JP2015147798A - 弾性繊維の形成を刺激するための、loxl(リシルオキシダーゼ類似)アイソフォームの合成及び活性の刺激 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】本発明の目的は主として、弾性繊維の形成を刺激できる組成物を提供するためのスクリーニング方法を提供することである。本発明は、リシルオキシダーゼのアイソフォームの、特にLOXL(リシルオキシダーゼ類似)アイソフォームの合成及び活性の刺激に関する。
【選択図】なし
Description
−潜在的活性成分を、アイソフォームLOXL、又は、その相同体若しくは本質的な相同体を発現できる細胞のうち少なくとも1種と接触させること、
−(a)特に上記潜在的活性成分がLOXL、又は、その相同体若しくは本質的な相同体の活性を刺激するかどうかを明らかにする目的で、LOXL、又は、その相同体若しくは本質的な相同体の活性を調べること、又は
−(b)特に上記潜在的活性成分がLOXL、又は、その相同体若しくは本質的な相同体の発現を刺激するかどうかを明らかにする目的で、LOXL、又は、その相同体若しくは本質的な相同体の発現を調べること
を含むことを特徴とするスクリーニング方法に関する。
有利には、上記潜在的活性成分が、
−タンパク質LOXL、又は、その相同体若しくは本質的な相同体をコードするヌクレオチド配列の少なくとも1種の発現、及び/又は、
−タンパク質LOXL、又は、その相同体若しくは本質的な相同体のペプチド断片を本質上構成するペプチド配列の発現
を刺激するかどうかを調べる。
−特にLOXLをコードするヌクレオチド配列の少なくとも一部を、例えばLOXLをコードする相補的DNAのヌクレオチド配列(配列番号2)の少なくとも一部とハイブリダイズするDNAプローブを少なくとも1種用いて、in situハイブリダイゼーションすることによって、又は、
−特にLOXLの特異的抗体を少なくとも1種用いた免疫検出によって
LOXLの発現の位置を確認する段階も含む。
は、再生真皮又は再生絨毛膜を形成するために、間質細胞を播種した担体を含む。この担体は好ましくは、
−合成半透膜、具体的にはニトロセルロース半透膜、ナイロン半透膜、テフロンTM膜若しくはテフロンTMスポンジ、ポリカーボネート若しくはポリエチレン、ポリプロピレン若しくはポリエチレンテレフタレート(PET)の半透膜、AnoporeTM無機半透膜、酢酸セルロース若しくはセルロースエステル(HATF)の膜、Biopore−CMTM半透膜、ポリエステル半透膜又はポリグリコール酸の膜若しくは薄膜からなる群より選択される不活性な担体(上記群において、例えば、真皮モデルであるSkin2TMmodel ZK1100、Dermagraft(R)及びTranscyte(R)(Advanced Tissue Sciences社)が挙げられる)
−細胞培養処理した樹脂(葉状真皮(a dermal leaf)の構造:Michel M.ら、In Vitro Cell.Dev Biol.−Animal(1999)35:318−326)
−ヒアルロン酸(Hyalograft(R) 3D−Fidia Advanced Biopolymers社)及び/又はコラーゲン及び/又はフィブロネクチン及び/又は繊維素を基盤とするゲル又は膜(上記群において、例えば、真皮モデルであるVitrix(R)(オルガノジェネシス社)が挙げられる)
−1種以上のグリコサミノグリカン類及び/又は最終的にはキトサン(CNRSのEP0296078 A1、Coletica社のWO01/911821及びWO01/92322)を含むことが可能であるコラーゲンから作られる、浮上している又は浮上していない多孔性マトリックス
から選択される。
は、再生上皮又は再生表皮を得るために、まず間質細胞、特に繊維芽細胞を、次に上皮細胞、特に角質細胞を播種した、又は、播種していない担体を含む。この担体は好ましくは、
−合成半透膜、具体的にはニトロセルロース半透膜、ナイロン半透膜、テフロンTM膜若しくはテフロンTMスポンジ、ポリカーボネート若しくはポリエチレン、ポリプロピレン若しくはポリエチレンテレフタレート(PET)の半透膜、Anopore無機半透膜、酢酸セルロース若しくはセルロースエステル(HATF)の膜、Biopore−CM半透膜又はポリエステル半透膜からなる群より選択される不活性な担体(上記群において、再生表皮及び上皮のモデル(Skinethic(R))、並びに、EpiDerm(R)、EpiAirway(R)、EpiOccular(R)(Mattek Corporation社)といったモデルが挙げられる)
