KR100921006B1 - 위염 및 위궤양 질환 치료용 버섯 추출물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 위염, 위궤양 질환 치료용으로 인진쑥 배지에서 배양한 노루궁뎅이 버섯 균사체 추출물 및 영지버섯 균사체 추출물에 관한 것이다.
인진쑥 배지에서 배양한 노루궁뎅이 버섯 균사체 추출물과 인진쑥 배지에서 배양한 영지버섯 균사체 추출물은 노루궁뎅이 버섯 균사체 추출물이나 영지버섯 균사체 추출물 또는 인진쑥추출물에 비하여 우수한 위병변 억제 효과를 나타낸다.
인진쑥, 노루궁뎅이 버섯, 영지버섯, 인진쑥배지, 위장질환치료

Description

위염 및 위궤양 질환 치료용 버섯 추출물{Mushroom Extracts For Treating Gastric Diseases}
본 발명은 위염, 위궤양과 같은 위장질환 치료에 유용한 버섯 추출물에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 인진쑥배지에서 배양한 노루궁뎅이 버섯 균사체 추출물 및 인진쑥 배지에서 배양한 영지버섯 균사체 추출물을 유효 성분으로 함유하는 위염 및 위궤양 등 위장질환 치료제에 관한 것이다.
버섯추출물 또는 버섯배양물의 약리활성 효과는 이미 많이 알려져 있다. 예를 들어, 노루궁뎅이 버섯 배양물의 추출물이 8,9-에폭시 아플라톡신 B1 형성을 저해함으로써 간암, 간염 및 기타 간손상을 보호할 수 있다고 보고된 바 있다.(Food Sci. Biotechnol.. Vol.12, No.2, pp 183-186, (2002), 대한민국 특허공개번호 : 10-2005-0039390, J. Ethnopharmacology, 100, pp 176-179, (2005)) 또한, 평활근 세포의 과다증식으로 유발되는 질환을 예방 치료할 수 있는 것으로 알려져 있 다.(특허공개번호 : 10-2005-0079788) 또한 인진쑥을 포함하는 고체배지에서 노루궁뎅이 버섯이나 영지버섯을 배양하는 방법에 대하여는 이 분야에서 이미 알려져 있으며(공개특허공보 2005-0012054호) 상기 방법으로 배양된 버섯 추출물이 건강증진용 식품첨가제로 이용되고 있다. 인진쑥을 포함하는 고체배지에서 배양된 노루궁뎅이 버섯 추출물이 아세틸 알데히드의 분해를 촉진시켜 알콜의 분해를 촉진시켜 숙취해소에 효능이 있고, 식품첨가제로 유용하게 이용될 수 있는 것으로 알려져 있다.(공개특허번호 2005-0079790호) 그밖에도 노루궁뎅이 버섯 배양물의 추출물이 위염 및 위궤양의 원인으로 밝혀진 헬리코박터 피로리(Helicosbacter pylori)에 대한 항균활성을 가지는 것으로 밝혀진 바 있다.(특허공개번호 : 10-2005-0079791).
노루궁뎅이 버섯(Hericium erinaceum)은 민주름 버섯목(Aphyllophorales) 턱수염 버섯과(Hydnaceae)에 속하고 높은 베타-D-클루칸(β-D-glucan)함량과 강한 항산화 작용(superoxide dismutase)능력으로 인하여 건강식품으로도 각광을 받고 있다. 노루궁뎅이 버섯 100g에는 베타-D-클루칸(글리칸의 다당류)이 20-30g정도 함유되어 있어 암세포의 증식을 억제하여 높은 항암작용이 있음이 알려져 있으며, 소화불량, 신경쇠약, 신체허약, 자양강장, 소화기암 및 수술후 재발방지에 효과가 있으며, 세포의 산화를 막고 노화와 발암을 방지하는 항산화제로 이용되며, 면역력을 증강시켜 체내 면역 조절기능 및 생체기능 향상효과가 있는 것으로 알려져 있다.
