KR0143719B1

KR0143719B1 - 백하수오로부터 추출한 암세포의 다중약제내성조절 작용을 갖는 폴리옥시프레그난 배당체

Info

Publication number: KR0143719B1
Application number: KR1019940013974A
Authority: KR
Inventors: 이정준; 김영호; 황방연; 김세은; 김항섭; 이성우
Original assignee: 김은영; 한국과학기술연구원
Priority date: 1994-06-21
Filing date: 1994-06-21
Publication date: 1998-07-01
Also published as: KR960000917A

Abstract

본 발명은 백하수오로부터 추출한 폴리옥시프레그난 배당체, 윌포사이드 에이, 윌포사이드 케이완엔 및 시나우리코사이드 에이 및 그 제조방법과 약학적 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 화합물은 암 세포의 다중 약제내성을 조절함으로써 항암제의 치료 효과를 크게 향상시킨다.

Description

백하수오로부터 추출한 암세포의 다중약제내성조절 작용을 갖는 폴리옥시프레그난 배당체

제1도는 윌포사이드 에이의 자외선 흡수 스펙트럼이고,

제2도는 윌포사이드 에이의 수소 핵자기 공명 스펙트럼이고,

제3도는 윌포사이드 에이의 탄소 핵자기 공명 스펙트럼이고,

제4도는 윌포사이드 케이완엔의 수소 핵자기 공명 펙트럼이고,

제5도는 시나우리코사이드 에이의 수소 핵자기 공명 스펙트럼이다.

본 발명은 백하수오(Cynanchum wilfordii)로 부터 분리된 윌포사이드 에이, 윌포사이드 케이완엔 및 시나우리코사이드 에이를 유효성분으로 하는, 암세포의 다중 약제내성을 억제하는 조성물에 관한 것이다.

현재 암 치료를 위하여 60 여종의 다양한 함암제가 사용되고 있다. 그러나 상당수의 항암제는 암세포의 증식속도가 빠른 혈액암 세포 등에 대해서는 유일할만한 치료효과를 보이는 반면, 증식속도가 느린 고형암 세포 등에 대해서는 뚜렷한 치료효과를 나타내지 못하고 있다. 더욱이 처음에는 치료효과를 보이던 항암제도 반복적으로 장기간 투여하거나 재발된 암 세포의 경우에는 암 세포가 항암제에 대해 내성을 획득함으로써 치료효과를 상실하는 경향을 보인다.

특히 암 세포가 구조나 작용기전이 상이한 아드리아마이신(adriamycin), 콜히친(cholchicine), 빈블라스틴(vinblastine), 빈크리스틴(vincirstine), 탁솔(taxol), 악티노마이신 디(actinomycin D) 등 여러가지 종류의 항암제에 내성을 나타내는 이른바 다중 약제내성을 획득하면 치료가 극히 어려운 것으로 보고되고 있다.

그러므로 이러한 다중 약제내성을 조절할 수 있는 물질에 대한 연구가 진행되고 있으며 이와 관련된 몇가지 약제가 보고되어 있다. 즉, 칼슘 길항제인 베라파밀(verapamil, Tsuruo et al. Cancer Res. 45, 3002-3007(1985)), 트리플루오로페라진(trifluoroperazine) 등의 칼모듈린 저해제, 항말라리아제인 퀴니딘(quinidine, Tsuro et al. Cancer Res. 44, 4303-4307(1984)) 등이 다중 약제내성 세포주를 감수성 세포주로 전환시켰다고 보고되었으나 이들은 부작용이 심하고 그 효용도가 낮기 때문에 보다 강력한 효과와 함께 부작용이 적은 물질이 절실히 요구되고 있는 실정이다.

따라서 본 발명자들은 다중 약제내성을 획득한 암 세포를 감수성 세포로 전환시킴으로써 암세포의 다중 약제내성을 극복할 수 있는 물질에 대해 광범위하게 연구한 결과 백하수오(Cynanchum wilfordii)로부터 얻은 것으로서, 프레그난(pregnane)의 골격에 다수의 산소 원자가 치환되어 있는 폴리옥시프레그난 배당체 화합물들이 이와 같은 활성을 갖는 것을 발견하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 백하수오로부터 분리된 윌포사이드 에이, 윌포사이드 케이완엔 및 시나우리코사이드 에이 중 어느 한 화합물 또는 그 혼합물, 그 유도체 또는 그것의 약학적으로 허용되는 염을 유효 성분으로 하여, 암 세포의 다중 약제내성을 억제하여 항암제의 활성을 증가시키는 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명에 따라서, 하기 일반식(Ⅰ)로 표시되는 윌포사이드 에이, 그 유도체 및 약학적으로 허용되는 그것의 염이 제공된다.