−ヒアルロン酸及び/又はコラーゲン及び/又はフィブロネクチン及び/又は繊維素を基盤とする薄膜又は膜(上記群において、特に、Episkin(R)(ロレアル社)及びLaserskin(R)(Fidia advanced Biopolymers社)といったモデルが挙げられる)
から選択される。
は、再生粘膜を得るために上皮細胞を、又は、再生皮膚を得るために角質細胞を播種した(真皮の又は絨毛膜の)マトリックス担体を含む。この担体は好ましくは、
−合成半透膜、具体的にはニトロセルロース半透膜、ナイロン半透膜、テフロンTM膜若しくはテフロンTMスポンジ、ポリカーボネート若しくはポリエチレン、ポリプロピレン若しくはポリエチレンテレフタレート(PET)の半透膜、Anopore無機半透膜、酢酸セルロース若しくはセルロースエステル(HATF)の膜、Biopore−CM半透膜又はポリエステル半透膜からなる群より選択される不活性な担体(上記不活性な担体は間質細胞、特に繊維芽細胞を含む)
−間質細胞、特に繊維芽細胞を含む、コラーゲン及び/又はヒアルロン酸及び/又はフィブロネクチン及び/又は繊維素を基盤とするゲル
−1種以上のグリコサミノグリカン類及び/又は最終的にはキトサンを含むことが可能であるコラーゲンから作られる、浮上している又は浮上していない多孔性マトリックス(上記多孔性マトリックスは間質細胞、特に繊維芽細胞を統合したものである)
−人間又は動物の、上皮を剥がした真皮又は死んだ真皮
から選択される。
本発明はまずLOX及びLOXLの特異的抗体を新規に作ったが、この抗体を用いることによってこれらの成熟形を検出できる。この抗体は、LOX及びLOXLの成熟領域に対して作った。抗原領域は、他のリシルオキシダーゼ(LO)アイソフォーム上の対応する領域との類似性が最低限になるように選択した。ペプチドLOXV228−S280の領域に対して得られた抗体を抗LOXmat抗体、同様にペプチドLOXLR231−G368の領域に対して得られた抗体を抗LOXLpro抗体と称した。
図1(A):hLOX(ヒトLOXタンパク質)及びhLOXL(ヒトLOXLタンパク質)の概略図。
図1(B)の表中で、hLOXLはヒトLOXLタンパク質、bLOXLはウシLOXLタンパク質、mLOXLはマウスLOXLタンパク質、hLOXLはヒトLOXタンパク質、bLOXはウシLOXタンパク質、hLOXL2はヒトLOXL2タンパク質、hLOXL3はヒトLOXL3タンパク質、hLOXL4はヒトLOXL4タンパク質を表わす。
長さ(aa)の欄には、対応する領域に含まれるアミノ酸の数を記載する。
「新規抗体、抗LOX抗体及び抗LOXL抗体による、筋細胞のLOX及びLOXLの免疫検出」
図2:図2は、下記に示す方法で行った電気泳動の写真である。この電気泳動は、実施例1で明らかにした抗LOX抗体及び抗LOXL抗体を用いることによって、平滑筋細胞(SMC)のLOX及びLOXLの成熟タンパク質の特性を明らかにしている。
「弾性繊維の形成におけるLOX及びLOXLの作用の実証」
本発明者らは、LOX及びLOXLタンパク質が再生皮膚モデルにおける真皮中の結合組織の形成に関与している可能性があることを、免疫組織化学的手法によって明らかにした(図3)。このことは、2種の酵素(LOX及びLOXL)の酵素前駆体領域及び成熟領域に対する抗LOX抗体及び抗LOXL抗体を用いることによって明瞭となった。
「弾性繊維の形成におけるLOXL2、LOXL3及びLOXL4の作用の実証」
本発明はまた、新規の抗LOXL2抗体2種も作ったが、これらのうち1種は、理論上はLOXL3及びLOXL4も認識する。これを用いることによって、これらの酵素が、再生皮膚モデルにおける真皮中でエラスチンと共に発現するかどうかを明らかにすることができた。上記2種の抗LOXL2抗体を用いて免疫組織化学的に調べたところ、これらの抗原、並びに、抗原性の関連する2種のタンパク質LOXL3及びLOXL4が真皮中に全くあるいはほとんど発現せず、従って弾性繊維の形成に関与していないことが実際に分かった。
「弾性繊維の形成におけるLOXLの作用の実証」