인진쑥(Artermisia capillaris)은 우리나라에서는 사철쑥, 약쑥 등으로 부른다. 인진쑥은 카핀렌(capillene), 피넨(pinene), 비타민 B1등이 함유된 건강식품으 로 간에 탁월한 효과가 있는 것으로 알려져 있다. 최근 연구에 의하면, 인진쑥의 줄기인 애엽(Artermisia asiatica)의 추출분획 중 에탄올 분획에서 강력한 항궤양작용을 나타내는 성분을 분리하였으며, 분리된 물질이 프라보노이드(flavonoid) 화합물인 유파틸린(eupatilin)임이 확인되었다. 또한, 인진쑥추출물에 대한 항궤양제 효력, 점액분비에 미치는 영향, 산에 대한 영향 및 자극에 의한 산분비 등의 일부의 작용기전이 연구된 바 있다(The Journal of Applied Pharmacology, 4, 111-121(1996)). 인진쑥 잎을 70-100%의 고농도 에탄올로 추출하여, 혈액응고억제의 부작용을 나타내는 수용성분을 포함하지 않고 유파틸린 및 자세오시딘(jaceosidin)을 고농도로 함유하며 위궤양 병변억제효과와 세포 보호작용을 갖는 프로스타글란딘(prostaglandin)생합성 촉진작용을 동시에 나타내는 쑥추출물에 대하여 보고된 바 있다.(공개특허번호 : 1996-0021054) 또한, 일반약리, 급성독성 및 4주 반복투여에 의한 독성평가에서도 안전한 것으로 밝혔으며,(The Journal of Applied Pharmacology, 4, 354-363 (1996), The Journal of Applied Pharmacology, 4, 174-183 (1996)) 이런 추출물들은 위염, 궤양성 대장염, 크론씨병 등 염증성 장질환 치료제로도 사용되고 있다.(특허공개번호 : 10-1998-0008235, 동아제약제품, 상품명 : 스티렌)
위염 위궤양 및 위장 질환 치료제로 H2-수용체 길항제로 시메티딘(cimetidine, Ranitidine), 라모티딘(Ramotidine) 등이 개발되어 있고, H+-펌프 억제제는 오메프라졸(Omeprazole), 미소프로스톨(Misoprostol)등이 있으며 프로스타 글란딘 계열 약제로는 알프로스타딜(Alprostadil), 디노프로스톤(Dinoprostone), 디노프로스트(Dinoprost)와 카본프로스트(Carboprost)등이 있다. 인진쑥 추출물은 프로스타 글란딘 생합성 촉진작용을 나타내는 것으로 알려져 있다.(The Journal of Applied Pharmacology, 4, 111-121(1996))
인진쑥, 노루궁뎅이 버섯 균사체 및 영지버섯 균사체 추출물들이 위장질환에 생리활성을 나타낸다는 것은 이미 알려져 있다. 본 발명자들은 종래의 상기 추출물들이 위장 질환 치료제로서 위병변 억제율이 그다지 만족스러운 결과를 얻지 못함을 발견하였으며, 이들의 위병변 억제율을 증가시킬 수 있는 방안을 모색하던 중 본 발명의 버섯 추출물이 종래의 인진쑥 추출물이나 노루궁뎅이 버섯 균사체 추출물 또는 영지버섯 균사체 추출물로 이루어진 시판되고 있는 위장 치료제와 비교하여 탁월한 위병변 억제 효능을 나타내는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하게 된 것이다.
본 발명은 인진쑥 배지에서 배양된 노루궁뎅이 버섯 균사체 추출물이나 인진쑥 배지에서 배양된 영지버섯 균사체 추출물이 위염 및 위궤양 질환 치료에 탁월한 효과를 나타낸다는 것을 확인하여 이들의 새로운 용도를 제공하고자 하는 것이다.
본 발명의 목적은 위염, 위궤양 등과 같은 위장질환 치료용으로 유용한, 인진쑥배지에서 배양한 노루궁뎅이 버섯 균사체 추출물과 인진쑥 배지에서 배양한 영지버섯균사체의 추출물을 제공하고자 하는 것이다.
본 발명은 위염, 위궤양 등 위장질환의 치료에 유용한, 인진쑥 배지에서 배양(培養) 한 노루궁뎅이 버섯 균사체 추출물, 인진쑥 배지에서 배양한 영지버섯 균 사체 추출물과 생리활성을 나타내는 화합물의 구조적 유사물질에 관한 것이다.
본 발명의 버섯 추출물은 인진쑥 배지에서 배양된 노루궁뎅이 버섯 균사체 및 영지 버섯 균사체를 물, 알코올, n-헥산, 클로로포름, 염화메틸렌, 에틸아세테이트, 부탄올과 같은 유기용매로 추출하여 얻어질 수 있다.
상기 노루궁뎅이 버섯 균사체 추출물에는 에이코산(eicosane), 5-에이코센(5-eicosene), 에이코사놀(eicosanol), 에이코사노익 에시드 에틸 에스테르(eicosanoic acid ethyl ester), 헥사데카노익 에시드(hexadecanoic acid), 헥사데카노익 에시드 에틸 에스테르(hexadecanoic acid ethyl ester), 1-옥타테카놀(1-octadecanol), 옥타데카노익 에시드 에틸 에스테르(octadecanoic acid ethyl ester), 9-옥타데세노익 에시드 에틸 에스테르(9-octadecenoic acid ethyl ester), 9,12-옥타데카디노익 에시드 에틸 에스테르(9,12-octadecadienoic acid ethyl ester), 에틸 테트라 코사노에이트(ethyl tetracosanoate), 피톨(phytol), 리노렌익 에시드 에틸 에스테르(linolenic acid ethyl ester), 에이코사펜타노익 에시드(eicosapentanoic acid), 에이코사펜타노익 에시드 에틸에스테르(eicosapentanoic acid ethyl ester), 도코사 헥사에노익 에시드(docosahexaenoic acid), 디옥틸프탈레이트(di-octyl phthalate) 및 6,7-디메톡시코마린(6,7-dimethoxycoumarin)으로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 화합물이 포함되며, 인진쑥 배지를 이용한 버섯추출물내에는 포함되어 있지 않지만 활성을 나타내는 물질들의 유사구조 화합물들을 포함한다.
