CN110759882B - 二氢沉香呋喃倍半萜及医药用途 - Google Patents

二氢沉香呋喃倍半萜及医药用途 Download PDF

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Abstract

本发明属于医药技术领域，涉及从卫矛科雷公藤属植物雷公藤(Tripterygium wilfordii)中提取分离的四个新的二氢沉香呋喃倍半萜类化合物triptersinone A,triptersinone B,triptersinone C,triptersinone D,它们具有相同的二氢沉香呋喃母核，其结构如下：本发明还涉及该类新化合物及其药物组合物在制备神经保护活性药物中的应用，具体涉及其在制备抗帕金森氏综合症(PD)药物中的应用。本发明制备方法简单，重现性好，制备的化合物纯度高。

Description

二氢沉香呋喃倍半萜及医药用途
技术领域：
本发明属于医药技术领域，涉及二氢沉香呋喃倍半萜及医药用途，尤其涉及植物雷公藤叶中制备二氢沉香呋喃类新倍半萜的方法及这类化合物在制备抗帕金森病(PD)方面的应用。
背景技术：
雷公藤(Tripterygium wilfordii)，为卫矛科(Celastraceae)，雷公藤亚科，雷公藤属植物。别名为黄藤根、黄药、水莽草、断肠草等，分布于浙江、安徽、江西、湖南、广东、福建、台湾等地。性凉，味苦、辛，有大毒，具有祛风除湿、活血通络、消肿止痛、杀虫解毒等功效。主要用于治疗类风湿性关节炎、红斑狼疮，麻风反应、肺结核等。
帕金森病：(Parkinson’s disease，PD)一种常见的神经系统变性疾病，其最主要的病理性改变是中脑黑质多巴胺能神经元的变性死亡，由此引起纹状体多巴胺能神经元含量显著性减少而致病。PD常见于中老年人，流行病学调查显示，PD目前影响全世界1000多万人，我国患病人数达170多万人。导致这一病理改变的确切病因目前仍不清楚，遗传因素、环境因素、年龄老化、氧化应激等均可能参与多巴胺能神经元的变性死亡过程，但已有足够的证据表明氧化应激引起的细胞凋亡增多与多巴胺能神经细胞退行性病变是密切相关的。
过氧化氢(H2O2)诱导的SH-SY5Y细胞帕金森病模型：H2O2对多巴胺神经细胞有损害，在黑质铁离子催化下产生有毒的羟基，受损细胞会使多巴胺能神经元置于氧化应激状态，二十多年来广泛诱导实验性PD实验模型的有效药物，极大的促进了PD的研究进展。
发明内容：
本发明提供了四种仅从卫矛科雷公藤属植物雷公藤(Tripterygium wilfordii)中分离得到的二氢沉香呋喃类新倍半萜的结构如下：
Figure GDA0002867074180000021
本发明的制备技术方案包括如下步骤：
(1)取干燥的雷公藤叶以75％工业乙醇回流提取，合并提取液浓缩得浸膏，浸膏采用乙酸乙酯萃取并将所得组分经硅胶柱色谱，以二氯甲烷-甲醇系统100:0-0:100进行梯度洗脱，共收集到3个馏分A、B、C。
(2)馏分B经聚酰胺柱色谱，以甲醇-水系统100:0-0:100进行梯度洗脱，得两个组分B1、B2、B3。利用凝胶柱色谱将B2组分以纯甲醇进行洗脱，得三个组分(1-3)。
(3)所得组分2经硅胶柱色谱以石油醚-乙酸乙酯系统50:1-2:1进行梯度洗脱，得到4个组分2.1-2.4。
(4)利用ODS柱色谱对组分2.2以醇-水系统30:70-90:10进行梯度洗脱，得到了5个组分2.2.1-2.2.5。
(5)所得组分4经硅胶柱色谱以石油醚-乙酸乙酯系统50:1-2:1进行梯度洗脱，得到4个组分2.2.4.1-2.2.4.4。
(6)利用半制备HPLC对2.2.4.2和2.2.4.3以乙腈-水系统进行洗脱，得到了化合物1-4。
步骤(1)中，所述提取为回流提取，提取3次，每次2～3小时。
步骤(1)中，使用雷公藤为卫矛科雷公藤属植物雷公藤(Tripterygiumwilfordii)。
所得化合物经过系统结构鉴定结果如下：