LOXL及びLOXと、弾性繊維又はミクロフィブリルとの結合が、透過型電子顕微鏡を用いて本発明により明らかに示された。
「E」:45日後、すなわち角質細胞を添加して30日後の再生皮膚の真皮中における、抗エラスチン抗体及び抗コラーゲンI抗体を用いたポジティブコントロール。
「F及びI」:LOXL、LOX、エラスチン及びコラーゲンの、人間の包皮の真皮部分における電子顕微鏡を用いた二重免疫検出。
「G及びH」:抗LOXLウサギ抗体(抗IgGウサギ抗体は10nmの金粒子で標識)、及び、抗エラスチンマウス抗体(抗IgGマウス抗体は20nmの金粒子で標識)を用いた、人間の包皮の真皮部分における二重標識。
図中の記号:m;ミクロフィブリル、c;膠原繊維、e;無定形のエラスチン。
縮尺の棒:500nm。
「LOXLの発現と弾性繊維形成との関係の実証」
LOXL及びLOXは、まだ高いエラスチン合成力を持つ幼い患者(数か月児)から採取した包皮皮膚の真皮中に発現している。LOXLは成人の首、胸、腹又は顔の皮膚の真皮中には発現していないのに対して、LOXはいずれの年齢においても真皮中に発現している(図6)。
抗LOX抗体(A、C、E、G)及び抗LOXL抗体(B、D、F、H)を用いて、エドアール・エリオ病院(リヨン、フランス)の組織バンク提供の包皮(A、B)、首(C、D)、胸(E、F)及び腹(G、H)の皮膚の試料中におけるLOX及びLOXLの発現を検出した。これらの組織はブアン試薬で固定し、パラフィンで包埋して、上述した免疫検出と同様にして免疫検出を行った。
抗LOX抗体(A、C、E、G)及び抗LOXL抗体(B、D、F、H)を用いて、エドアール・エリオ病院の組織バンク提供の1.5歳(A、B)、35歳(C、D)、60歳(E、F)及び91歳(G、H)の人から採取した腹の皮膚の試料中におけるLOX及びLOXLの発現を検出した。これらの組織はブアン試薬で固定し、パラフィンで包埋して、上述した免疫検出と同様にして免疫検出を行った。
抗LOX抗体(A、D、G)、抗エラスチン抗体(B、E、H)及び抗LOXL抗体(C、F、I)を用いて、17歳患者の首皮膚の瘢痕周辺(「正常な」部分、A〜C)、治療から3か月経過後(D〜F)及び5年経過後(G、H)の試料におけるLOX、エラスチン及びLOXLの発現を検出した。これらの組織はブアン試薬で固定し、パラフィンで包埋して、上述した免疫検出と同様にして免疫検出を行った。エラスチンの標識には、0.2%ヒアルロニダーゼ(シグマ社)を用いて遮蔽除去(demasking)することが必要である。
「LOXL遺伝子の転写前制御に関する研究」
さらに本発明は、ヒトLOXL遺伝子(hLOXL)がプロモーターレベルで活性化される可能性があることを明らかにした(図9)。配列番号3は、このプロモーターの配列の−2730から−1のヌクレオチドを記載している。hLOXLプロモーターの活性化領域がいくつか明らかになった。特に、ヌクレオチド−712/−391(LOXL遺伝子の翻訳を+1から始めるとした場合の番号)の領域は、人間の包皮皮膚の繊維芽細胞において移行型トランスフェクションを行った後に発現するレポーター遺伝子ルシフェラーゼに対しての上方制御活性を有する領域である。
ヒトLOXL遺伝子のプロモーター(PrhLOXL)を、データベースの配列により特定した。転写開始位置は知られていなかったので、本発明者らは翻訳される+1からその番号をつけた。しかしながら、この領域に相当するEST(発現配列タグ)cDNAを検索したが−342から上流の配列が得られなかったことから、hLOXL遺伝子の転写がこの領域(TATAボックスを含まない)から開始されると仮定できる。特異的プライマーは、この配列上の−2172〜+189の位置に示されている(エクソン1)。このプライマーを用いることにより、皮膚繊維芽細胞由来のヒトゲノムDNAからPrhLOXLを増幅及び単離できた。これをクローニングして配列を決定したところ、その配列が予想したものと一致することが分かった。その後、−2172〜−1に位置する(完全長であることが分かっている)プロモーターをpGL3−basic vector(プロメガ社、シャルボニエール、フランス)にサブクローニングし、真核細胞における研究に用いることができた。このプロモーターはレポーター遺伝子であるルシフェラーゼ遺伝子の上流に組み込んだ。これにより、トランスフェクションさせた細胞によるルシフェラーゼの生産はPrhLOXLに制御され、その活性に比例する。細胞には、結果の標準とするために、強度に再現性よくβ−ガラクトシダーゼ(β−Gal)を発現するプロモーターを同時にトランスフェクションした。同様の条件でルシフェラーゼ及びβ―Gal酵素活性を測定した。