이하, 실시예를 들어 본 발명을 구체적으로 설명한다.
< 인진쑥 배지에서 노루궁뎅이 버섯 균사체의 배양>
건조된 인진쑥 1㎏과 물 2ℓ을 혼합한 후 110~130℃에서 2~4시간 멸균시켜서 얻어지는 고체배지에, YMPG배지에서 배양된 노루궁뎅이 버섯 균사체를 배지중량의 10중량%를 접종한 후 23~26℃에서 40~50일간 균사를 생육시킨다.
1차 생육을 시행한 후 자실체 형성 전 상기 노루궁뎅이 버섯 균사체가 형성된 고체배지를 건조시켜 인진쑥 배지에서 배양된 노루궁뎅이 버섯 균사체 배양물을 얻는다.
상기 공정에서 YMPG 배지대신에 MCM배지를 사용할 수 도 있다.
< 인진쑥 배지에서 영지버섯 균사체의 배양>
노루궁뎅이 버섯 대신에 영지버섯을 사용하는 것을 제외하고는 상기 인진쑥 배지에서 노루궁뎅이 버섯 균사체를 배양하는 방법과 동일한 방법으로 영지버섯 균사체 배양물을 얻는다.
인진쑥 배지에서 노루궁뎅이 버섯 배양물을 얻는 버섯 균사체 배양방법은 이 분야에서 이미 알려져 있다.(공개특허공보 05-0012054호)
<인진쑥 배지에서 배양된 노루궁뎅이 버섯 균사체 추출물의 제조>
노루궁뎅이 버섯 균사체를 포함하는 인진쑥 배지 건조물 1Kg에 무수에탄올 2L를 가하여 3-4일 침지후 여과하고 농축하여 무수에탄올로 추출한 추출물(추출물 A1) 34.8g을 얻었다. 또한 노루궁뎅이 버섯 균사체를 포함한 인진쑥배지 건조물 1Kg에 70% 에탄올(v/v) 2L를 가하여 3-4일 침지 후 여과하고 농축하여 70% 에탄올로 추출한 추출물(추출물 A2) 120.75g을 얻었다. 또한, 노루궁뎅이 버섯 균사체를 포함한 인진쑥배지 건조물 1Kg에 50% 에탄올(v/v) 2L를 가하여 3-4일 침지 후 여과하고 농축하여 50% 에탄올로 추출한 추출물(추출물 A3) 162.3g을 얻었으며, 노루궁뎅이 버섯 균사체를 포함한 인진쑥배지 건조물 1Kg에 30% 에탄올(v/v) 2L를 가하여 3-4일 침지 후 여과하고 농축하여 30% 에탄올로 추출한 추출물(추출물 A4) 221.6g을 얻었다. 노루궁뎅이 버섯 균사체를 포함한 인진쑥배지 건조물 1Kg에 물 2L를 가하여 3-4일 침지 후 여과하고 농축하여 물로 추출한 추출물(추출물 A5) 260g을 얻었다.
< 인진쑥 배지에서 배양된 영지버섯 균사체 추출물의 제조>
영지버섯 균사체를 포함하는 인진쑥 배지 건조물 1Kg에 무수에탄올 2L를 가 하여 3-4일 침지후 여과하고 농축하여 무수에탄올로 추출한 추출물(추출물 B1) 36.8g을 얻었다. 또한 영지버섯 균사체를 포함한 인진쑥배지 건조물 1Kg에 70% 에탄올(v/v) 2L를 가하여 3-4일 침지 후 여과하고 농축하여 70% 에탄올로 추출한 추출물(추출물 B2) 112.5g을 얻었다. 또한, 영지버섯 균사체를 포함한 인진쑥배지 건조물 1Kg에 50% 에탄올(v/v) 2L를 가하여 3-4일 침지 후 여과하고 농축하여 50% 에탄올로 추출한 추출물(추출물 B3) 142.6g을 얻었으며, 영지버섯 균사체를 포함한 인진쑥배지 건조물 1Kg에 30% 에탄올(v/v) 2L를 가하여 3-4일 침지 후 여과하고 농축하여 30% 에탄올로 추출한 추출물(추출물 B4) 225.4g을 얻었다. 영지버섯 균사체를 포함한 인진쑥배지 건조물 1Kg에 물 2L를 가하여 3-4일 침지 후 여과하고 농축하여 물로 추출한 추출물(추출물 B5) 184g을 얻었다.