利用高分辨质谱，一维NMR、二维NMR及计算ECD技术对化合物1-4的结构鉴定。triptersinoid A(1):白色柱状结晶(MeOH)。HR-ESI-MS给出其准分子离子峰为565.1920[M+Na]+(cal.565.1930)，结合氢谱，碳谱确定分子式为C25H34O13。
1H-NMR(400MHz,CDCl3)中，在低场区有4个连氧次甲基信号δH 5.87(1H,d,J＝3.3Hz,H-1)，5.33(1H,m,H-2)，4.80(1H,br s,H-3)，5.18(1H,m,H-6)，5.56(1H,s,H-9)；2个连氧的亚甲基信号δH 4.91,4.34(each 1H,d,J＝12.8Hz,H-15)；1个环上次甲基信号δH2.96(1H,s,H-7)；高场区出现8个甲基信号，其中5个为乙酰氧甲基信号，分别δH 1.94(OAc-1),2.12(OAc-2),2.08(OAc-3),2.05(OAc-9),1.93(OAc-15)；另外为连在季碳上的甲基，分别为δH 1.51(1H,s,H-13),1.37(1H,d,J＝3.2Hz,H-15),1.42(1H,s,H-14)。
13C-NMR(100MHz,CDCl3)中，在低场区出现δC 200.0(C-8)，提示该化合物可能含有一个酮羰基信号；并且还出现了δC 169.5(OAc-1),169.1(OAc-2),170.3(OAc-3),169.5(OAc-9),169.9(OAc-15)，进一步证明了5个乙酰氧羰基信号；此外，还出现8个连氧碳信号δC 92.0(C-5),83.6(C-11),79.2(C-9),75.1(C-6),73.8(C-3),72.9(C-1),70.2(C-2),60.2(C-15)；2个次甲基信号δC 66.6(C-7)，37.4(C-4)；1个季碳信号δC 51.3(C-10)；还有8个甲基信号30.8(C-12),25.3(C-13),16.1(C-14),20.7(OAc-1),21.3(OAc-2),21.1(OAc-3),20.3(OAc-9),20.7(OAc-15)。由上述的NMR数据可以推测出化合物1可能为含有5个乙酰氧基的二氢沉香呋喃型倍半萜。
根据HSQC谱对该化合物进行碳氢直接相关归属，HMBC谱中对碳氢相关进行归属，其中δH 5.87(H-1),5.56(H-9)与δC 51.3(C-10)/60.2(C-15)；δH 5.33(H-2)与δC 51.3(C-10)；δH 4.80(H-3)与δC 72.9(C-1)/92.0(C-5)/16.1(C-14)；δH 1.51(H-12)与δC 60.6(C-7)/83.6(C-11)/25.3(C-13)；δH 1.42(H-14)与δC 73.8(C-3)/37.4(C-4)/92.0(C-5)；δH4.91,4.34(H-15)与δC 92.0(C-5)/72.9(C-1)/51.3(C-10)相关，进一步的确定了该化合物含有二氢沉香呋喃型倍半萜的骨架。此外，通过δH 5.39(H-1),5.39(H-2),5.39(H-3),5.39(H-9),5.39(H-15)分别与δC 169.5,169.1,170.3,169.5,169.9相关，进而证明了乙酰基分别取代为C-1，C-2，C-3，C-9，C-15位。该化合物的相对构型是根据NOESY谱以及耦合常数来确定的。通过分析J1,2耦合常数为3.3Hz，说明H-2与H-1处于同一平面；在NOESY谱中，H-1与H-9,H-14与H-3/H-6/H-15有相关，进一步说明H-9处于面上H-3与H-6处于面下。基于以上相关信息，可以确定该化合物的相对构型。
综上所述，最终确定了该化合物结构，并命名为triptersinoid A。
化合物1的1H(400MHz)与13C(100MHz)NMR数据(CDCl3)
Figure GDA0002867074180000031
Figure GDA0002867074180000041
triptersinoid B(2):白色柱状结晶(MeOH)。HR-ESI-MS给出其准分子离子峰为564.2003[M+Na]+(cal.564.2013)，结合氢谱，碳谱确定分子式为C27H33NO13。