본 발명은 하기 일반식(Ⅱ)로 표시되는 윌포사이드 케이완엔, 그 유도체 또는 약학적으로 허용되는 그것의 염을 제공한다.

본 발명은 하기 일반식(Ⅲ)으로 표시되는 시나우리코사이드 에이, 그 유도체 또는 약학적으로 허용되는 그것의 염을 제공한다.

본 발명은 백하수오(Cynanchum wilfordii)로부터 추출한 폴리옥시프레그난 배당체를 제공한다.

백하수오(Cynanchum wilfordii)는 큰조롱의 괴근으로 박주가리과에 속하는 다년생 덩굴성 초본으로서 중약대사전과 대약대사전과 대한약전외 한약(생약)규격집에 수재되어 있는 생약이다. 국내에서는 제주도, 전남, 경남을 비롯하여 전국에 야생하고 있으며, 하수오의 대용으로 널리 사용되고 있다. 큰조롱의 동속식물은 우리나라를 비롯하여 일본, 중국 등지에 광범위하게 분포되어 있고 우리나라에는 11종이 자생하고 있으며, 대표적인 식물로는 산해박, 백미꽃, 민백미꽃 등이 잘 알려져 있다.

한방에서는 큰조롱이 자양, 강장, 보혈, 익정, 소종 등의 효능이 있는 것으로 알려져 있고, 장기간의 질병으로 인한 쇠약, 빈혈, 조기 백발, 만성풍비(만성의류주성 관절, 류머티즘통), 신경성 쇠약, 장출혈과 오래된 괴양의 상구 치료용으로 사용되고 있다(정보섭, 신민교 도해 향약(생약) 대사전(식물편), 영림사, 984-985(1990)). 또한 백하수오의 성분으로는 윌포사이드류(C3N, CIN, C2N, C3G, CIG, C2G, DIN, KIN, MIN, FIN, WIN, W3N, GIG) 등이 분리, 보고되었다(Mitsuhashi H. et al., Chem. Pharm. Bull. 33, 6, 2294-2304 (1985)).

최근 이 속에 포함되는 식물에서 분리한 물질들이 세포 면역반응과 마크로파지의 식균작용을 향상시키며, 간질에 대한 치료 효과를 나타내고, 항암 활성과 관련되어 있는 것으로 밝혀지고 있으나(Hiroshi, M. et al., Shoyakugaku Zasshi 39, 1-27, (1985)), 이러한 폴리옥시프레그난 화합물들이 암세포의 다중 약제내성을 억제할 수 있는 활성을 가진다는 것은 아직 보고된 바 없으며 본 발명자에 의해서 최초로 발견된 것이다.

본 발명의 윌포사이드 에이, 윌포사이드 케이완엔 및 시나우리코사이드 에이 또는 폴리옥시프레그난 배당체는 백하수오로부터 얻어진다. 즉, 백하수오, 특히 그 뿌리를 유리 용매로 추출하여 배당체를 분리한 후, 배당체를 계속해서 유기 용매로 분획하고 이어서 크로마토그라피를 행하여 본 발명의 윌포사이드 에이, 윌포사이드 케이완엔 또는 시나우리코사이드 에이를 분리, 정제한다. 이때, 유기용매로는 메탄올, 에탄올, 부탄올 등이 바람직하게 사용된다.

백하수오로부터 유기 용매(예컨대, 메탄올)로 추출한 추출물 자체도 암 세포의 다중 약제내성을 극복하는 효과를 가지기 때문에 백하수오 추출물과 항암제를 병용 투여하면 좋은 치료 효과를 나타낸다. 이 때 백하수오 추출물의 투여량은 1 내지 500㎎/㎏/일이 바람직하다.

본 발명의 윌포사이드 에이, 윌포사이드 케이완엔 또는 시나우리코사이드 에이 화합물은 1㎍ 내지 500㎎/㎏/일의 양으로 경구 또는 비경구 투여할 수 있다. 이 때 이들 유효 성분과 제약학적으로 허용되는 각종 담체, 부형제를 혼합하여 제제화할 수 있다. 본 발명의 화합물 또는 제제는 경구 또는 비경구적으로 투여될 수 있다. 이하에서 실시예를 통하여 본 발명을 더 상세히 설명하지만, 본 발명의 범위가 이들 실시예로 제한되는 것은 아니다.

[실시예 1]

윌포사이드 케이완엔(wilfoside KIN)의 분리

음건하여 세절한 백하수오 3㎏을 실온에서 메탄올로 3회 추출하고 감압, 농축하여 메탄올 추출물 480g을 얻었다. 이를 계속해서 디클로로메탄과 물로 분획하여 디클로로메탄 추출물 87g을 얻었다. 이 추출물을 실리카 겔 컬럼 크로마토그라피(디클로로메탄:메탄올=20:1, 10:1, 5:1, 2:1)를 반복 실시하여 분획 1 내지 분획 6을 얻었다.