<영지버섯 추출물의 제조>
영지버섯 건조물 1Kg에 무수에탄올 2L를 가하여 3-4일 침지후 여과하고 농축하여 무수에탄올로 추출한 추출물(추출물 C1) 14.8g을 얻었다. 또한 영지버섯 건조물 1Kg에 70% 에탄올(v/v) 2L를 가하여 3-4일 침지 후 여과하고 농축하여 70% 에탄올로 추출한 추출물(추출물 C2) 23.6g을 얻었다. 또한, 영지버섯 건조물 1Kg에 50% 에탄올(v/v) 2L를 가하여 3-4일 침지 후 여과하고 농축하여 50% 에탄올로 추출한 추출물(추출물 C3) 28.3g을 얻었으며, 영지버섯 건조물 1Kg에 30% 에탄올(v/v) 2L를 가하여 3-4일 침지 후 여과하고 농축하여 30% 에탄올로 추출한 추출물(추출물 C4) 27.6g을 얻었다. 영지버섯 건조물 1Kg에 물 2L를 가하여 3-4일 침지 후 여과하고 농축하여 물로 추출한 추출물(추출물 C5) 18.4g을 얻었다.
< 노루궁뎅이 버섯 추출물의 제조>
노루궁뎅이 버섯 건조물 1Kg에 무수에탄올 2L를 가하여 3-4일 침지후 여과하고 농축하여 무수에탄올로 추출한 추출물(추출물 D1) 17.5g을 얻었다. 또한 노루궁뎅이 버섯 건조물 1Kg에 70% 에탄올(v/v) 2L를 가하여 3-4일 침지 후 여과하고 농축하여 70% 에탄올로 추출한 추출물(추출물 D2) 26.3g을 얻었다. 또한, 노루궁뎅이 버섯 건조물 1Kg에 50% 에탄올(v/v) 2L를 가하여 3-4일 침지 후 여과하고 농축하여 50% 에탄올로 추출한 추출물(추출물 D3) 32.4g을 얻었으며, 노루궁뎅이 버섯 건조물 1Kg에 30% 에탄올(v/v) 2L를 가하여 3-4일 침지 후 여과하고 농축하여 30% 에탄올로 추출한 추출물(추출물 D4) 28.3g을 얻었다. 노루궁뎅이 버섯 건조물 1Kg에 물 2L를 가하여 3-4일 침지 후 여과하고 농축하여 물로 추출한 추출물(추출물 D5) 11.7g을 얻었다.
< 인진쑥 추출물의 제조>
인진쑥 건조물 1Kg에 무수에탄올 2L를 가하여 3-4일 침지 후 여과하고 농축하여 무수에탄올로 추출한 추출물(추출물 E1) 36.4g을 얻었다. 또한 인진쑥 건조물 1Kg에 70% 에탄올(v/v) 2L를 가하여 3-4일 침지 후 여과하고 농축하여 70% 에탄올로 추출한 추출물(추출물 E2) 89.7g을 얻었다. 또한, 인진쑥 건조물 1Kg에 50% 에탄올(v/v) 2L를 가하여 3-4일 침지 후 여과하고 농축하여 50% 에탄올로 추출한 추출물(추출물 E3) 134.6g을 얻었으며, 인진쑥 건조물 1Kg에 30% 에탄올(v/v) 2L를 가하여 3-4일 침지 후 여과하고 농축하여 30% 에탄올로 추출한 추출물(추출물 E4) 142.7g을 얻었다. 인진쑥 건조물 1Kg에 물 2L를 가하여 3-4일 침지 후 여과하고 농축하여 물로 추출한 추출물(추출물 E5) 235.7g을 얻었다.
인진쑥 배지에서 배양한 노루궁뎅이 버섯 균사체 추출물과 인진쑥 배지에서 배양한 영지버섯 균사체 추출물은 노루궁뎅이 버섯 추출물이나 영지버섯 추출물이나 인진쑥 추출물에 비하여 높은 위병변 억제효과를 나타낸다.
실시예 1.
<버섯 및 인진쑥 추출물의 위병변 억제효과 시험>
추출물에 따른 위병변 억제 실험은 7주령된 흰쥐(Sprague-Dawley) 수컷을 24시간동안 절식시킨 후에 투여약물을 경구투여 한다. 경구투여 약물은 각각의 추출물 70 mg/Kg의 양을 증류수 5ml에 현탁하여 제조한다. 투여약물을 투여하고 1시간후에 위병변발생시약 150 mM HCl-EtOH(60%)용액을 1.0 mL/head 경구 투여한다. 3시간 경과 후에 흰쥐를 치사시킨 후 위를 적출한다. 적출한 후에 4% 포르말린(formalin) 10mL를 위내에 주입하고 이 용액에 1시간 고정한다. 고정시킨 위를 흐르는 물에 대만부를 따라 절개하고 세척하여 궤양의 정도를 측정한다. 분획에 따른 위병변억제 실험은 헥산층, 클로로포름층, 에틸아세테이트, 부탄올과 물층의 농축물을 투여약물로 하여 위와 같은 방법으로 실시하였으며 또한, GC/MS 및 크로마토그래피 법으로 정제, 분석 된 화합물들의 위병변억제실험도 같은 방법으로 실시하였다. 위병변 억제율은 이 분야에서 일반적으로 채택하고 있는 다음식에 의해 계산하였으며, 대조군과의 유의성 검정은 Student's t-test, One-way Analysis of Variacnce(ANOVA)와 Dunnett's Test를 사용하였다.
