CN110511194B

CN110511194B - 四氢呋喃型木脂素化合物及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN110511194B
Application number: CN201910886266.3A
Authority: CN
Inventors: 宋少江; 黄肖霄; 李双双; 徐志勇
Original assignee: Shenyang Pharmaceutical University
Current assignee: Shenyang Pharmaceutical University
Priority date: 2019-09-19
Filing date: 2019-09-19
Publication date: 2021-03-05
Anticipated expiration: 2039-09-19
Also published as: CN110511194A

Abstract

本发明属于医药技术领域，涉及四氢呋喃型木脂素类化合物及其制备方法和应用，具体涉及从药用植物白英全草中分离得到的5个具有相同平面结构的四氢呋喃型木脂素，包括两对对映异构体和一个内消旋体，及其在制备抗阿尔茨海默症(AD)药物方面的应用。所述的化合物结构如下：

Description

四氢呋喃型木脂素化合物及其制备方法和应用

技术领域：

本发明属于医药技术领域，涉及四氢呋喃型木脂素类化合物及其制备方法和应用，具体涉及从药用植物白英全草中分离得到的5个具有相同平面结构的四氢呋喃型木脂素，包括两对对映异构体和一个内消旋体，及其在制备抗阿尔茨海默症(AD)药物方面的应用。

背景技术：

白英(Solanum lyratum Thunb.)为茄科茄属多年草质藤本，全草及根入药，其产于甘肃、陕西、山西、河南、山东诸省。日本、朝鲜、中南半岛也有分布。白英味苦、微寒、有小毒，其药用历史久远，最早见于《神农本草经》记载，列为上品，为传统中药。白英具有清热利湿、解毒消肿、抗癌等功能，主治感冒发热、黄疸型肝炎、胆囊炎、胆石症、子宫糜烂、肾炎水肿等症，临床上用于治疗各种癌症，尤其对子宫颈癌、肺癌、声带癌等有一定疗效。

阿尔茨海默病(Alzheimer disease，AD)：又叫老年性痴呆，是一种常见的中枢神经系统变性疾病，主要表现为渐进性记忆障碍、认知功能障碍、人格改变及语言障碍等神经精神症状，严重影响社交、职业与生活功能。逐渐发生的记忆障碍(memory impairment)或遗忘是AD的重要特征或首发症状。AD的病因及发病机制尚未阐明，特征性病理改变为β淀粉样蛋白沉积形成的细胞外老年斑和tau蛋白过度磷酸化形成的神经细胞内神经原纤维缠结，以及神经元丢失伴胶质细胞增生等。本发明选用的AD实验模型为MPP⁺诱导的SH-SY5Y细胞模型。1-甲基-4-苯基吡啶离子(MPP⁺)是1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(MPTP)的活性代谢产物，能产生对中脑黑质多巴胺能神经元的选择性破坏作用，从而发挥其诱导AD的毒性作用。

发明内容：

本发明涉及五种从茄科茄属植物白英(Solanum lyratum Thunb.)中分离得到的四氢呋喃型木脂素类化合物，结构如下：

本发明包括如下制备技术方案：

利用白英全草制备四氢呋喃型木脂素类化合物的方法，包括如下步骤：

(1)取干燥的白英全草以70-80％乙醇加热回流提取2-3次，合并提取液浓缩得浸膏；

(2)步骤(1)得到的浸膏依次用乙酸乙酯和正丁醇以1:1-1:1.5的体积比进行萃取，萃取3-4次；

(3)步骤(2)所得乙酸乙酯层和正丁醇层干浸膏分别经硅胶柱色谱，均以二氯甲烷-甲醇系统(50:1-1:1)进行快速梯度洗脱，经硅胶薄层检识两层馏分进行合并后共得到6个馏分A、B、C、D、E、F。