「再生皮膚モデルにおける角質細胞の導入によるLOXLの活性化の実証」
LOXLをコードする遺伝子の発現を、LOXLをコードするメッセンジャーRNAとジゴキシゲニン標識二本鎖DNAプローブとのin situハイブリダイゼーションをパラフィンで包埋した断面において行うことによって検出した。
35日後の皮膚モデル断面(Mimeskin(R))を示す図11において、
(A)LOXLの発現は、真皮深層及び表皮全体に渉って陽性である。
(B)LOXの発現は、真皮全体及び表皮基底層上部において陽性である。
(C)トロポエラスチン(TE)の発現は、真皮の繊維芽細胞及び表皮において見られる。
(D)遺伝子COL1A1(コラーゲンα1(I))の発現は、真皮で検出され、表皮では検出されていない。
(E)プローブのないコントロール。
DEJを白抜きの矢印で、多孔性の真皮基質を矢印で、陽性細胞を矢印の先端で示す。
Iα1コラーゲンの遺伝子にはセンス5’−GTGGAGAGTACTGGATTG−3’(配列番号14)及びアンチセンス5’−TCGTGCAGCCATCGACAG−3’(配列番号15)を、トロポエラスチンにはセンス5’−GTATATACCCAGGTGGCGTG−3’(配列番号10)及びアンチセンス5’−CGAACTTTGCTGCTGCTTTAG−3’(配列番号11)を、hLOXにはセンス5’−GGTGGCCGACCCCTACTACATCC−3’(配列番号12)及びアンチセンス5’−GCAAATCGCCTCTGGTAGCCATAGTC−3’(配列番号13)を、hLOXLにはセンス5’−GACATAACCGACGTGCAGCC−3’(配列番号8)及びアンチセンス5’−ATCCACGTTCGCTCCCTGAG−3’(配列番号9)を用いた。
「成人の繊維芽細胞中におけるLOX遺伝子の発現量低下の実証」
本発明者らは、包皮由来の繊維芽細胞(FF)(幼児由来)5株、及び、腹部の形成外科手術の際に採取した成人の繊維芽細胞(AF)6株(このうち3人の平均年齢は20歳で、残りの3人の平均年齢は60歳である)を用いた。目的の上記3種の遺伝子及びアクチンの発現を、リアルタイムRT−PCR(定量逆転写ポリメラーゼ連鎖反応、図12)によって調べた。この方法によれば、(一定とされる)アクチンの発現と比較して遺伝子の発現を正確に定量できる。従って、この遺伝子の発現量の制御を定量できる。
「LOXL及び/又はエラスチンのメッセンジャーRNAの発現の(例えば、活性を試験する活性成分と接触させて、又は、接触させずに行う定性RT−PCRによる)分析」
活性成分を、1%(v/v)の濃度で、正常な人間の皮膚(幼児の包皮又は成人由来)の繊維芽細胞に対して試験した。培養は、例えば、24ウェル培養プレート中に単層で、既知組成無血清培地(Fibroblast Basal Medium)中で行った。細胞を、例えば1cm2当たり40,000個播種した。コンフルエントになった時点で、細胞を活性成分と有利には24時間接触させた。有利には、並行して、無処理コントロール1種(培地のみ)及びポジティブコントロール3種(1ng/mlのTGF−β、50pg/mlのIL−1α、及び、2%(v/v)のPhytokine(R)(Coletica社、リヨン、フランス))についても、例えば同一の培養プレート中で試験した。
−アンチセンスエラスチン遺伝子:2Ela 5’−CGA ACT TTG CTG CTG CTT TAG−3’(配列番号25);
−センスLOXL遺伝子:30L1 5’−GAC TTC GGC AAC CTC AAG C−3’(配列番号26);
−アンチセンスLOXL遺伝子:31L1 5’−TGT TGC AGA AAC GTA GCG AC−3’(配列番号27);
−センスLOX遺伝子:Ox64 5’−ACG TAC GTG CAG AAG ATG TCC−3’(配列番号28);
−アンチセンスLOX遺伝子:Ox65 5’−GGC TGG GTA AGA AAT CTG ATG−3’(配列番号29);
−センスアクチン遺伝子:アクチン U 5’−GTGGGGCGCCCCAGGCACCA−3(配列番号30);