대조근의 위손상면적 - 약물투여군의 위손상지수
위병변억제율(%) = ------------------------------------------------- × 100
대조군의 위손상지수
표 1. 추출물에 따른 위병변 억제율
추출물 실험동물 수 억제율(%)
100%에탄올추출물(A1) 10 69.0
70%에탄올추출물(A2) 10 36.0
50%에탄올추출물(A3) 10 27.0
30%에탄올추출물(A4) 10 40.0
물추출 물 (A5) 10 40.0
100%에탄올추출물(B1) 10 38.0
70%에탄올추출물(B2) 10 24.0
50%에탄올추출물(B3) 10 22.0
30%에탄올추출물(B4) 10 41.0
물추출물(B5) 10 28.0
100%에탄올추출물(C1) 10 41.0
70%에탄올추출물(C2) 10 30.0
50%에탄올추출물(C3) 10 26.0
30%에탄올추출물(C4) 10 25.0
물추출물(C5) 10 26.0
100%에탄올추출물(D1) 10 7.0
70%에탄올추출물(D2) 10 8.0
50%에탄올추출물(D3) 10 6.0
30%에탄올추출물(D4) 10 9.0
물추출물(D5) 10 6.0
100%에탄올추출물(E1) 10 8.0
70%에탄올추출물(E2) 10 9.0
50%에탄올추출물(E3) 10 7.0
30%에탄올추출물(E4) 10 5.0
물추출물(E5) 10 8.0
A1 ~ A5 : 노루궁뎅이 버섯균사체를 포함하는 인진쑥배지 추출물
B1 ~ B5 : 영지버섯 균사체를 포함하는 인진쑥배지 추출물
C1 ~ C5 : 인진쑥 추출물
D1 ~ D5: 노루궁뎅이 버섯 추출물
E1 ~ E5: 영지버섯 추출물
실시예 2.
<버섯 균사체 추출물 용제 추출분획의 위병변 억제효과 시험>
인진쑥 배지에서 배양된 노루궁뎅이 버섯 균사체의 100% 에탄올 추출물(추출물 A1) 30g에 물 200㎖을 가하고 30분간 슬러리화 한 후 여기에 헥산 200㎖을 가하고 교반하여 헥산층과 물층으로 층분리한다. 헥산층을 분리하고 여기에서 헥산을 제거, 농축하여 헥산분획물(분획물 F1) 0.94g을 얻었다.
분리된 물층에 클로로포름 200㎖을 가하고 교반하여 클로로포름층과 물층으로 층분리한다. 클로로포름층을 분리하고 여기에서 클로로포름제거, 농축하여 클로로포름분획물(분획물 F2) 12.3g을 얻었다.
다시 분리된 물층에 에틸아세테이트 200㎖을 가하고 교반하여 에틸아세테이트층과 물층으로 층분리한다. 에틸아세테이트층을 분리하고 여기에서 에틸아세테이트를 제거, 농축하여 에틸아세테이트 분획물(분획물 F3) 4.3g을 얻었다. 다시 분리된 물층에 부탄올 200㎖을 가하고 교반하여 부탄올층과 물층으로 층분리한다. 부탄올층을 분리하고 여기에서 부탄올을 제거, 농축하여 부탄올 분획물(분획물 F4) 3.4g을 얻었다.
최종적으로 분리된 물층에서 물을 제거하고 농축하여 물분획물(분획물 F5) 7.2g을 얻었다. 이들 분획물들과 현재 시판되고 있는 인진쑥 추출물을 주성분으로 하는 위염치료제(상품명 : 스티렌, 동아제약제품) 테프레논(teprenone)을 주성분으로 하는 위염치료제(상품명 : 셀벡스, 한일약품제품)의 위병변 억제율을 시험하고 그 결과를 다음 표 2에 나타냈다.
다음 표2에서 나타내는 바와 같이 본 발명에서 얻어진 분획물들이 종래의 위염치료제에 비하여 우수한 위병변 억제율을 나타내고 있다.