馏分A经ODS柱色谱，以乙醇-水系统20％-90％进行梯度洗脱，经薄层检识和自动分析HPLC分析合并后进一步得到了四个组分A₁、A₂、A₃、A₄。

所得组分A₃经硅胶柱色谱以石油醚-乙酸乙酯系统15:1-0:1进行梯度洗脱，共得到30份样品，后经薄层检识和HPLC分析进行合并得到7个组分3.1-3.7。

利用制备HPLC对组分3.7以60-62％的甲醇-水系统进行分离，得到了3.7.1-3.7.6。

利用半制备HPLC对3.7.1以乙腈-水系统50％-55％进行洗脱，得到了化合物2和3，并利用相同方法，对3.7.2进行分离得到了化合物1。

利用手性色谱柱对化合物1和2进行手性拆分分别得到了化合物1a/1b和2a/2b。其手性制备拆分方法为：利用Daicel Chiralpak IC手性色谱柱，流动相为正己烷-异丙醇(1:1)，流速为0.3mL/min，紫外检测器检测波长为254nm。

本发明所述的提取、制备方法，适用于茄科茄属植物白英(SolanumlyratumThunb.)。

本发明中所述的手性拆分条件，适用于化合物1和2。

本发明所得化合物的结构鉴定结果如下：

利用紫外光谱、高分辨质谱、一维和二维NMR技术对化合物1、2、3的平面结构及相对构型进行确定。通过比较实测ECD和计算ECD谱图，对拆分后的光学纯化合物1a/1b-2a/2b的绝对构型进行确定。

化合物1:黄色油状化合物，HRESIMS给出准分子离子峰m/z 567.2566[M+Na]⁺(计算为C₃₀H₄₀O₉Na,567.2565)，结合¹H,¹³C-NMR数据确定其分子式为C₃₀H₄₀O₉，计算不饱和度为11。¹H NMR和¹³C-NMR(400/100MHz,CDCl₃)谱中，δ6.99(1H,d,J＝1.3Hz,H-2),6.93(1H,d,J＝8.1Hz,H-5),6.97(1H,dd,J＝8.1,1.3Hz,H-6),6.90(1H,br.s,H-2′),6.89(1H,overlap,H-5′),6.88(1H,br.d,J＝8.4Hz,H-6′)提示为两个1,3,4-三取代苯环系统。δ4.64(1H,d,J＝8.5Hz,H-7),5.10(1H,d,J＝7.2Hz,H-7′)；δ83.1(C-7),81.3(C-7′)提示为两个连氧的次甲基质子。δ4.29(1H,dd,J＝11.3,5.4Hz,H-9a),4.22(1H,dd,J＝11.3,5.7Hz,H-9b),3.82(2H,m,H-9)；δ64.1(C-9),64.5(C-9′)提示为两个连氧的亚甲基。δ2.35(1H,dq,J＝8.5,5.4Hz,H-8),2.69(1H,m,H-8′)；δ50.5(C-8),45.7(C-8′)提示为两个次甲基信号。δ3.93(s,3-OCH₃),3.89(s,3′-OCH₃)；δ56.1(3,3′-OCH₃)提示为两个甲氧基信号。δ2.17(1H,d,J＝7.2Hz,H-2″),2.02(1H,d,J＝7.3Hz,H-2″′),2.06(1H,m,H-3″),1.96(1H,m,H-3″′),0.96(2H,dd,J＝6.6,1.8Hz,H-4″,5″),0.87(2H,dd,J＝6.5,1.1Hz,H-4″′,5″′)以及碳谱中δ173.1(C-1″),172.9(C-1″′),43.5(C-2″),43.3(C-2″′),25.8(C-3″),25.6(C-3″′),22.6(C-4″,4″′),22.5(C-5″,5″′)提示为两个异戊酯基片段。以上氢谱和碳谱数据显示结构中可能存在两个相似的片段。根据分子式提供的信息，推测结构中可能存在一个呋喃环。

