KR101032510B1

KR101032510B1 - 에치나세아 앙구스티홀리아의 추출물

Info

Publication number: KR101032510B1
Application number: KR1020057001425A
Authority: KR
Inventors: 안드레아 지오리; 알레산드로 아넬리; 파올로 모라쪼니; 프랑세스코 디피에로
Original assignee: 인데나 에스피아
Priority date: 2002-07-30
Filing date: 2003-06-30
Publication date: 2011-05-06
Also published as: PL373237A1; US20040022878A1; IL166557A0; DE60316578T2; RU2005102103A; SI1539203T1; EP1539203B1; PT1539203E; DE60316578D1; EP1539203A1; IL166557A; ITMI20021691A1; AU2003249900B2; ES2293061T3; KR20050025998A; BR0313082A; CA2494088C; JP4537849B2; NO332623B1; WO2004014404A1

Abstract

본 발명은 알킬아마이드류의 함량이 0.1 % 이하이고, 폴리사카라이드 함량이 1 내지 15 % 이며, 이 폴리사카라이드는 1.3 ×10⁵ Da 의 무게를 갖으며, 람노스, 아라비노, 갈락토스 및 갈락투론산을 0.5 : 7.5 : 1.75 : 10.25 비율로 구성된 에치나세아 앙구스티홀리아(Echinacea angustifolria)추출물과 그의 제조방법에 관한 것이다.

본 발명의 추출물은 면역방어를 강화시켜줄 필요가 있는 병적상태를 치료하기 위하여 사용될 수 있다.

에치나세아 앙구스티홀리아 추출물(Echinacea angustifolia extract), 면역강화작용.

Description

에치나세아 앙구스티홀리아의 추출물{Echinacea angustifolia extracts}

본 발명은 에치나세아 앙구스티홀리아(Echinacea angustifolia)의 뿌리에서 얻을수 있는 추출물 및 그의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 추출물은 면역방어(immune defences) 강화를 필요로하는 병적상태의 치료에 사용될 수 있다.

에치나세아(Echinacea) 식물은 북미와 멕시코가 원산이고; 치료상 성질은 상처치유에 사용된다고 미국원주민에게 잘 알려져 있다. 에치나세아는 실제 감염에 대한 저항성을 증가시키기 때문에, 지난 세기의 최초 몇년간은 국소와 일반화된 감염치료 용도로 폭넓게 알려져 있다.

에치나세아, 특히 에치나세아 앙구스티홀리아는 요즘 인푸렌자증후군을 치료하는데에 크게 추천할 수 있는 약물로, 특히 감기치료, 상처치료 및 진균증치료에 유용한 것으로 알려져있다.

일반적인 작용기전은 분명 면역체계의 비특이성자극(aspecific stimulation)과, 화학요법제 및 항생물질에 대한 세균 및 병원균의 감수성(sensitization of germs and pathogens)에 기인한다. 반흔화 형성성질은 식물중에 포함된 활성성분중에 하나인 에치나코사이드(echinacoside)에 의해 영향을 보이는 히알유로니다제(hyaluranidase)의 억제를 통한 히알유론산(hyaluronic acids)을 안정화시키는 능력에 기인하는 것 같고, 그리고 폴리사카라이드에 의해 유발된 광범한 마크로파지 활성화에 기인하는 것 같다.

이렇게 하여, 감염 병소가 국소적으로 남게 되고, 뮤코폴리사카라이드류 화합물의 축적과 히스토프라스틱 재료(hystoplastic material)가 필요하게 된다.

따라서, 면역체계 자극에 대한 에치나세아의 효능을 극대화하기 위하여, 에치나코사이드(echinacoside)와 폴리사카라이드(polysaccharide)가 풍부한 추출물을 제공하는 것이 바람직하다.

식물의 활성성분중에는 알킬 아마이드류(alkylamides)군에 속하는 물질이 함유되어 있으며, 특히 에치나세인(echinacein)이 있고, 운데실레닉산(undecylenic acids)및 도데카에니닉산(dodecaeninic acids)의 이소부틸아마이드류(isobutyl amides)가 있으며, 게다가 이들은 식물요법 성질을 발휘하고, 생체 외에서 사이클로옥시게나제(Planta Med. 60(1):37-40, 1994)와 5-리폭시게나제를 억제한다.