표 2. 용매분획 추출물에 따른 위병변 억제율
대조약품 및 분획추출물 실험동물 수 억제율(%)
스티렌 10 52.7
셀벡스 10 53.8
헥산분획물(분획물 F1) 10 87.0
클로로포름분획물(분획물 F2) 10 89.0
에틸아세테이트분획물(분획물 F3) 10 25.4
부탄올분획물(분획물 F4) 10 27.5
물층분획물(분획물 F5) 10 31.5
실시예 3.
<인진쑥 배지에서 배양한 노루궁뎅이 버섯 균사체 추출물의 조성성분시험>
도 1은 노루궁뎅이 버섯 추출물의 고속액체크로마토그래프(High performance liquid chromatograph:이하 HPLC라 한다)이고 도 2는 인진쑥추출물의 HPLC 이고, 도 3은 인진쑥 배지에서 배양한 노루궁뎅이 버섯 균사체추출물의 HPLC 이다. 도 1-3에 나타낸 바와 같이 3개의 HPLC 크로마토그램이 상이하며, 특히, 도 2 및 3에서 다른 피크들이 나타난다는 것은 배양되는 동안 인진쑥의 어떤 성분이 다른 성분으로 변화됨을 알 수 있다. 즉, 인진쑥을 배지로 사용하여 노루궁뎅이 버섯 균사를 배양하는 동안 인진쑥 성분 중 일부가 다른 성분으로 변화되는 것으로 판단된다. 또한 표 2에서 생리활성이 높은 클로로포름의 분획의 GC 크로마토그램은 그림 4와 같으며 여러 성분으로 구성되어 있음을 알았다. 이들 성분들의 구조는 GC/MS로 확인하였으며, GC/MS 분석결과는 GC의 31.01분에 peak의 메스스팩트럼을 조사한 결과 에이코산(eicosane) 화합물임을 예측하고 표준 에이코산과 메스스펙트럼을 비교한 결과, 일치함으로 이 피크의 화합물이 에이코산임을 확인하였다. GC의 25.1분에 5-에이코센(5-eicosene), 33.8분 피크는 에이코사놀(eicosanol), 23.5분에 에이코사노익 에시드 에틸 에스테르(eicosanoic acid ethyl ester), 16.1분에 헥사노익에시드(hexadecanoic acid), 16.6분에 헥사데카노익 에시드 에틸 에스테르(hexadecanoic acid ethyl ester), 28.1분에 1-옥타데카놀(1-octadecanol), 26.7분에 옥타데카노익 에틸 에스테르(octadecanoic acid ethyl ester), 19.8분에 9-옥타데카노익 에시드 에틸 에스테르(9-octadecenoic acid ethyl ester), 19.3분에 9,12-옥타데카디노익 에시드 에틸 에스테르(9,12-octadecadienoic acid ethyl ester), 29.5분에 에틸 테트라코사노에이트(ethyl tetracosanoate), 18.9분에 피톨(phytol), 19.5분에 리노렌익 에시드 에틸 에스테르(linolenic acid ethyl ester), 46.2분에 디옥틸프탈레이트(di-octyl phthalate) 및 36.5분에 6,7-디메톡시코마린(6,7-dimethoxycoumarin)임을 알 수 있었다. 도 1-3의 HPLC 조건과 도 4와 5의 GC/MS조건은 다음과 같다.
* HPLC 조건
Mobile phase : 아세토니트릴 : 완충용액 = 4 : 6
(완충용액 : 2.5% acetic acid, 5% ammonium acetate)
Flow rate : 0.5 ml/min
UV 검출: 360 nm
Column : Capcell pak C18(4.6 mm × 250 mm 5μm)
* GC/MS 조건
Column : HP-10
Carrier gas : Helium
Flow rate : 1.5 ml/min
Injector temp. : 280 ℃
Oven temp. : start at 120℃
stand for 5min
increase 10℃/min
stand for 5min
Terminal auxl temp. : 300 ℃
Dectector voltage : 1.3kV
Library : NIST. shimadzu Co.
표 1에 나타낸 바와 같이, 인진쑥 배지에서 배양한 노루궁뎅이 버섯균사 배 양물이 인진쑥 추출물보다 위염 위궤양 억제효과가 매우 우수함을 알 수 있다. 또한 추출방법에 따른 효과는 순수한 에탄올 추출물로 추출하였을 때 그 효과가 매우 우수한 것으로 나타났다. 순수한 에탄올 추출물에 물을 가하고 헥산, 클로로포름, 에틸아세테이트와 부탄올 등으로 각각 순차적으로 추출하여 각 용매별 추출물들의 농축액을 얻었다. 각각의 농축액을 인진쑥 추출물(상품명 : 동아제약 스티렌), 테프테론(Teprenone)을 주성분으로 하는 위염치료제(상품명 : 셀벡스, 한일약품제품)과 실시예 2에 따라 실험한 결과는 표 2와 같다. 표 2에 나타낸 바와 같이, 인진쑥 배양물의 헥산추출물, 클로로포름 추출물들은 비교약제들보다 매우 높은 치료효과를 나타내었다. 효과가 가장 우수한 클로로포름 농축액의 주요성분을 알아보기 위해 GC/MS(gaschromatography/mass spectrometer)를 사용하여 분석하였다. 동일한 방법으로 인진쑥을 에탄올로 추출한 후 다시 클로로포름으로 추출한 농축액을 비교 분석한 GC 크로마토그램의 결과를 도 4 및 5에 나타낸다. 인진쑥 배양물의 추출물은 차이가 있음을 알 수 있다. 이러한 결과는 인진쑥과 노루 궁뎅이 버섯 균사가 배양되는 동안 새로운 물질이 생성되며, 이러한 물질이 기존 인진쑥 성분보다 탁월한 위염, 위궤양 치료효과가 있음을 알 수 있다.