通过HSQC谱对直接相连的碳氢信号进行了归属。在HMBC谱中，δ4.64(H-7)与δ132.3(C-1),109.4(C-2)及119.8(C-6)有相关，δ5.10(H-7′)与δ129.7(C-1′),108.9(C-2′)及119.4(C-6′)有相关说明两个苯环连在呋喃环的C-7和C-7′位。δ4.29(H-9b)与δ173.1(C-1″)存在相关，δ3.83(H-9′a)与δ172.9(C-1″′)存在相关，说明结构中的两个异戊酯基片段与C-9,C-9′位直接相连。δ2.35(H-8)与δ64.1(C-9),83.1(C-7),45.7(C-8′)存在相关，以及δ2.69(H-8′)与δ64.5(C-9′),81.3(C-7′),50.5(C-8)存在相关，说明异戊酯基通过C-9,C-9′位的亚甲基取代在呋喃环的C-8,C-8′位。δ3.93(3-OCH₃)与δ146.8(C-3)存在相关，δ3.89(3′-OCH₃)与δ146.6(C-3′)存在相关，说明了两个甲氧基的连接位置。根据以上信息，得到该化合物的平面结构。由此推测化合物1为四氢呋喃型木脂素类化合物。化合物1的相对构型是通过NOESY谱确定的。在NOESY谱中可观察到H-9与H-7/H-8′,H-8与H-6/H-7′/H-9′以及H-8′与H-7/H-9/H-6′的相关，证明了H-7与H-8,H-7′与H-8′,H-8与H-8′都为反式取向。

化合物2:黄色油状化合物，HRESIMS给出准分子离子峰m/z 567.2566[M+Na]⁺(计算为C₃₀H₄₀NaO₉,567.2565)，结合¹H,¹³C-NMR数据确定其分子式为C₃₀H₄₀O₉，不饱和度为11。¹H(400MHz,CDCl₃)与¹³C NMR(100MHz,CDCl₃)谱中显示出2个甲氧基、4个甲基、4个次甲基、2个亚甲基、2个酯羰基碳以及12个芳香碳(其中6个为季碳)。对NMR谱图数据进行分析，发现化合物2的谱图与化合物1的类似，其主要的不同为C-9和C-9′处的化学位移值，化合物2中为δ61.9(C-9),60.7(C-9′)，而化合物1中为δ64.1(C-9),64.5(C-9′)。故推测化合物2与化合物1具有相同的平面结构。化合物2的相对构型也是通过NOESY谱确定的，在NOESY谱中可观察到H-9与H-7/H-9′,H-9′与H-2′/H-6′存在相关，证明了H-8,H-7′,H-8′为同一取向，而H-7为相反的取向。

化合物1和2的比旋光度接近于零且无明显的CD吸收，推测其为外消旋混合物。使用Daicel Chiralpak IG手性色谱柱对化合物1和2进行进一步的分离，结果得到两对对映异构体1a/1b和2a/2b。它们的绝对构型是通过比较计算和实测ECD来确定的。1a的实验CD谱中的Cotton效应峰与预设为7S,8R,7′S,8′R构型的计算ECD谱中的Cotton效应峰能够较好的吻合。2a的实验CD谱中的Cotton效应峰与预设为7R,8R,7′R,8′S构型的计算ECD谱中的Cotton效应峰能够较好的吻合。由此可以确定化合物1a,1b,2a,2b的绝对构型分别为7S,8R,7′S,8′R、7R,8S,7′R,8′S、7R,8R,7′R,8′S和7S,8S,7′S,8′R构型。

化合物3：黄色油状化合物，HRESIMS给出准分子离子峰m/z 567.2541[M+Na]⁺(计算为C₃₀H₄₀NaO₉,567.2565)，结合¹H,¹³C-NMR数据确定其分子式为C₃₀H₄₀O₉，其与化合物1和2的分子式相同。其中最显著的差异是化合物3在氢谱和碳谱中出现了叠加共振的信号，说明化合物3具有磁性等同的对称面。对二维核磁数据的分析验证了所有氢和碳信号的分配。在NOESY谱中，可以观察到H-7与H-9,H-8与H-2和H-6的相关，由此确定了化合物的相对构型，为(rel)-(7β7′β,8α,8′α)-3,3′-二甲氧基-4,4′-二羟基-7,7′-环氧木脂素-9,9′-异戊酯基。化合物3为内消旋化合物，不具有旋光性和Cotton效应。