위에서 얻어진 분획중 분획 2를 다시 실리카 겔 컬럼 크로마토그라피로 정제하여 분획 7 내지 12를 얻었다. 여기서 분획 9를 역산 MPLC(물 1:메탄올 gradient)와 분취 HPLC를 행하여 표제의 화합물 40㎎을 얻었다.

분리된 윌포사이드 케이완엔의 이화학적 특징은 다음과 같다.

(1)물질의 성상:백색 무정형 분말

(2)융점:183-187℃

(3)정색 반응:리버만-부챠드(liebermann-Burchard) 반응에 양성

컬러-킬리아니(Keller-Kiliani) 반응에 양성

(4)수소 핵자기 공명 스펙트럼(¹H-NMR) 스펙트럼(CDCL₃300㎒):듀트로클로로포름(CDCl₃)을 용매로 하고 테트라메틸실란(TMS)을 표준 물질로 하여 측정한 수소 핵자기 공명(¹H-NMR)의 스펙트럼은 제4도와 같다.

[실시예 2]

윌포사이드 에이(wulfoside A)의 분리

실시예 1에서 얻어진 분획 11을 역상 MPLC(메탄올:물=85:15)를 실시하여 분획 13과 분획 14로 분리하고 그 중 분획 14를 분취 크로마토그라피하여 표제의 화합물 39㎎을 얻었다. 분리된 윌포사이드 에이의 이화학적 특성은 다음과 같다.

(1)물질의 성상:백색 무정형 분말

(2)분자량:766

(3)분자식:C₄₄H₆₂O₁₁

(4)융점:177-179℃

(5)자외선 흡수 스펙트럼(UV_maxnm):메탄올에서 측정한 자외선 흡수 스펙트럼은 제1도와 같다.

(6)수소 핵자기 공명 스펙트럼(¹H-NMR) 스펙트럼(CDCL₃300㎒):듀트로클로로포름(CDCl₃)을 용매로 하고 테트라메틸실란(TMS)을 표준 물질로 하여 측정한 수소 핵자기 공명(¹H-NMR)의 스펙트럼은 제2도와 같다.

1.01(3H, d, J=6.3㎐, 5-CH₃)

1.06(3H, d, J=6.9㎐, 6-CH₃)

1.16(3H, s, 18-CH₃)

1.23(3H, d, J=6.0㎐, 21-CH₃)

1.27(3H, d, J=6.0㎐, suger 6-CH₃)

1.54(3H, s, 19-CH₃)

1.86(3H, s, 19 -CH₃)

2.03(1H, m, 4-CH₃)

3.42(3H, d, J=3.-㎐, sugar 3-OCH₃)

4.70(1H, q, J=6.0㎐, 20-CH)

4.79(1H, br d, J=7.5㎐, anomeric H)

5.36(1H, br s, 6-CH)

5.67(1H, br s, 2-CH)

6.25(1H, d, J=15.9㎐, 3'-CH)

7.34(3H, m, 6', 7', 8'-CH)

7.45(2H, m, 5', 9'-CH)

7.57(1H, d, J=15.9㎐, 2'-CH)

(7)탄소 핵자기 공명 스펙트럼(CDCl₃, 75㎒):듀트로클로로포름(CDCl₃)을 용매로 하고 테트라메틸실란(TMS)를 표준물질로 하여 측정한 탄소 핵자기 공명(¹³C-NMR) 스펙트럼은 제3도와 같다.

(8)용해성

용해:메탄올, 에탄올, 에틸아세테이트, 아세톤, 클로로포름

불용해:물, 헥산

(9)고속 액체 크로마토그라피(HPLC)의 Rt:8.86분

기기:Waters model(501 pump)

컬럼:YMC-pack ODS-A(250×4.6×㎜)

이동 용매:물-메탄올(15-85)

검출기:UV

[실시예 3]

시나우리코사이드(cynauricoside A)

실시예 2에서 얻어진 분획 13을 분취 크로마토그라피하여 시나우리코사이드 47㎎을 얻었다. 얻어진 시나우리코사이드 에이의 이화학적 특성은 다음과 같다.

(1)성상:백색 무정형 분말

(2)융점:167-173℃

(3)수소 핵자기 공명 스펙트럼(¹H-NMR) 스펙트럼(CDCl₃, 300㎒):듀트로클로로포름(CDCl₃)을 용매로 하고 테트라메틸실란(TNS)을 표준 물질로 하여 측정한 수소 핵자기 공명(¹H-NMR)의 스펙트럼은 제5도와 같다.