GC/MS 분석결과 GC의 31.01분에 나타난 피크(peak)의 메스스펙트럼(mass spectrum)을 조사한 결과 에이코산(eicosane) 화합물임을 예측하고 표준 에이코산과 메스스펙트럼을 비교한 결과, 일치함으로 이 피크의 화합물이 에이코산임을 확인하였다. 또한, GC의 25.1분 피크의 메스스펙트럼 분석결과 5-에이코센(5-eicosene)임을 확인하였고 같은 방법으로 GC의 33.8분 피크는 에이코사 놀(eicosanol), 23.5분에 에이코사노익 에시드 에틸 에스테르(eicosanoic acid ethyl ester), 16.1분에 헥사노익에시드(hexadecanoic acid), 16.6분에 헥사데카노익 에시드 에틸 에스테르(hexadecanoic acid ethyl ester), 28.1분에 1-옥타데카놀(1-octadecanol), 26.7분에 옥타데카노익 에틸 에스테르(octadecanoic acid ethyl ester), 19.8분에 9-옥타데카노익 에시드 에틸 에스테르(9-octadecenoic acid ethyl ester), 19.3분에 9,12-옥타데카디노익 에시드 에틸 에스테르(9,12-octadecadienoic acid ethyl ester), 29.5분에 에틸 테트라코사노에이트(ethyl tetracosanoate), 18.9분에 피톨(phytol), 19.5분에 리노레익 에시드 에틸 에스테르(linolenic acid ethyl ester), 46.2분에 디옥틸프탈레이트(di-octyl phthalate) 및 36.5분에 6,7-디메톡시코마린(6,7-dimethoxycoumarin)임을 알 수 있었다. 한편 실리카겔 관 크로마토 그래피를 이용하여 이들 중 에이코산, 5-에이코센, 에이코사놀, 에이코사노익 에시드 에틸 에스테르, 헥사데카노익 에시드, 헥사데카노익 에시드 에틸 에스테르, 1-옥타데카놀, 옥타데카노익 에시드 에틸 에스테르, 9-옥타데세노익 에시드 에틸 에스테르, 9,12-옥타데카디에노익 에시드 에틸 에스테르, 에틸 테트라코사노에이트, 피톨, 리노렌익 에시드 에틸 에스테르, 디옥틸프탈레이트와 6,7-디메톡시 코마린을 순수하게 분리 정제하여 GC/MS, IR, H1-NMR 스펙트럼을 조사하여 구조를 확인한 결과 상기 GC/MS분석결과와 일치하였다.
이들 성분 중 활성을 나타내는 물질은 단일결합이나 이중결합이 1-3개 포함된 지방산(fatty acid) 또는 지방산의 에틸 또는 메틸 에스테르 화합물과 긴사슬형 의 알콜기 구조인 것으로 확인되었다. 클로로포름 농축물의 주성분들에 대한 위염, 위궤양 치료효과를 조사한 결과는 표 3에 나타냈다. 표 3에서 보는 바와 같이 대부분의 화합물에서 치료효과를 나타내고 있으나 그 중에서 지방산의 에스테르화합물들인 옥타데카노익 에시드 에틸 에스테르, 9-옥타데세노익 에시드 에틸 에스테르, 9,12-옥타데카디노익 에시드 에틸 에스테르, 에틸 테트라코사노에이트, 피톨, 리노렌익 에시드 에틸 에스테르, 디옥틸프탈레이트와 6,7-디메톡시코마린(6,7-dimethoxycoumarin)가 탁월한 치료효과를 나타내었다. 또한, 이러한 화합물들의 혼합물들은 더 높은 위병변 치료효과가 있음을 확인할 수 있었다.
