ_C 83.1),C-10(δ_C 127.8)相关证实了化合物4中羟甲基的位置。

通过NOESY谱确定了化合物4的相对构型，H₃-15(δ_H 0.80)与H-3β(δ_H 1.41)相关,H-3α(δ_H 1.63)与H-5(δ_H 2.34)相关,H-5(δ_H 2.34)与H-7(δ_H 3.31)相关。因此确定化合物4的相对构型为4S*,5S*,7R*,9R*。

化合物4的绝对构型是通过化合物4的计算比旋光度与实测比旋光度进行比对确定的。分别对4S,5S,7R,9R构型和其对映异构体进行计算，化合物2的实测旋光为+23.0，4S,5S,7R,9R构型的计算旋光值为+198.0,其对应异构体为-198.0。因此，化合物4的绝对构型确定为4S,5S,7R,9R。

经scifinder数据库检索，化合物4为未报道的新化合物，命名为genkwanoid D。

化合物5：黄色油状物(二氯甲烷)，[α]20D+89(c 0.1MeOH)；HRESIMS给出准分子离子峰[M+Na]⁺峰m/z 257.1505(calcd for C₁₅H₂₂O₂Na,257.1512)，结合¹H-NMR、¹³C-NMR推测其分子式为C₁₅H₂₂O₂，计算不饱和度为5。

¹H-NMR(600MHz,CDCl₃)中，δ_H 1.71(3H,s)，δ_H 0.76(3H,d,J＝7.1)为两个甲基氢信号，δ_H 4.72(1H,br s)4.75(1H,br s)为末端双键氢信号，δ_H 3.72(1H,d,J＝12.6),4.11(1H,d,J＝12.6)为连氧磁不等同的CH₂上偕偶氢信号，δ_H 4.07(1H,t,J＝5.1),4.24(1H,d,J＝5.1)为连氧且相互产生偶合的氢信号。¹³C-NMR(100MHz,CDCl₃)显示出15个碳信号，提示化合物5为倍半萜。δ_C 109.1，149.0为末端双键碳信号，δ_C 120.9，147.5为另一双键碳信号，δ_C 61.6,74.7,80.1为连氧碳信号。以上碳氢信号与化合物2极为相近，区别在于化合物5不存在羰基信号，多出一个连氧碳信号，表明化合物2和5具有相同的母核，化合物2的羰基在化合物5变为羟基。通过HSQC谱将全部碳氢直接相关信号进行了全归属。

通过HMBC谱发现，H₃-15(δ_H 0.76)与C-3(δ_C 32.3),C-4(δ_C 38.6),C-5(δ_C42.3)相关，H₃-14(δ_H 1.71)与C-1(δ_C 147.5),C-9(δ_C 86.2),C-10(δ_C 123.2)相关确定了甲基的位置。H-8与C-6(δ_C 33.4),C-9(δ_C 80.1),C-10(δ_C 120.9)产生相关，证实8位为连氧氢。根据以上相关信息建立了化合物5的平面结构，化合物5为愈创木烷型倍半萜。

通过NOESY谱确定了化合物5的相对构型，H₃-15(δ_H 0.76)与H-3β(δ_H 1.45)相关,H-3α(δ_H 1.67)与H-5(δ_H 3.33)相关,H-5(δ_H 3.33)与H-7(δ_H 2.89)相关,H-8(δ_H 4.07)与H-13α(δ_H 3.72)相关。因此确定化合物5的相对构型为4S*,5S*,7R*,8R*,9R*。

为确定化合物5的绝对构型，分别对4S,5S,7R,8R,9R构型和其对映异构体进行比旋光度计算。化合物5的实测旋光为+89.0，4S,5S,7R,8R,9R构型的计算旋光值为+183.0，其对应异构体为-183.0。因此，化合物5的绝对构型确定为4S,5S,7R,8R,9R。

经scifinder数据库检索，化合物5为未报道的新化合物，命名为genkwanoid E。

化合物6：黄色油状物(二氯甲烷)，[α]20D+67(c 0.1MeOH)；HRESIMS给出准分子离子峰[M+Na]⁺峰m/z 273.1467(calcd for C₁₅H₂₀O₂Na,273.1461)，结合¹H-NMR、¹³C-NMR推测其分子式为C₁₅H₂₂O₃，计算不饱和度为5。