1.13(3H, s, 18-CH₃)

1.21, 1.22(each 6H, s, suger 6-CH₃)

1.47(3H, s, 19-CH₃)

2.19(3H, s, 21-CH₃)

2.85(1H, m, 3-Chα)

3.36, 3.39, 3.41, 3.43(each 3H, s, suger 3-OCH₃)

4.37(1H, d, J=6.3㎐, anomeric H)

4.75(1H, d, J=10.5㎐, anomeric H)

4.77(1H, br s, anomeric H)

4.83(1H, br d, J=9.0㎐, anomeric H)

4.96(1H, br s, anomeric H)

5.35(1H, br s, 6-CH)

6.29(1H, d, J=15.3㎐, 3'-CH)

7.36(3H, m, 6', 7', 8'-CH)

7.49(2H, m, 5', 9'-CH)

7.60(1H, d, j=15.3㎐, 2'-CH)

[실시예 4]

활성시험

인체 상피암 세포주(Human epidermoid carcinoma)인 KB 3-1 세포주(미국 국립 암연구소(NCI)의 M. Gottesman 박사로부터 얻음) 및 동 세포주에 빈블라스틴을 처리하여 내성을 유도시킨 KB-V1 세포주를 각각 10% 우태아 혈청(fetal calf serum), 2nM 글루타민, 페니실린(50unit/㎖), 스트렙토마이신(50㎍/㎖)을 함유한 배지(Dulbecco's modified Eagles Medium, D-MEM)을 사용하여 37℃, 5% CO₂배양기에서 배양하였다. KB-V1 세포는 내성을 유지하기 위하여 1㎍/㎖의 빈블라스틴을 함유한 D_MEM 배지에서 계속적으로 배양하였다.

다중 약제내성 조절 작용의 검색을 위하여 대수 증식기(log phase)에 있는 KB-V1 세포를 96 웰 플레이트의 한 웰(well)당 5×10³세포가 되도록 분주하여 24시간 배양한 후 백하수오의 메탄올 추출물을 단계별로 희석한 시료 용액을 100nM(KB-V1에 대한 IC₅₀의 1/10 농도)의 빈블라스틴을 함유한 플레이트와 빈블라스틴을 함유하지 않은 플레이트 각각에 가하여 48시간 배양한 후 세포에 독성이 없는 추출물의 농도를 정하고, 이 농도에서 빈블라스틴의 세포독성을 증가시키는 화합물을 추적하였다. 이러한 활성추적법에 의해 분리, 정제된 순수 화합물에 대해서는 시료를 단계별로 희석하여 상기와 같은 방법으로 시료의 세포독성을 측정하였다. 동시료가 세포성장을 10% 저해하는 농도 이하의 농도를 선정하여 단계별로 희석한 빈블라스틴과 함께 처리하여 내성 세포에 대한 빈블라스틴의 세포 독성의 증가 정도(Degree of Potentiation, D.P.)를 측정하였다.

KB-V1 세포와 KB 3-1 세포에 대한 빈블라스틴의 IC₅₀는 각각 4,800ng/㎖, 1.48ng/㎖로서, KB-V1 세포가 KB 3-1 세포에 비해 빈블라스틴에 대하여 약 3,243배의 내성을 나타내었다. 대조약물로 사용한 Ca⁺⁺길항약인 베라파밀(verapamil)의 경우 5㎍/㎖의 농도에서 빈블라스틴의 세포 독성을 약 221배 증가시켰다.

한편, 백하수오의 메탄올 추출물은 1-100㎍/㎖의 농도에서 빈블라스틴 세포 독성을 10-500배 증가시켰으며, 윌포사이드 케이완엔은 10㎍/㎖의 농도에서 KB 3-1 세포의 독성은 증강시키지 않고, KB V-1 세포의 독성을 약 1150배 증가시켰다. 시나우리코사이드 에이의 경우 50㎍/㎖의 농도에서 KB 3-1의 세포 독성은 증가시키지 않고 KB V-1의 세포 독성을 15배 증가시켰으며, 윌포사이드 에이의 경우는 50㎍/㎖의 농도에서 KB V-1의 세포 독성을 3배 증가시켰다.

이와 같이 본 발명의 화합물들은 암 세포의 다중 약제내성을 억제함으로써 기존 항암제의 치료 효과를 크게 증가시키는 것으로 밝혀졌다. 특히, 본 발명의 화합물들은 다중 약제내성을 획득한 암 세포를 항암물질에 대한 감수성 세포로 전환시키고 항암제의 부작용을 감소시키기 때문에 암 체료에 획기적인 역할을 할 것으로 기대된다.

Claims

유효성분으로서 백하수오(Cynanchum wilfordii)로부터 추출한 윌포사이드 에이, 윌포사이드 케이완엔 및 시나우리코사이드 에이로 구성된 그룹에서 선택된 적어도 한 화합물, 그 유도체 또는 그것의 약학적으로 허용되는 염, 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 암세포의 다중 약제내성을 억제하여 항암제의 활성을 증가시키는 조성물.