−アンチセンスアクチン遺伝子:D 5’−CTCCTTAATGTCACGCACGATTTC−3’(配列番号31)
『「若い」細胞及び「成熟」細胞』
包皮の細胞は、エラスチンをコードするmRNAを成人における平均量と同じレベルの量発現しているが、LOXLをコードするmRNA及びLOXをコードするmRNAの発現量の場合には、包皮における発現量は非常に多いことが分かる。従って、老齢細胞におけるLOXLの発現の減少(その結果としてLOXの発現の減少)を逆に上昇させることができるため、このような活性を有する成分をスクリーニングした。
各試験におけるcDNA量をアクチンのcDNA量と比較し、続いてネガティブコントロール(活性成分を含まない)と比較した。予備実験から、エラスチン(Eln)mRNAを約1.3倍増加させ、LOXLのmRNAを約2倍増加させるものが重要であると考えられた。試験した900種以上の分子又は活性抽出物のうち、13種の活性成分が試験した濃度において、かつ、規定した条件下でこの基準を満たしていた。これらの活性成分は、下記表IIの通りである。
活性成分バンクの活性成分960種のうち13種が、試験条件下で、成熟年齢の成人(この場合のドナーは63歳)の腹部の繊維芽細胞において、LOXL、LOX及びエラスチンをコードする遺伝子のmRNAの合成量を著しく活性化できた。
「化粧品用又は皮膚医薬用活性成分の有効性に関する(例えばリアルタイムRT−PCRによる)研究」
スクリーニングの第一段階で選択した活性成分を、0.1%〜5%(v/v)の範囲で濃度を変えて、正常な人間(成人)の皮膚の繊維芽細胞に対して試験した。培養は、例えば、24ウェルプレート中に単層で、既知組成無血清培地(Fibroblast Basal Medium)中で行った。細胞を、例えば1cm2当たり40,000個播種した。活性成分を細胞と接触させた後(24時間後)に培地を除去し、細胞を、例えばリン酸バッファー(pH7.4)中で洗浄して−80℃において凍結乾燥して保存した。試験後、エラスチン、LOXL及びアクチンのmRNA量をmRNA解析、例えばリアルタイムRT−PCRによって評価した。この評価を行うために、これら遺伝子に特有の断片を増幅できるプライマー対として上記のものを用いた(実施例10)。
−濃度5ng/μlのRNA 10μl、
−様々に標識した所望の特異的プライマー、
−反応混合液(キアゲン社、2×「QuantiTect SYBR Green RT−PCR master mix」(MgCl25mM含有)25μl+「QuantiTect RTmix」0.5μl)、標識SYBR Green Iを伸長過程においてDNA2本鎖に挿入した。
逆転写:50℃で30分間、その後、95℃で15分間。
PCR反応:(94℃、15秒間;60℃、30秒間;72℃、30秒間)を50サイクル。
コンタミネーションがないことの確認、及び、増幅産物の純度の確認は、例えば、増幅PCR産物の融解曲線によって行った。ダブルピーク又は異常な融解温度を示す産物は除去した。
増幅されたDNAの中に組み込まれた蛍光の量を、PCRサイクルを行う間連続的に測定した。これにより、PCRサイクル数に対する蛍光量の曲線が得られ、増幅されたDNAの相対量を調べることができた。
Sgene≪x≫=107×(1/2)C(T)gene≪x≫
C(T)gene≪x≫は、gene≪x≫のサイクル閾値が0.01〜0.05となるために必要なサイクル数を表わす。
調べたい遺伝子についてのこの値を、以下の比率により≪アクチン≫シグナルと比較した。
R=Sgene≪x≫/Sアクチン
この比率を、処理した試料と未処理の試料とで比較した。≪x≫はLOXL遺伝子又はエラスチン遺伝子である。
選択した活性成分のうち2種についての結果を例として表IIIに示す。
選択した活性成分は、成熟年齢の成人(この場合のドナーは63歳)の腹部の繊維芽細胞において、LOXL、LOX及びエラスチンをコードする遺伝子のmRNAの合成量を活性化できた。この研究によって、選択した各活性成分の最適な使用濃度を決定することができた。
「水中油エマルション型の化粧品又は医薬品の処方における本発明の生成物の使用」
<処方12a>
A 水 qsp100
ブチレングリコール 2
グリセリン 3
ジヒドロキシセチルリン酸ナトリウム、 2
イソプロピルヒドロキシセチルエーテル
B ステアリン酸グリコールSE 14