¹H-NMR(600MHz,CDCl₃)中，δ_H 1.68(3H,s)，δ_H 0.72(3H,d,7.1)为两个甲基氢信号，δ_H 4.83(1H,s)5.14(1H,s)为末端双键氢信号，δ_H 3.92(1H,d,12.8),4.23(1H,d,12.8)为连氧磁不等同的CH₂上偕偶氢信号，δ_H 3.89(1H,d,5.4),4.31(1H,d,5.4)为连氧且相互产生偶合的氢信号。¹³C-NMR(100MHz,CDCl₃)显示出15个碳信号，提示化合物6为倍半萜。δ_C106.4,151.4为末端双键碳信号，δ_C 120.1,146.9为另一双键碳信号，δ_C 64.8,74.9,79.0,79.8为连氧碳信号。以上碳氢信号与化合物5极为相近，区别在于化合物6多一个连氧碳信号，且8,9位产生偶合裂分为d峰，偶和常数为5.4Hz，推测化合物5和6具有相同的母核，化合物6在7位增加一个羟基。通过HSQC谱将全部碳氢直接相关信号进行了全归属。

通过HMBC谱发现，H₃-15(δ_H 0.72)与C-3(δ_C 32.2),C-4(δ_C 38.5),C-5(δ_C40.5)相关，H₃-14(δ_H 1.68)与C-1(δ_C 146.9),C-9(δ_C 79.8),C-10(δ_C 120.1)相关确定了甲基的位置，H₂-12(δ_H 4.83,5.14)与C-7(δ_C 74.9),C-11(δ_C 151.4),C-13(δ_C 64.8)相关，H-9(δ_H4.31)与C-8(δ_C 79.0),C-13(δ_C 64.8)相关，H₂-6(δ_H 1.87,1.98)与C-7(δ_C 74.9)的相关证实7位是一个羟基。根据以上相关信息建立了化合物6的平面结构，化合物6为愈创木烷型倍半萜。

通过NOESY谱确定了化合物6的相对构型，H₃-15(δ_H 0.72)与H-3β(δ_H 1.44)相关,H-3α(δ_H 1.64)与H-5(δ_H 3.53)相关,H-5(δ_H 3.53)与H-9(δ_H 4.31)相关,H-8(δ_H 3.89)与H-9(δ_H 4.31)相关,H-8(δ_H 3.89)与H-13(δ_H 3.92)相关。因此确定化合物6的相对构型为4S*,5S*,7S*,8S*,9R*。

为确定化合物6的绝对构型，分别对4S,5S,7S,8S,9R构型和其对映异构体进行比旋光度计算。化合物6的实测旋光为+67.0，4S,5S,7S,8S,9R构型的计算旋光值为+196.4，其对应异构体为-196.4。因此，化合物6的绝对构型确定为4S,5S,7S,8S,9R。

经scifinder数据库检索，化合物6为未报道的新化合物，命名为genkwanoid F。

化合物1-3的¹H NMR数据

化合物4-6的¹H NMR数据

化合物1-6的13C NMR数据

化合物1-6的HMBC相关

化合物1-6的NOESY相关

对本发明涉及的6个愈创木烷型倍半萜进行神经保护活性评价。结果表示化合物1-6显示出与阳性药Trolox相当的对H₂O₂诱导的SH-SY5Y神经细胞损伤保护作用活性。因此，本发明所述的愈创木烷倍半萜具有临床治疗抗AD药物的潜力。

附图说明：

图1，化合物1的HMBC谱；

图2，化合物1的HSQC谱；

图3，化合物1的NOESY谱；

图4，化合物2的HMBC谱；

图5，化合物2的HSQC谱；

图6，化合物2的NOESY谱；

图7，化合物2的¹H-¹H COSY谱；

图8，化合物3的HMBC谱；

图9，化合物3的HSQC谱；

图10，化合物3的NOESY谱；

图11，化合物4的HMBC谱；

图12，化合物4的HSQC谱；

图13，化合物4的NOESY谱；

图14，化合物5的HMBC谱；

图15，化合物5的HSQC谱；

图16，化合物5的NOESY谱；

图17，化合物6的HMBC谱；

图18，化合物6的HSQC谱；

图19，化合物6的NOESY谱；

图20为化合物1-6对H2O2-SH-SY5Y细胞损伤的神经保护活性；细胞存活率以百分比表示(对照组为100％)；所有数据以means±SD表示(三次独立实验)；Trolox为阳性药。