1H-NMR(600MHz,CDCl3)中，在低场区出现δH 9.33(1H,br s,H-6′),8.84(1H,br s,H-2′),8.41(1H,br d,J＝8.0Hz,H-4′),7.47(1H,m,H-5′)，提示该化合物含有一个烟酰氧基团；有4个连氧次甲基信号δH 5.94(1H,d,J＝2.9Hz,H-1)，4.26(1H,m,H-2)，5.29(1H,m,H-3)，5.26(1H,m,H-6),5.65(1H,s,H-9)；2个连氧的亚甲基信号δH 5.06,4.3(each 1H,d,J＝12.8Hz,H-15)；高场区出现6个甲基信号，其中3个为乙酰氧甲基信号，分别δH 2.04(OAc-1),2.10(OAc-9),1.94(OAc-15)；另外为连在季碳上的甲基，分别为δH 1.40(1H,s,H-13),1.41(1H,d,J＝3.2Hz,H-15),1.57(1H,s,H-14)。
13C-NMR(125MHz,CDCl3)中进一步证实了上述的基团；此外，还出现8个连氧碳信号δC92.8(C-5),83.7(C-11),79.6(C-9),76.2(C-3),75.3(C-6),75.3(C-1),70.8(C-2),60.8(C-15)；2个次甲基信号δC 66.6(C-7)，37.9(C-4)；1个季碳信号δC 51.7(C-10)；还有6个甲基信号30.8(C-12),25.5(C-13),16.2(C-14),20.8(OAc-1),21.4(OAc-2),21.0(OAc-1),20.3(OAc-9),20.7(OAc-15)。由上述的NMR数据可以推测出化合物2可能为含有1个烟酰基团，3个乙酰氧基的二氢沉香呋喃型倍半萜。
根据HSQC谱对该化合物进行碳氢直接相关归属，HMBC谱中对碳氢相关进行归属，其中δH 5.94(H-1),5.65(H-9)与δC 51.7(C-10)/60.8(C-15)；δH 5.29(H-3)与δC 75.3(C-1)/92.8(C-5)/16.2(C-14)；δH 1.40(H-12)与δC 66.6(C-7)/83.7(C-11)/25.5(C-13)；δH1.57(H-14)与δC76.2(C-3)/37.9(C-4)/92.8(C-5)；δH 5.06,4.53(H-15)与δC 92.8(C-5)/75.3(C-1)/51.7(C-10)相关，进一步的确定了该化合物含有二氢沉香呋喃型倍半萜的骨架。此外，通过δH 5.94(H-1),5.29(H-3),5.65(H-9),5.06(H-15)分别与δC 169.7,164.1,169.5,170.1相关，进而证明了乙酰基分别取代为C-1,C-9,C-15位并且烟酰基团取代在C-3号位。
该化合物的相对构型是根据NOESY谱以及耦合常数来确定的。通过分析J1,2耦合常数为2.9Hz，说明H-2与H-1处于同一平面；在NOESY谱中，H-1与H-9,H-14与H-3/H-6/H-15有相关，进一步说明H-9处于面上H-3与H-6处于面下。基于以上相关信息，可以确定该化合物的相对构型。
综上所述，最终确定了该化合物结构，并命名为triptersinoid B。
化合物2的1H(400MHz)与13C(100MHz)NMR数据(CDCl3)
Figure GDA0002867074180000051
triptersinoid C(3):白色柱状结晶(MeOH)。HR-ESI-MS给出其准分子离子峰为570.2054[M+Na]+(cal.570.2044)，结合氢谱，碳谱确定分子式为C27H33NO11。
1H-NMR(600MHz,CDCl3)中，在低场区出现δH 9.29(1H,br s,H-6′),8.91(1H,br s,H-2′),8.66(1H,br d,J＝8.0Hz,H-4′),7.81(1H,m,H-5′)，提示该化合物含有一个烟酰氧基团；有3个连氧次甲基信号δH 5.67(1H,d,J＝3.3Hz,H-1)，5.71(1H,d,J＝6.2,3.2Hz,H-2),5.65(1H,s,H-9)；2个连氧的亚甲基信号δH 4.90,4.55(each 1H,d,J＝12.8Hz,H-15)；高场区出现6个甲基信号，其中3个为乙酰氧甲基信号，分别δH 2.00(OAc-1),2.08(OAc-9),1.95(OAc-15)；另外为连在季碳上的甲基，分别为δH 1.42(1H,s,H-13),1.50(1H,s,H-15),1.55(1H,s,H-14)。