알킬아마이드류는, 비록 생물학적 작용을 갖으나 높은 독성도 갖고 있다. 실제 본원발명의 출원인은 생체 외에서의 콘카나발린-에이(concanavaline-A; Con-A) 또는 리포폴리사카라이드(lipopolysaccharide ; LPS)을 공동자극하는 쥐의 비장세포(murine splenocytes)에 대한 연구를 수행하였는바, 알킬아마이드류의 세포 독성은 1㎍/㎖ 농도에서 보이기 시작하였다. 더욱이, 알킬아마이드류 20 % 농도를 포함하는 추출물은 5 ㎎/㎖ 또는 그 이상을 복강 내(ip) 투여시 쥐의 장 운동(intestinal motility)을 현저히 억제하였고, 경구투여시 LD₅₀ 치는 236 ㎎/㎏ 이었다. 알킬아마이드류의 0.5 % 농도함유추출물 역시 약물학적 활성용량으로 30일간 동물에 투여하는, 아급성독실실험에서 독성을 보였다.

따라서 알킬아마이드류의 성분은 적고 에치나코사이드와 폴리사카라이드류 성분은 풍부한 에치나세아 추출물의 제조가 필요하게 되었다.

에치나세아 추출물은, 예를들면 에탄올-물 혼합용매로 또는 초임계 이산화탄소 용매로 추출하여 제조될 수 있다.

WO 01/22977호에는 식물의 2개 또는 3개의 성분, 특히 폴리사카라이드류, 시코릭산(cicoric acid) 및 알킬아마이드류의 표준량을 포함하는 에치나세아 추출물의 제조방법이 개시되어 있다.

각 성분들은 에탄올-물 혼합물로 장시간동안 식물의 다른 부분들을 추출하여 얻었다. 다음 이들추출물들을 약제학적 조성물 제조를 위하여 모은 것이었다.

본 발명의 목적은 에치나세아 앙구스티홀리아(Echinacea angustifolia)에서 유래된 알킬아마이드류 함량이 0.1 % 이하이고, 에치나코사이드 함량이 1 내지 10 % 이며, 폴리사카라이드 함량이 1 내지 15 % 인 에치나세아 앙구스티홀리아 추출물을 제공하고자 하는 것이다. 이하 "폴리사카라이드"라 한다. 이 폴리사카라이드의 분자량은 1.3 ×10⁵ Da를 갖으며, 람노스(rhamnose), 아라비노스(arabinose), 갈락토스(galactose) 및 갈락투론산(galacturonic acid)을 0.5 : 2.5 : 1.75 : 10.25의 비율로 구성되고,

폴리사카라이드의 골격구조는, 직쇄와 가지 부분이 반복적으로 교차하고 있는데, 직쇄 부분은 a-(1-4) 결합을 통하여 연결된 부분적으로 아세틸화 되고(9 %), 메틸화된 (35 %) 갈락투론산 잔기들로 구성되어 있으며, 가지 부분은 갈락투론산과 람노스가 반복적으로 교차하여 구성되며, 아라비노스와 갈락토스가 2.5 : 1.75 비율로 구성된 측쇄가 붙어있다.

본 발명의 추출물은 다음 단계로 구성된 공정에 따라 에치나세아 앙구스티홀리아(Echinacea angustifolia)를 자연 또는 배양된 뿌리에서 얻을 수 있다:

1. 식물뿌리를 유기용매 또는 40 % (v/v)이하의 물 함량을 갖는 유기용매-물과의 혼합물로 추출한 다음, 합하고 농축된 추출물을 무극성 용매로 반복세척하고;

2. 식물뿌리를 물 또는 60 % (v/v) 또는 그 이상, 바람직하게는 80 내지 85 % (v/v)의 물 함량을 갖는 유기용매-물과의 혼합물로 추출한 다음;

3. 위의 단계들에서 얻어진 추출물을 혼합한다.

본 발명의 목적을 위한 "유기용매"로는 탄소원자 1 내지 3개를 포함하는 아세톤 또는 알콜중에서 선택된 유기용매를 뜻하며, 에탄올이 바람직하다.

상기 첫번째 단계(단계 1)는 알킬아마이드 성분들을 제거하고 에치나코사이드 성분이 풍부한 추출물을 얻기 위한 것으로 다음과 같이 구성되어 있다:

1a. 뿌리를 20 ℃ 내지 유기용매의 환류온도 또는 물-유기용매 혼합물의 환 류온도범위, 바람직하게는 환류하에 추출하고;

1b. 얻은 추출물을 소용량이 될때까지 농축시킨다음;

1c. 농축물을 50 % 이상 농도로 물을 함유하는 물-유기용매 혼합물중에 용해시키고,

1d. 반복하여 물-유기용매 혼합물을 예를들면 에텔,펜탄,헥산 또는 헵탄중에서 선택된 무극성용매, 바람직하게는 헥산으로 세척한다음;

1e. 물-유기용매 혼합물을 증류시킨다.