表1 1-3在CDCl₃中¹H(400MHz)与¹³C(100MHz)NMR数据

对发明所述五个新的四氢呋喃型木脂素类化合物对MPP⁺诱导的人SH-SY5Y神经细胞损伤的保护作用进行了考察，体外细胞试验结果表明化合物1-3对MPP⁺诱导的人SH-SY5Y细胞氧化损伤具有显著的保护作用。因此本发明所述的新的四氢呋喃型木脂素类化合物，具有抗AD作用的医药新用途。

附图说明：

图1化合物1的UV谱；

图2化合物1的HRESIMS谱；

图3化合物1的HMBC谱(600MHz,CDCl₃)；

图4化合物1的HSQC谱(600MHz,CDCl₃)；

图5化合物1的¹H-¹H COSY谱(600MHz,CDCl₃)；

图6化合物1的NOESY谱(600MHz,CDCl₃)；

图7化合物1的手性拆分色谱图；

图8化合物2的UV谱；

图9化合物2的HRESIMS谱；

图10化合物2的HMBC谱(600MHz,CDCl₃)；

图11化合物2的HSQC谱(600MHz,CDCl₃)；

图12化合物1的¹H-¹H COSY谱(600MHz,CDCl₃)；

图13化合物2的NOESY谱(600MHz,CDCl₃)；

图14化合物2的手性拆分色谱图；

图15化合物3的UV谱；

图16化合物3的HRESIMS谱；

图17化合物3的HMBC谱(600MHz,CDCl₃)；

图18化合物3的HSQC谱(600MHz,CDCl₃)；

图19化合物3的¹H-¹H COSY谱(600MHz,CDCl₃)；

图20化合物3的NOESY谱(600MHz,CDCl₃)；

图21化合物1的HMBC相关图；

图22化合物1-3的NOESY相关图；

图23化合物1a/1b-2a/2b实测ECD与计算ECD比对图。

具体实施方式：

下面所列实施例有助于本领域技术人员更好地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。

实施例1：化合物1-3的制备。

选用茄科植物白英(S.lyratum)的干燥全草40kg为原料，用70％工业乙醇加热回流提取3次，每次2小时。经减压浓缩后得乙醇粗提物2500g，浸膏分别采用乙酸乙酯及正丁醇以1:1的体积比进行萃取，萃取3-5次，得到乙酸乙酯层干浸膏293g，正丁醇干浸膏1114g，两层浸膏分别进行快速减压柱色谱分离，都以二氯甲烷-甲醇混合溶剂进行梯度洗脱，共收集到40～50个馏分，经硅胶薄层检识后，合并得到6个馏分A(32.5g)、B(44.8g)、C(43.2g)、D(186.4g)、E(49.0g)、F(207.2g)。馏分A经ODS色谱柱，以20％-90％乙醇-水进行梯度洗脱，并经薄层检识和HPLC分析(50-100％甲醇水)得到四个组分A₁(4.6g)、A₂(3.6g)、A₃(7.2g)、A₄(13.2g)。所得组分A₃(7.2g)经硅胶柱色谱以石油醚-乙酸乙酯系统15:1-0:1进行梯度洗脱，共得到30个组分，后经薄层检识和HPLC分析(80％甲醇水)进行合并得到7个组分3.1-3.7。利用制备HPLC对组分3.7以62％的甲醇-水系统进行分离，得到了3.7.1-3.7.6。利用半制备HPLC对3.7.1以乙腈-水系统50％-55％进行洗脱，得到了化合物2(5.9mg,t_R40.8min)和3(12.3mg,t_R 43.4min)，利用相同方法，对3.7.2进行分离得到化合物1(11.3mg,t_R47.4min)。并利用手性色谱柱Daicel Chiralpak IC对化合物1进行手性拆分(正己烷/异丙醇，1:1，流速0.3ml/min)得到化合物1a(4.6mg,t_R 32.8min)和1b(4.3mg,t_R 45.1min)，用相同的条件对化合物2进行手性拆分(正己烷/异丙醇，1:1，流速0.3ml/min)得到化合物2a(2.4mg,t_R 22.9min)和2b(2.5mg,t_R 26.1min)。