13C-NMR(125MHz,CDCl3)中进一步证实了上述的基团；此外，还出现7个连氧碳信号δC91.1(C-5),83.6(C-11),79.0(C-9),74.2(C-1),71.2(C-2),69.3(C-4),61.4(C-15),；2个亚甲基信号δC 40.9(C-3)，31.9(C-6)；1个次甲基信号59.2(C-7)；1个季碳信号δC 51.7(C-10)；还有6个甲基信号30.8(C-12),25.5(C-13),16.2(C-14),20.8(OAc-1),20.3(OAc-9),20.7(OAc-15)。由上述的NMR数据可以推测出化合物3可能为含有1个烟酰基团，3个乙酰氧基的二氢沉香呋喃型倍半萜。
根据HSQC谱对该化合物进行碳氢直接相关归属，HMBC谱中对碳氢相关进行归属，其中δH 5.67(H-1),5.65(H-9)与δC 54.5(C-10)/61.4(C-15)；δH 1.42(H-12)与δC 59.2(C-7)/83.6(C-11)/23.2(C-13)；δH 1.55(H-14)与δC 40.9(C-3)/69.3(C-4)/91.0(C-5)；δH4.90,4.55(H-15)与δC 91.0(C-5)/74.2(C-1)/54.5(C-10)相关，进一步的确定了该化合物含有二氢沉香呋喃型倍半萜的骨架。此外，通过δH 5.67(H-1),5.71(H-2),5.65(H-9),4.90(H-15)分别与δC 169.5,164.1,169.5,170.1相关，进而证明了乙酰基分别取代为C-1,C-9,C-15位并且烟酰基团取代在C-2号位。
该化合物的相对构型是根据NOESY谱以及耦合常数来确定的。通过分析J1,2耦合常数为3.3Hz，说明H-2与H-1处于同一平面；在NOESY谱中，H-1与H-9，H-14与H-3/H-6/H-15有相关，进一步说明H-9处于面上。基于以上相关信息，可以确定该化合物的相对构型。
综上所述，最终确定了该化合物结构，并命名为triptersinoid C。
化合物3的1H(400MHz)与13C(100MHz)NMR数据(CDCl3)
Figure GDA0002867074180000061
triptersinoid D(4):白色柱状结晶(MeOH)。HR-ESI-MS给出其准分子离子峰为570.2054[M+Na]+(cal.570.2044)，结合氢谱，碳谱确定分子式为C28H34O10。
1H-NMR(600MHz,CDCl3)中，在低场区出现δH 8.00(2H,d,J＝7.4Hz,H-2′,H-6′),7.55(1H,t,J＝7.4Hz,H-4′),7.42(2H,t,J＝7.4Hz,H-3′,H-5′)，提示该化合物含有一个苯甲酰氧基团；有3个连氧次甲基信号δH 5.63(1H,d,J＝3.2Hz,H-1),5.34(1H,d,J＝6.4Hz,3.2Hz,H-2),5.82(1H,s,H-9)；2个连氧的亚甲基信号δH 5.09,4.51(each 1H,d,J＝12.8Hz,H-15)；高场区出现6个甲基信号，其中3个为乙酰氧甲基信号，分别δH 1.50(OAc-1),2.10(OAc-2),1.95(OAc-15)；另外为连在季碳上的甲基，分别为δH 1.31(1H,s,H-13),1.50(1H,s,H-15),1.35(1H,d,J＝8.0Hz,H-14)。