상기 두번째 공정(단계 2)은 폴리사카라이드가 풍부한 추출물을 얻기 위한 것으로, 다음과 같이 구성된다 :

2a. 전단계 추출에서 얻은 뿌리를 20 ℃ 내지 물 또는 용매 혼합물의 비점의 온도범위에서, 바람직하게는 40 내지 70 ℃ 에서 추출하고;

2b. 추출물이 소용량이 될때까지 농축시킨다음;

2c. 잔사를 유기용매함량이 50 내지 70 % (v/v)인 물-유기용매의 혼합물중에 용해시켜 침전물을 얻고;

2d. 여과하고 동일한 용매혼합물로 세척한다.

본 발명에 따른 바람직한 태양은 단계 2c 를 에탄올, 더욱 바람직하게는 66.5 % (v/v)에탄올로 수행되는데, 즉 단계 2b 에서 얻은 잔사를 물 3부에 용해시킨다음 95 % 에탄올 (v/v) 7 용적에 실온에서 저어주면서 희석시키는 것이다.

상기 세번째 단계(단계 3)는 다음과 같이 구성하는 것이 바람직하다:

3a. 전단계에서 모은 추출물들을 물-유기용매 혼합물, 바람직하게는 유기용매로 에탄올이 해당되며, 60 % (v/v) 또는 그 이상, 바람직하게는 80 ~ 85 % (v/v)의 물이 함유된 에탄올에 용해시키고;

3b. 물-유기용매 용액을 농축시키고 감압하 건조시킨다.

위 1a 단계에서의 추출은 90 % (v/v) 에탄올로 수행함이 바람직한 반면, 2a 단계에서의 추출은 15 % (v/v)에탄올로 수행함이 바람직하다.

본 발명에 따른 추출은 쥐에서 면역-자극 성질(immune-stimulating properties)을 보여주었고, 특히 T-임파구 활성을 자극시켰고, 사이클로스포린 A로 면역 억제된 쥐에서의 캔디다 알비칸스(Candida albicans)감염으로 인한 사망율이 감소되었음이 입증되었다.

따라서, 본원발명의 추출물은 면역체계방어의 증가를 필요로 하는 상태의 환자에게 투여하는, 의약, 보조식품, 또는 영양제 조성물의 제조를 위해 사용될수 있다.

본 발명에 따른 추출물은 관용의 기술, 예를들면, 레밍톤 파마슈티칼 사이언스 핸드북(Remington's Pharmaceutical Sciences Handbook, XⅦ 판, Mack Pub., N.Y., USA)에 기재되어 있는 기술등에 따라 제제화할 수 있다.

도 1은 실시예 3 추출물중 폴리사카라이드류의 HPLC 프로파일이고,

도 2는 실시예 3 추출물중 에치나코사이드와 알킬아마이드류의 HPLC 프로파일에 관한 도이다.

이하, 본 발명에 따른 실시예 몇몇을 하기에 기재한다.

[실시예]

실시예 1

단계 1 : 에치나코사이드(echinacoside)가 풍부한 추출물의 제조

에치나세아 앙구스티홀리아(Echinacea angustifolia)의 지하뿌리 600 그람을 90 % (v/v) 에탄올 2.5 L 로 4 시간동안 환류하에 추출하였다. 침출액(percolate)을 모으고 동일용매로 7 회 더 추출을 행하였고; 침출액을 모으고 뿌리는 다음 단계를 위하여 보존하였다.

모은 침출액을 여과하고, 감압하 소용량이 될때까지 농축시켰다.

농축물을 물과 에탄올에 희석시켜 50 % (v/v) 에탄올 용액을 만든다음 헥산으로 10 회 추출하였다. 헥산층은 알킬아마이드류를 포함하고 있어 경사하였다.

정제된 수에탄올용액(hydroethanolic solution)을 감압하 농축, 건조시켜 추출물 78.5 g을 얻었다 (에치나코사이드 HPLC 적정 : 9.8 % ; 알킬아마이드류 HPLC 적정 : 0.07 %).

실시예 2

단계 2 : 폴리사카라이드가 풍부한 추출물의 제조

실시예 1 에 따라 90 % (v/v) 에탄올로 추출하여 얻은 에치나세아 앙구스티홀리아 뿌리를 추가하여 15 % (v/v) 에탄올 2.5 L 로 70 ℃ 에서 8 회 추출하였다.

얻은 침출액들(percolates)을 여과하고 감압하 농축건조시켰다.

얻어진 건조추출물(171 g)을 물 510 ㎖ 에 용해시키고 95 % (v/v) 에탄올 1200 ㎖ 를 저어주면서 첨가하였다.