具体实施方式

下面所列实施例有助于本领域技术人员更好地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。

实施例1芫花根新倍半萜化合物1-6的制备

取干燥的芫花根(50kg)以70％工业乙醇回流提取三次,合并提取液浓缩得到浸膏。所得浸膏先后采用石油醚，乙酸乙酯，正丁醇萃取。乙酸乙酯(1000g)部分经硅胶柱色谱(200-300目)，以二氯甲烷-甲醇系统进行梯度洗脱，共收集到4个馏分(A-D)。馏分A经HP20柱色谱，以乙醇水(50％，90％)洗脱，共收集到2个馏分(A1–A2)。馏分A1(30g)，A2(60g)经ODS柱色谱，以乙醇水梯度洗脱(30％,40％,50％,60％,70％,80％,90％)，共收集到3个馏分(A1-1，A2-1，A3-1)。馏分A1-1(5g)，A2-1(20g)和A3-1(23g)分别经硅胶柱色谱，收集馏分得到A-1-1-1—A-1-1-3,A-2-1-1—A-2-1-16以及A-3-1-1—A-3-1-14。馏分A-1-1-1经反相HPLC，以CH₃CN-H₂O(57:43)洗脱，得到化合物1(331mg,t_R15.5min)；馏分A-2-1-2经反相HPLC，以CH₃CN-H₂O(48:52)洗脱，得到化合物2(62mg,t_R 30.2min)和3(23mg,t_R 37.9min)；馏分A-2-1-4经反相HPLC，以CH₃CN-H₂O(48:52)洗脱，得到化合物4(14mg,t_R 31.1min)；馏分A-1-1-2经反相HPLC，以CH₃CN-H₂O(57:43)洗脱，得到化合物5(10mg,t_R 28.5min)；馏分A-2-1-6经反相HPLC，以CH₃CN-H₂O(45:55)洗脱，得到化合物6(43mg,t_R

15.8min)。

实施例2芫花根新倍半萜化合物1-6的神经保护活性

利用MTT实验，考察化合物对H₂O₂诱导的SH-SY5Y神经细胞损伤保护作用的活性。将细胞放置在96孔板中，以100μL培养液静置12h，并使用不同浓度的化合物1-6(25,50,100μM)预处理SH-SY5Y神经细胞1h，后加入终浓度为200μM的H₂O₂作用4h。随后将培养液替换为含有0.5mg/mL MTT的磷酸盐缓冲溶液并在37℃下放置4h。除去上清液并加入DMSO(150mL/孔)，以H₂O₂(200μM)单独处理的细胞为对照组，以trolox为阳性药。检测不同浓度处理的细胞在490nm利用紫外分光光度计进行检测(Thermo Scientific Multiskan MK3,上海,中国)。细胞的存活程度以存活百分比表示，并利用GraphPad Prism 6软件进行分析，结果如图20所示。

Claims (9)

1.如下结构所示的化合物：

2.如权利要求1所述的化合物的制备方法，其特征在于，

(1)取干燥的芫花根以70-80％乙醇回流提取2-3次,合并提取液浓缩得到浸膏，所得浸膏先后采用石油醚，乙酸乙酯，正丁醇萃取，乙酸乙酯部分经硅胶柱色谱，以二氯甲烷/三氯甲烷-甲醇系统进行梯度洗脱，共收集到4个馏分A–D；

(2)馏分A经HP20柱色谱，以乙醇水梯度洗脱，共收集到2个馏分A1–A2；

(3)馏分A1，A2经ODS柱色谱，以乙醇水梯度洗脱，共收集到3个馏分A1-1，A2-1，A3-1；

(4)馏分A1-1，A2-1和A3-1分别经硅胶柱色谱，收集馏分得到A-1-1-1至A-1-1-3,A-2-1-1至A-2-1-16以及A-3-1-1至A-3-1-14；

馏分A-1-1-1，A-2-1-2，A-2-1-4，A-1-1-2，A-2-1-6分别经反相HPLC，以CH₃CN-H₂O洗脱，得到化合物1和5。

3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中二氯甲烷/三氯甲烷-甲醇的梯度为：100:1-1:1。

4.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中乙醇水的浓度梯度为：50％-90％；步骤(3)中乙醇水的浓度梯度为：30％-90％。

5.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(4)中硅胶柱色谱的条件为：石油醚-乙酸乙酯梯度50：1-1：1。

6.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(5)中，馏分A-1-1-1，A-2-1-2，A-2-1-4，A-1-1-2，A-2-1-6经反相HPLC，流动相为：45％-55％的CH₃CN-H₂O。

7.一种药物组合物，包含权利要求1的化合物和药学上可接受的载体或赋形剂。

8.权利要求1所述的化合物或权利要求7所述的药物组合物在制备神经保护药物中的应用。

9.权利要求1所述的化合物或权利要求7所述的药物组合物在制备抗AD药物中的应用。

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