13C-NMR(125MHz,CDCl3)中进一步证实了上述的基团；此外，还出现6个连氧碳信号δC88.4(C-5),82.3(C-11),80.4(C-9),75.2(C-1),69.4(C-2),61.3(C-15)；2个亚甲基信号δC 31.2(C-3),37.0(C-6)；2个次甲基信号39.1(C-4),59.9(C-7)；1个季碳信号δC 54.2(C-10)；还有6个甲基信号29.2(C-12),23.5(C-13),19.0(C-14),20.5(OAc-1),21.5(OAc-2),20.9(OAc-15)。由上述的NMR数据可以推测出化合物4可能为含有1个苯甲酰基团，3个乙酰氧基的二氢沉香呋喃型倍半萜。
根据HSQC谱对该化合物进行碳氢直接相关归属，HMBC谱中对碳氢相关进行归属，其中δH 5.63(H-1),5.82(H-9)与δC 54.2(C-10)/61.3(C-15)；δH 1.50(H-12)与δC 59.9(C-7)/82.3(C-11)/23.5(C-13)；δH 1.35(H-14)与δC 31.2(C-3)/39.0(C-4)/88.4(C-5)；δH5.01,4.51(H-15)与δC 88.4(C-5)/75.2(C-1)/54.2(C-10)相关，进一步的确定了该化合物含有二氢沉香呋喃型倍半萜的骨架。此外，通过δH 5.63(H-1),5.34(H-2),5.82(H-9),5.09(H-15)分别与δC 169.8,169.9,165.3,170.6相关，进而证明了乙酰基分别取代为C-1,C-2,C-15位并且苯甲酰基团取代在C-9号位。
该化合物的相对构型是根据NOESY谱以及耦合常数来确定的。通过分析J1,2耦合常数为3.2Hz，说明H-2与H-1处于同一平面；在NOESY谱中，H-1与H-9，H-14与H-3/H-6/H-15有相关，进一步说明H-9处于面上。基于以上相关信息，可以确定该化合物的相对构型
综上所述，最终确定了该化合物结构，并命名为triptersinoid D。
化合物4的1H(400MHz)与13C(100MHz)NMR数据(CDCl3)
Figure GDA0002867074180000071
Figure GDA0002867074180000081
对发明所述四个新化合物的H2O2诱导的人SH-SY5Y神经细胞损伤的神经保护活性进行了考察，化合物1显示出了明显的体外神经细胞保护活性，在给药浓度为50μM的条件下，与H2O2诱导的模型组相比，化合物1使细胞生存率上升了19％。因此本发明所述的二氢沉香呋喃倍半萜类化合物具有进一步开发预防和治疗帕金森药物的前景。
本发明的优点在于，所述化合物均为立体构型确定的光学纯化合物，同时其抗PD活性强，具有进一步开发的价值。
附图说明：
图1化合物1的HMBC谱(600MHz,CDCl3)；
图2化合物1的HSQC谱(600MHz,CDCl3)；
图3化合物1的NOESY谱(600MHz,CDCl3)；
图4化合物2的HMBC谱(600MHz,CDCl3)；
图5化合物2的HSQC谱(600MHz,CDCl3)；
图6化合物2的NOESY谱(600MHz,CDCl3)；
图7化合物3的HMBC谱(600MHz,CDCl3)；
图8化合物3的HSQC谱(600MHz,CDCl3)；
图9化合物3的NOESY谱(600MHz,CDCl3)；
图10化合物4的HMBC谱(600MHz,CDCl3)；
图11化合物4的HSQC谱(600MHz,CDCl3)；
图12化合物4的NOESY谱(600MHz,CDCl3)。
具体实施方式：
下面所列实施例有助于本领域技术人员更好地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。
实施例1：化合物1-4的制备。
取干燥的雷公藤(T.wilfordii)叶30kg，以75％乙醇回流提取3次，每次2小时。得乙醇粗提物2500g，浸膏采用乙酸乙酯及正丁醇萃取并将乙酸乙酯萃取所得组分(800g)经硅胶柱色谱，以二氯甲烷-甲醇系统100:0-0:100进行梯度洗脱，共收集到4个馏分A、B、C。馏分B经聚酰胺柱色谱，以甲醇-水系统100:0-0:100进行梯度洗脱，得两个组分B1、B2、B3。利用凝胶柱色谱将B2组分以纯甲醇进行洗脱，得三个组分。所得组分2(200g)经硅胶柱色谱以石油醚-乙酸乙酯系统50:1-2:1进行梯度洗脱，得到4个组分2.1-2.4。利用ODS柱色谱对组分2.2(40g)以醇-水系统30:70-90:10进行梯度洗脱，得到了5个组分2.2.1-2.2.5。所得组分2.2.4(8g)经硅胶柱色谱以石油醚-乙酸乙酯系统50:1-2:1进行梯度洗脱，得到4个组分2.2.4.1-2.2.4.4。利用制备HPLC对2.2.4.2和2.2.4.3以乙腈-水系统进行洗脱，得到了化合物1-4。