实施例2：化合物1-3对体外MPP⁺诱导的人SH-SY5Y神经细胞损伤保护作用的考察。

利用常规的MTT法考察化合物对MPP⁺诱导的SH-SY5Y细胞损伤的保护作用。将经胰蛋白酶消化后的SH-SY5Y细胞均匀的接种在96孔板中，置于培养箱中培养12h，样品组中加入不同浓度的化合物(12.5,25,50μM)预处理SH-SY5Y神经细胞1h，对照组与模型组中加入等体积的空白培养基预处理1h，在模型组与加药组中加入1mM的MPP⁺处理细胞36h。随后将培养液替换为含有0.5mg/mL MTT的磷酸盐缓冲溶液并在37℃下放置4h。吸去上清液，每孔加入150mL的DMSO于微量振荡器上振荡5min，用酶标仪在490nm波长处检测吸光度值，实验操作3次。细胞存活率(％)＝[A_490(sample)–A_490(control)]/[A_490(control)–A_490(blank)]×100％。MTT实验结果显示，化合物1-3在不同浓度下均表现出显著的保护作用，尤其在50μM浓度下作用最强，相较于阳性药的52.28±2.16％，并且对映异构体2a和2b在加药浓度为25μM浓度下表现出明显的立体选择性的神经保护活性差异(2a:82.66％；2b:69.03％)。

表2给药后细胞存活率

Claims

1.如下结构所示四氢呋喃型木脂素类化合物或其盐

2.权利要求1所述的四氢呋喃型木脂素类化合物或其盐的制备方法，其特征在于：

(1)白英干燥全草以工业乙醇加热回流提取，合并提取液浓缩得浸膏，浸膏分别采用乙酸乙酯和正丁醇进行萃取，并将所得乙酸乙酯层和正丁醇层干浸膏分别经硅胶柱色谱，均以二氯甲烷-甲醇50:1-1:1进行快速梯度洗脱，经硅胶薄层检识两层馏分进行合并后共得到6个馏分A、B、C、D、E、F；

(2)馏分A经ODS柱色谱，以乙醇-水系统进行梯度洗脱，共收集到四个组分A₁、A₂、A₃、A₄；

(3)所得组分A₃经硅胶柱色谱以石油醚-乙酸乙酯系统15:1-0:1进行梯度洗脱，经薄层检识和HPLC分析进行合并得到7个组分3.1-3.7；

(4)利用制备HPLC对组分3.7以62％的甲醇-水系统进行分离，得到了3.7.1-3.7.6；

(5)利用半制备HPLC对3.7.1以乙腈-水系统50％-55％进行洗脱，得到了化合物2和3，并利用相同方法，对3.7.2进行分离得到了化合物1；

(6)对化合物1和2进行手性拆分得到化合物1a/1b和2a/2b。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：

步骤(1)中，白英干燥全草以70-80％乙醇回流提取2-3次；乙酸乙酯和正丁醇各萃取3-4次。

4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于:

步骤(2)中洗脱液为体积比为：20:80-90:10的乙醇水。

5.一种药物组合物，包含权利要求1所述的四氢呋喃型木脂素类化合物或其盐和药学上可接受的载体或赋形剂。

6.权利要求1所述的四氢呋喃型木脂素类化合物或其盐或权利要求5所述的药物组合物在制备保护MPP⁺诱导的SH-SY5Y细胞损伤的药物中的应用。

7.权利要求1所述的四氢呋喃型木脂素类化合物在制备神经保护药物中的应用。

8.权利要求5所述的药物组合物在制备神经保护药物中的应用。