トリイソノナオイン 5
(triisononaoine)
ヤシ油脂肪酸オクチル 6
C pH5.5に調節した 2
ブチレングリコール、
メチルパラベン、
エチルパラベン、プロピルパラベン
D 本発明の生成物 0.01〜10%
A 水 qsp100
ブチレングリコール 2
グリセリン 3
ポリアクリルアミド、 2.8
イソパラフィン、ラウレス−7
B ブチレングリコール、 2
メチルパラベン、
エチルパラベン、プロピルパラベン;
2
フェノキシエタノール、
メチルパラベン、
プロピルパラベン、
ブチルパラベン、
エチルパラベン 0.5
ブチレングリコール
D 本発明の生成物 0.01〜10%
A カルボマー 0.50
プロピレングリコール 3
グリセリン 5
水 qsp100
B ヤシ油脂肪酸オクチル 5
ビサボロール 0.30
ジメチコン 0.30
C 水酸化ナトリウム 1.60
D フェノキシエタノール、 0.50
メチルパラベン、
プロピルパラベン、ブチルパラベン、
エチルパラベン
E 香料 0.30
F 本発明の生成物 0.01〜10%
「油中水型の処方における本発明の生成物の使用」
A PEG30−ジポリヒドロキシステアリン酸 3
カプリン酸トリグリセリド 3
オクタン酸セテアリル 4
アジピン酸ジブチル 3
ブドウ種子油 1.5
ホホバ油 1.5
フェノキシエタノール、 0.5
メチルパラベン、プロピルパラベン、
ブチルパラベン、エチルパラベン
B グリセリン 3
ブチレングリコール 3
硫酸マグネシウム 0.5
EDTA 0.05
水 qsp100
C シクロメチコン 1
ジメチコン 1
D 香料 0.3
E 本発明の生成物 0.01〜10%
「シャンプー又はボディソープ状の処方における本発明の生成物の使用」
A キサンタンガム 0.8
水 qsp100
B ブチレングリコール、 0.5
メチルパラベン、
エチルパラベン、プロピルパラベン
フェノキシエタノール、 0.5
メチルパラベン、
プロピルパラベン、ブチルパラベン、
エチルパラベン
C クエン酸 0.8
D ラウレス硫酸ナトリウム 40.0
E 本発明の生成物 0.01〜10%
「口紅等の無水製品状の処方における本発明の生成物の使用」
A ミネラルワックス 17.0
イソステアリン酸イソステアリル 31.5
プロピレングリコールジペラルゴン 2.6
(propylene glycol dipelargonate)
イソステアリン酸プロピレングリコール 1.7
PEG−8ミツロウ 3.0
水添パーム核脂肪酸グリセリド、 3.4
水添パーム油脂肪酸グリセリド
ラノリン油 3.4
ゴマ油 1.7
乳酸セチル 1.7
鉱物油、ラノリンアルコール 3.0
B ヒマシ油 qsp100
二酸化チタン 3.9
CI 15850:1 0.616
CI 45410:1 0.256
CI 19140:1 0.048
CI 77491 2.048
C 本発明の生成物 0.01〜5%
「水性ゲル(アイライナー、痩身剤等)の処方における本発明の生成物の使用」
A 水 qsp100
カルボマー 0.5
ブチレングリコール 15
フェノキシエタノール、 0.5
メチルパラベン、
プロピルパラベン、ブチルパラベン、
エチルパラベン
B 本発明の生成物 0.01〜10%
「LOXLを含有する医薬品の処方の調製」
<処方17a>錠剤の調製
A 賦形剤 g単位、1錠あたり
乳糖 0.359
スクロース 0.240
B LOXL抽出物* 0.001〜0.1
(LOXL抽出物*は、例えば実施例2に記載したように抽出し、その後乾燥させることによって得られる。)
A 賦形剤
低密度ポリエチレン 5.5
流動パラフィン qsp100
B LOXL抽出物* 0.001〜0.1
(LOXL抽出物*は、例えば実施例2に記載したように抽出し、その後必要に応じて乾燥させることによって得られる。)
A 賦形剤
等張食塩水 5ml
B LOXL抽出物* 0.001〜0.1g
(LOXL抽出物*は、例えば実施例2に記載したように抽出し、その後乾燥させることによって得られる。)
A相とB相は別々にアンプルで包み、使用前に混合する。
「本発明の生成物を含む製剤の化粧品としての許容性の評価」
実施例10及び11で得られた化合物を10%の割合で0.5%キサンタンガムに混合したものの毒性を、ウサギにおける眼刺激試験、ラットに1回経口投与した際に異常毒性がないことの確認試験、及び、モルモットにおける感作性試験によって調べた。