实施例2：化合物1-4在体外对H2O2诱导的人SH-SY5Y神经细胞损伤保护作用的活性考察。
利用MTT实验，考察化合物对H2O2诱导的SH-SY5Y神经细胞损伤保护作用的活性。将细胞放置在96孔板中，以100μL培养液静置12h，并使用不同浓度的化合物1-4(25,50,100μM)预处理SH-SY5Y神经细胞1h，后加入终浓度为200μM的H2O2作用4h。随后将培养液替换为含有0.5mg/mL MTT的磷酸盐缓冲溶液并在37℃下放置4h。除去上清液并加入DMSO(150mL/孔)，以H2O2(200μM)单独处理的细胞为对照组，检测不同浓度处理的细胞在490nm利用紫外分光光度计进行检测(Thermo Scientific Multiskan MK3,上海,中国)。细胞的存活程度以存活百分比表示，并利用GraphPad Prism 6软件进行分析，结果如下表所示。
Figure GDA0002867074180000091
数据用平均数±标准差表示,n＝3.和H2O2模型进行对比，***p<0.001,**p<0.01,*p<0.05.以Trolox为阳性对照。
结果表明，四个化合物均显示出了体外神经细胞保护活性，尤其化合物1显示出了明显的体外神经细胞保护活性，在给药浓度为50μM的条件下，与H2O2诱导的模型组相比，化合物1使细胞生存率上升了19％。

Claims (7)

1.如下结构所示的二氢沉香呋喃倍半萜类化合物：
Figure 295263DEST_PATH_IMAGE001
。
2.根据权利要求1所述的二氢沉香呋喃倍半萜类化合物的制备方法，其特征在于，
(1)取干燥的雷公藤叶以75%工业乙醇回流提取，合并提取液浓缩得浸膏，浸膏采用乙酸乙酯萃取并将所得组分经硅胶柱色谱，以二氯甲烷-甲醇系统100:0-0:100进行梯度洗脱，共收集到3个馏分A、B、C；
(2)馏分B经聚酰胺柱色谱，以甲醇-水系统100:0-0:100 进行梯度洗脱，得两个组分B1、B2、B3；利用凝胶柱色谱将B2组分以纯甲醇进行洗脱，得三个组分1-3；
(3)所得组分2经硅胶柱色谱以石油醚-乙酸乙酯系统50:1-2:1进行梯度洗脱，得到4个组分2.1-2.4；
(4)利用ODS柱色谱对组分2.2以醇-水系统30:70-90:10进行梯度洗脱，得到5个组分2.2.1-2.2.5；
(5)所得组分4经硅胶柱色谱以石油醚-乙酸乙酯系统50:1-2:1进行梯度洗脱，得到4个组分2.2.4.1-2.2.4.4；
(6)利用半制备HPLC对2.2.4.2和2.2.4.3以乙腈-水系统进行洗脱，得到了化合物1-4。
3.根据权利要求2所述的二氢沉香呋喃倍半萜类化合物的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述提取为回流提取，提取3次，每次2～3小时。
4.根据权利要求2所述的二氢沉香呋喃倍半萜类化合物的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，雷公藤为卫矛科雷公藤属植物雷公藤。
5.一种药物组合物，包含权利要求1所述的二氢沉香呋喃倍半萜类化合物和药学上可接受的载体。
6.权利要求1所述的二氢沉香呋喃倍半萜类化合物或权利要求5所述的组合物在制备H2O2诱导的对人SH-SY5Y细胞氧化损伤的神经保护药物中的应用。
7.权利要求1所述的二氢沉香呋喃倍半萜类化合物或权利要求5所述的组合物在在制备抗帕金森药物中的应用。
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