표 3. 생리활성을 나타내는 주성분들의 억제율
화합물명 실험동물 수 억제율(%)
스티렌 10 52.3
셀벡스 10 53.5
에이코사놀 (eicosanol) (A) 10 36.3
1-옥타데카놀 (1-octadecanol) (B) 10 45.2
피톨 (phytol) (C) 10 53.9
헥사데카노익 에시드 (hexadecanoic acid) (D) 10 50.9
헥사데카노익 에시드 에틸 에스테르 (hexadecanoic acid ethyl ester) (E) 10 88.3
옥타데카노익 에시드 에틸 에스테르 (octadecanoic acid ethyl ester) (F) 10 85.2
9-옥타데세노익 에시드 에틸 에스테르 (9-octadecenoic acid ethyl ester) (G) 10 90.3
9,12-옥타데카디에노익 에시드 에틸 에스테르 (9,12-octadecadienoic acid ethyl ester) (H) 10 92.5
리놀렌익 에시드 에틸 에스테르 (linolenic acid ethyl ester) (J) 10 84.5
6,7-디메톡시코마린 (6,7-dimethoxycoumarin) (K) 10 95.0
디옥틸프탈레이트 (dioctylphthalate) (L) 10 62.3
E+G 10 88.2
E+H 10 88.9
G+H 10 90.6
E+G+H 10 93.3
스티렌 : 동아제약 인진쑥 추출물 약품의 상품명
셀벡스 : 테프레논을 주성분으로 하는 한일약품의 상품명
실시예 4.
실시예 3의 구성성분 구조를 살펴보면 대부분 불포화 지방산 또는 불포화지방산 에스테르였음을 확인하였다. 따라서 인진쑥 배지를 이용한 노루궁뎅이버섯 균사체 추출물에는 없지만 유사구조인 에이코사펜타노익 에시드(eicosapentanoic acid), 에이코사펜타노익에시드 에틸 에스테르(eicosapentanoic acid ethyl ester)와 도코사 헥사에노익 에시드(docosahexaenoic acid)등을 구입하여 실시예 1과 같은 방법으로 실험하였다. 그 결과는 표 4에 나타내었다.
표 4. 활성물질 유사구조 화합물들의 억제율
화합물명 실험동물 수 억제율(%)
에이코사펜타노익 에시드 (eicosapentanoic acid) 10 72.3
에이코사펜타노익 에시드 에틸에스테르 (eicosapentanoic acid ethyl ester) 10 73.5
도코사 헥사에노익 에시드 (docosahexaenoic acid) 10 72.8
실시예 5.
본 발명의 추출물, 용매분획층과 단일물질중 가장 높은 생리활성을 나타내었던 100%에탄올 추출물, 클로로포름 분획층, 9,12-옥타데카디노익 에시드 에틸에스테르와 6,7-디메톡시코마린의 투여량을 150, 75, 65, 60, 50, 40, 30, 20과 10 mg/Kg으로 변화시켜 용량의존도를 확인하기 위하여 실시예 1과 같은 방법으로 용량 에 따른 억제율을 확인하였고, 용량의존곡선 그래프를 통하여 각각의 50% 억제율을 나타내는 용량인 ED50값을 구하여 표 5에 나타내었다.
표 5. 추출물과 단일물질들의 ED50값
Figure 112007072571294-pat00001
A3 : 노루궁뎅이 버섯균사체를 포함하는 인진쑥배지의 50% 에탄올 추출물
F2 : 노루궁뎅이 버섯균사체를 포함하는 인진쑥배지의 클로로포름 분획물
H : 9,12-옥타데카디노익 에시드 에틸 에스테르
K : 6,7-디메톡시코마린
도 1은 노루궁뎅이 버섯 추출물의 고속액체 크로마토그래프이다.
도 2는 인진쑥 추출물의 고속액체 크로마토그래프이다.
도 3은 인진쑥 배지에서 배양한 노루궁뎅이 버섯 균사체 추출물의 고속 크로마토그래프이다.
도 4는 인진쑥 배지에서 배양한 노루궁뎅이 버섯 추출물의 가스 크로마토그래프이다.
도 5는 인진쑥 추출물의 가스 크로마토그래프이다.

Claims (4)

  1. 삭제
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 피톨 (phytol), 헥사데카노익 에시드 에틸 에스테르 (hexadecanoic acid ethyl ester), 옥타데카노익 에시드 에틸 에스테르 (octadecanoic acid ethyl ester), 9-옥타데세노익 에시드 에틸 에스테르 (9-octadecenoic acid ethyl ester), 9,12-옥타데카디노익 에시드 에틸 에스테르 (9,12-octadecadienoic acid ethyl ester), 리노렌익 에시드 에틸 에스테르 (linolenic acid ethyl ester), 6,7-디메톡시쿠마린(6,7-dimethoxycoumarin), 디옥틸프탈레이트 (dioctylphthalate), 에이코사펜타노익 에시드(eicosapentanoic acid), 에이코사펜타노익에시드 에틸 에스테르(eicosapentanoic acid ethyl ester), 및 도코사 헥사에노익 에시드(docosahexaenoic acid)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상을 유효성분으로 함유하는 위염 또는 위궤양 질환 치료제.
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