침전물을 여과하고 66.5 % (v/v) 에탄올로 세척한다음, 감압하 60 ℃ 에서 건조시켜 정제된 추출물 130 g 을 얻었다. (폴리사카라이드 GPC 적정 : 8.9 %)

실시예 3

중간 추출물들의 혼합

에치나코사이드가 풍부한 추출물 78.5 g 을 폴리사카라이드가 풍부한 추출물 106.5 g 과 혼합하였다. 혼합물을 15 % (v/v) 에탄올 925 ㎖ 로 처리하고, 1 시간동안 저어준후 감압하 진공농축시켜 에치나세아 앙구스티홀리아 추출물 185 g 을 얻었다.(에치나코사이드 HPLC 적정 ; 4.2 % ; 알킬아마이드류 HPLC 적정 : 0.04 % ; 폴리사카라이드 HPLC 적정 ; 5.12 %).

추출물의 HPLC 프로파일을 도 1(비-폴리사카라이드 분획물) 및 도 2(폴리사카라이드 분획물)에 나타내었다.

실시예 4

폴리사카라이드 함량의 HPLC 측정

본 발명에 따른 폴리사카라이드를 포함한 추출물의 특징을 0.5 % 트리에틸아민을 포함한 물에 희석시켜 등용매조건에서 0.5 ㎖/min 의 유속으로 TosoHaas TSK-Gel G 5000 PWXL 컬럼을 사용하여 측정하였다. 분석하는 동안 30 분이 경과되었으며, 컬럼을 50 ℃ 로 유지하였다.

주입량은 50 ㎕ 이었다. 증발검출기 ELSD(Evapovative Light Scattering Detector) Sedex mod. 75 (S.E.D.E.R.E)-2.2 바의 가스압력으로 60 ℃로 유지된 분무기(nebulizer)를 컬럼에 장착시켜 사용하였다.

실시예 5

에치나코사이드와 알킬아마이드류의 함량의 HPLC 측정

에치나세아 앙구스티홀리아 추출물중 에치나코사이드(echinacoside)와 알킬아마이드류(alkylamides)의 함량을 HPLC로 측정하였는바,

Agilent Zorbax SB-C 18 역상컬럼을 UV-관찰 검출기(파랑 235 nm)에 부착시켜 사용하였으며, 1.0 ㎖/min 유속으로 트리후루오로 아세틱에시드 0.01 % 를 함유한 적당한 물/아세토니트릴 구배로 용리시켜 사용하였다. 분석하는동안 60 분이 경과되었으며, 컬럼은 실온을 유지시켰다. 주입량은 10 ㎕ 이었다.

생물학적 연구분야(Biological section)

실험예 1

T-임파구중 r-인터페론의 생성에 관한 실험(주카.엠.등 Zucca M. et. al. New Microbiol. 1996, 19, 39-46)

나일론-울 컬럼을 사용하여 비장세포분리에서 얻어진 쥐의 T-임파구를 임의로 미리 α-CD3 으로 인큐베이션된 미소적정 플레이트(microtifre plates)중에 송아지태반혈청 4 % 로 구성된 1640 RPMI 배지중에서 배양하였다. (α-CD3 은 인터페론을 생산할수 있는 세포기능활성인자인 모노크로날항체 anti-CD3 을 말한다

시험물질을 웰에 첨가하고 48시간 배양배지중에 γ-인터페론의 방출량을 측정하여 표1에 기재하였다.

표 1

실험예 2

마우스중 캔디다 알비칸스(Candida albicans)에 의한 사망효과에 관한 실험(Microbiology, 2000, 146, 1881-9)

이스트(Yeasts)를 사보라우드(sabouraud)한천배지중에서 배양하고, 비-면역증강 마우스에는 3.5×10⁵ 농도로 접종하고, 사이클로스포린 A(CsA) 1 ㎎/㎏ i.p.로 면역억제된 마우스에는 2.9 ×10⁵ 농도로 정맥접종시켰다.

마우스를 매일 본 발명의 추출물 5 와 10 ㎖/㎏ i.p. 로 대조 마우스(미처리군)가 모두 죽을때까지 투여하였다. 실험결과는 약물처리된 그룹중에서 살아남은 생존동물의 수로 평가하였다. (표 2 참조)

표 2

본 발명에 따른 에치나세아 앙구스티홀리아 추출물(Echinacea angustifolia extract)은 면역자극제로 매우 유용하다.