上記製剤を、ウサギ3匹の皮膚に、≪皮膚に対する急性刺激/腐食性≫の研究に関するOECD推奨の方法に従って、希釈せずに0.5mlずつ投与した。
上記製剤を純粋な状態で、≪眼に対する急性刺激/腐食性≫の研究に関して1987年2月24日にOECD指令書405番によって公式に推奨されている方法に従い、0.1mlを1回でウサギ3匹の眼中に滴下した。
この試験の結果から、これらの製剤は、純粋な状態で又は希釈せずに使用した場合、91/326のEECの意味において、眼に対して刺激がないものとして考えられる。
上記製剤を、1987年2月24日のOECD指令書401番から着想して化粧品に適用したプロトコールに従って、雄ラット5匹及び雌ラット5匹に、5g/体重1kgの量を1回で経口投与した。
LD0及びLD50は、5000mg/kg以上であることが分かっている。従って、試験した製剤は、経口摂取が危険な製剤には分類されない。
上記製剤に対して、OECD406番の指令書に従ったプロトコールであるMagnusson−Kligmann極大試験を行った。
これらの製剤は、皮膚との接触において感作性がないものとして分類される。
配列番号1:ヒトタンパク質LOXLのペプチド配列である。
配列番号2:配列番号1に記載したヒトタンパク質LOXLをコードするcDNAのヌクレオチド配列である。
配列番号3:配列番号1に記載したタンパク質LOXLをコードするヒト遺伝子のプロモーターをコードするcDNAのヌクレオチド配列である。
配列番号4:ヒトタンパク質トロポエラスチンのペプチド配列である。
配列番号5:配列番号4に記載したヒトタンパク質トロポエラスチンをコードするcDNAのヌクレオチド配列である。
配列番号6:ヒトタンパク質LOXのペプチド配列である。
配列番号7:配列番号6に記載したヒトタンパク質LOXをコードするcDNAのヌクレオチド配列である。
配列番号8:配列番号1に記載したヒトタンパク質LOXLをコードするDNAのセンスプライマーである。
配列番号9:配列番号1に記載したヒトタンパク質LOXLをコードするDNAのアンチセンスプライマーである。
配列番号10:配列番号4に記載したヒトタンパク質トロポエラスチンをコードするDNAのセンスプライマーである。
配列番号11:配列番号4に記載したヒトタンパク質トロポエラスチンをコードするDNAのアンチセンスプライマーである。
配列番号12:配列番号6に記載したヒトタンパク質LOXをコードするDNAのセンスプライマーである。
配列番号13:配列番号6に記載したヒトタンパク質LOXをコードするDNAのアンチセンスプライマーである。
配列番号14:ヒトタンパク質コラーゲンIα1LをコードするDNAのセンスプライマーである。
配列番号15:ヒトタンパク質コラーゲンIα1LをコードするDNAのアンチセンスプライマーである。
配列番号16:融合遺伝子GST S355−D415のDNAのセンスプライマーである。
配列番号17:融合遺伝子GST S355−D415のDNAのアンチセンスプライマーである。
配列番号18:融合遺伝子GST G128−L212のDNAのセンスプライマーである。
配列番号19:融合遺伝子GST G128−L212のDNAのアンチセンスプライマーである。
配列番号20:融合遺伝子GST V228−S279のDNAのセンスプライマーである。
配列番号21:融合遺伝子GST V228−S279のDNAのアンチセンスプライマーである。
配列番号22:融合遺伝子GST D306−N373のDNAのセンスプライマーである。
配列番号23:融合遺伝子GST D306−N373のDNAのアンチセンスプライマーである。
配列番号24:配列番号4に記載したヒトタンパク質トロポエラスチンをコードするmRNAのRT−PCRセンスプライマーである。
配列番号25:配列番号4に記載したヒトタンパク質トロポエラスチンをコードするmRNAのRT−PCRアンチセンスプライマーである。
配列番号26:配列番号1に記載したヒトタンパク質LOXLをコードするmRNAのRT−PCRセンスプライマーである。
配列番号27:配列番号1に記載したヒトタンパク質LOXLをコードするmRNAの配列のアンチセンスプライマーである。
配列番号28:配列番号6に記載したヒトタンパク質LOXをコードするmRNAのRT−PCRセンスプライマーである。