Claims

알킬아마이드류 함량이 0.1 % 이하이고, 폴리사카라이드 함량이 1 내지 15 % 이며, 이 폴리사카라이드는 1.3 ×10⁵ Da 무게를 갖으며, 람노스(rhamnose), 아라비노스(arabinose), 갈락토스(galactose)와 갈락투론산(galacturonic acid)이 0.5 : 2.5 : 1.75 : 10.25 비율로 구성된 폴리사카라이드(polysaccharide)인 에티아나세아 앙구스티홀리아 뿌리 추출물(Echinacea angustifolia root extract).
청구항 1에 있어서, 폴리사카라이드는 직쇄와 가지 부분이 반복적으로 교차하는 골격구조를 갖으며, 직쇄 부분은 α-(1-4) 결합을 통하여 연결된 부분적으로 아세틸화되고 메틸화된 갈락투론산 잔기로 구성되고, 가지 부분은 갈락투론산과 람노스가 반복적으로 교차하여 구성되며 아라비노스와 갈락토스가 2.5 : 1.75 비율로 구성된 측쇄를 갖는 추출물.
다음 단계로 구성된 청구항 1 또는 2의 에치나세아 앙구스티홀리아 추출물의 제조방법.

(다 음)

1. 식물뿌리를 유기용매 또는 40 %(v/v) 이하의 물함량을 갖는 유기용매-물 혼합물로 추출한 다음, 합하고 농축된 추출물을 무극성 용매로 세척하고;

2. 식물뿌리를 물 또는 60 % (v/v) 또는 그 이상의 물함량을 갖는 유기용매-물 혼합물로 추출한 다음;

3. 위의 단계들에서 얻어진 추출물을 혼합한다.
청구항 3에 있어서, 유기용매는 아세톤 또는 탄소원자 1 내지 3의 알콜 중에서 선택하는 제조방법.
청구항 4에 있어서, 유기용매가 에탄올인 제조방법.
청구항 3에 있어서, 단계 1이 하기 공정으로 구성된 제조방법.

(하 기)

1a. 뿌리를 20 ℃ 내지 유기용매의 환류온도 또는 물-유기용매 혼합물의 환류온도범위의 온도에서 추출하고;

1b. 얻은 추출물을 소용량이 될때까지 농축시킨다음;

1c. 농축물을 50 % 이상 농도를 물을 함유하는 물-유기용매 혼합물중에 용해시키고;

1d. 반복하여 물-유기용매 혼합물을 무극성 용매로 세척한다음;

1e. 물-유기용매 혼합물을 증류시킨다.
청구항 6에 있어서, 단계 1a 와 1c 에서 독립적으로 사용된 유기용매가 아세톤 또는 탄소원자 1 내지 3의 알콜 중에서 선택된 제조방법.
청구항 6에 있어서, 단계 1d 의 무극성 용매가 석유에텔, 펜탄, 헥산 또는 헵탄 중에서 선택된 제조방법.
청구항 8에 있어서, 용매가 헥산인 제조방법.
청구항 3에 있어서, 단계 2가 하기공정으로 구성된 제조방법.

(하 기)

2a. 전단계 추출에서 얻은 뿌리를 20 ℃ 내지 물 또는 용매혼합물의 비점의 온도범위에서 추출하고;

2b. 추출물이 소용량이 될때까지 농축시킨다음;

2c. 잔사를 유기용매함량이 50 내지 70 % (v/v)인 물-유기용매의 혼합물중에 용해시켜 침전물을 얻고;

2d. 여과하고 침전물은 동일한 용매혼합물로 세척한다.
청구항 10에 있어서, 유기용매는 아세톤 또는 탄소원자 1 내지 3의 알콜 중에서 선택된 제조방법.
청구항 3에 있어서, 단계 3이 하기공정으로 구성된 제조방법.

(하 기)

3a. 전단계에서 모은 추출물들을 60 % (v/v) 또는 그 이상의 물함량을 갖는 물-유기용매 혼합물에 용해시키고;

3b. 물-알콜용액을 농축시키고 감압하 건조시킨다.
청구항 12에 있어서, 유기용매가 아세톤 또는 탄소원자 1 내지 3의 알콜인 제조방법.
청구항 13에 있어서, 알콜이 에탄올인 제조방법.
청구항 3 내지 청구항 14 중 어느 한 항의 제조방법에 따라 제조될 수 있는 추출물.
유효성분으로 청구항 1 또는 2 중 어느 한 항의 추출물로 구성된 면역자극제.
적당한 부형제와 담체의 혼합물 중에 청구항 1 또는 2 중 어느 한 항의 추출물로 구성된 면역자극제 약제 조성물.
유효성분으로 청구항 15의 추출물로 구성된 면역자극제.
적당한 부형제와 담체의 혼합물 중에 청구항 15의 추출물로 구성된 면역자극제 약제 조성물.