配列番号29:配列番号6に記載したヒトタンパク質LOXをコードするmRNAのRT−PCRアンチセンスプライマーである。
配列番号30:ヒトタンパク質アクチンをコードするmRNAのRT−PCRセンスプライマーである。
配列番号31:ヒトタンパク質アクチンをコードするmRNAのRT−PCRアンチセンスプライマーである。
配列番号32:融合遺伝子GST 517−581のDNAのセンスプライマーである。
配列番号33:融合遺伝子GST 517−581のDNAのアンチセンスプライマーである。
配列番号34:融合遺伝子GST 664−720のDNAのセンスプライマーである。
配列番号35:融合遺伝子GST 664−720のDNAのアンチセンスプライマーである。
Claims (10)
- ヒト皮膚細胞のコスメティックケアのための物質であって、
前記コスメティックケアは、機能的弾性繊維の形成を刺激することからなり、
前記物質は、配列番号1に記載のリシルオキシダーゼ類似アイソフォーム(LOXLとも
称される)、又は、LOXLの活性又は発現を促進する成分から選択されることを特徴と
する、
イノンド、スグリ、カルダモン、クロハツカダイコン、ナギイカダ(box holly)、アサフェティーダガム(Asea foetida gum)、ヘキセン酸エチル、酪酸メチル、並びに、デカジエン酸エチルからなる群より選択される物質。 - LOXLの発現は、LOXLをコードするヌクレオチド配列の発現か、又は、タンパク質LOXLの一部を構成するペプチド配列の発現のどちらかであり、前記ペプチド配列は配列番号1から選択される
ことを特徴とする請求項1に記載の物質。 - 前記物質は、化粧用物質である
ことを特徴とする請求項1又は2に記載の物質。 - 前記物質は、タンパク質エラスチンの発現を刺激する、又は弾性繊維の形成を刺激するためのタンパク質エラスチンの発現を刺激する物質と組み合わされる
ことを特徴とする請求項1〜3のいずれか1項に記載の物質。 - 前記物質は、ヒトLOXL遺伝子のプロモーター(Pr)のヌクレオチド配列(配列番号3)の少なくとも一部に結合する領域、又は、ヒトLOXL遺伝子のプロモーター(Pr)のヌクレオチド配列(配列番号3)の少なくとも一部に結合するタンパク質の発現を変化させる領域を含む
ことを特徴とする請求項1〜4のいずれか1項に記載の物質。 - 組織における弾性繊維の新たな形成を誘導するために、その結果として得られた組織の弾力性を刺激するために、かつ、皮膚の皺を減らすために行う
ことを特徴とする請求項1〜5のいずれか1項に記載の物質。 - 組織のたるみに抵抗するために、又は、加齢又は太陽暴露の過程で観察される組織のたるみに抵抗するために、又は、細胞外マトリックスの密度を高めるために、又は、皮下組織を引き締めるために、又は、皮膚の皺を減らすために、又は、抗皺効果を発揮させるために、又は、栄養失調による瘢痕やケロイド傷の改善のために、又は、瘢痕の組織の質及び瘢痕の外観を改善するために、又は、伸展線に抵抗するために行う
ことを特徴とする請求項1〜6のいずれか1項に記載の物質。 - イノンド、スグリ、カルダモン、クロハツカダイコン、ナギイカダ(box holly)、アサフェティーダガム(Asea foetida gum)、ヘキセン酸エチル、酪酸メチル、並びに、デカジエン酸エチルからなる群から選択される活性成分を、必要に応じて化粧品に許容される賦形剤との混合物として含む
ことを特徴とする化粧組成物。 - イノンド、スグリ、カルダモン、クロハツカダイコン、ナギイカダ(box holly)、アサフェティーダガム(Asea foetida gum)、ヘキセン酸エチル、酪酸メチル、並びに、デカジエン酸エチルからなる群から選択される活性成分を、必要に応じて食品に許容される賦形剤との混合物として含む
ことを特徴とする栄養補助組成物。 - イノンド、スグリ、カルダモン、クロハツカダイコン、ナギイカダ(box holly)、アサフェティーダガム(Asea foetida gum)、ヘキセン酸エチル、酪酸メチル、並びに、デカジエン酸エチルからなる群から選択される活性成分を、必要に応じて薬学的に許容される賦形剤との混合物として含む
ことを特徴とする医薬組成物。
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