CN104739889B - 一种生物双向转化菌丝体及其提取物在制备抗幽门螺杆菌药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种生物双向转化菌丝体的培养基、生物双向转化菌丝体、生物双向转化菌丝体的提取物，该生物双向转化菌丝体的培养基是在农副产品培养基中加入中药物质青蒿，该生物双向转化菌丝体是将猴头菌接入上述培养基经菌丝体转化培养所得的产物，该生物双向转化菌丝体的提取物是采用水提处理所得的产物。该生物双向转化菌丝体的提取物具有抗幽门螺杆菌作用，作用明显优于猴头菌丝体或青蒿的抗幽门螺杆菌作用，可用于制备抗幽门螺杆菌药物。

Description

一种生物双向转化菌丝体及其提取物在制备抗幽门螺杆菌药 物中的应用

技术领域

本发明属于生物制药技术领域，具体涉及一种生物双向转化“菌丝体”(正文中的引号表示对菌丝体的特指)及其提取物在制备抗幽门螺杆菌药物中的应用。

背景技术

幽门螺杆菌，Helicobacter pylori，简称Hp，是一种单极、多鞭毛、末端钝圆、螺旋形弯曲的细菌。长2.5～4.0μm，宽0.5～1.0μm。在胃粘膜上皮细胞表面常呈典型的螺旋状或弧形。在固体培养基上生长时，除典型的形态外，有时可出现杆状或圆球状。幽门螺杆菌是微需氧菌，环境氧要求5～8％，在大气或绝对厌氧环境下不能生长。(CHEMTRON)幽门螺杆菌检测试剂为目前国内使用最广泛的幽门螺杆菌检测工具。

1994年，世界卫生组织将幽门螺杆菌列为第一类高危致恶变因子，幽门螺杆菌具有极强的传染性，人是幽门螺杆菌的唯一传染源。家庭成员中的感染者一经确诊，就必须主动接受正规的抗菌治疗，彻底清除传染源以达到防治目的，只有先查出是否感染幽门螺杆菌，再进行有效的根治，才能彻底治愈反复发作的老胃病并防止恶变。美国国立卫生研究院(NIH)提出大多数常见的胃炎疾病均由幽门螺杆菌所造成，在治疗过程应加入抗生素。2005年10月3日，瑞典卡罗林斯卡研究院宣布，2005年度诺贝尔生理学或医学奖授予这两位科学家以表彰他们发现了幽门螺杆菌以及这种细菌在胃炎和胃溃疡等疾病中的作用。

青蒿(Artemisia carvifolia)一年生草本。茎直立，上部多分枝，具纵棱线。叶子互生，茎中部的叶子二回羽状分裂，线形小裂片。夏季开花，头状花序半球形，多数，成圆锥状，花管状，外面为雌花，内层为两性花。含挥发油，也含艾蒿碱(abrotanine,C21H22N2O)及苦味素等。入药，但非中药“青蒿”之正品。据报道，本种有清热、凉血、退蒸、解暑、祛风、止痒之效，作阴虚潮热的退热剂，也止盗汗、中暑等，但本种不含“青蒿素”，无抗疟作用。《本草纲目》等古本草书记述的“青蒿花色淡青，淡黄色”者可能是本种；《救荒本草》与《野菜博录》所载“邪蒿”亦为本种。^[1]

中药青蒿，为菊科植物黄蒿Artemisia annua L.的干燥地上部分的地上部分。花蕾期采收，割取地上部分，切碎，晒干。古名“菣”(qìn)。清热解暑，除蒸，截疟。用于暑邪发热，阴虚发热，夜热早凉，骨蒸劳热，疟疾寒热，湿热黄疸。是一种廉价的抗疟疾药。青蒿茎圆柱形，上部分枝，长30至80厘米，直径0.2至0.6厘米；表面黄绿色或棕黄色，具纵棱线；质略硬，易折断，断面中部有髓。叶互生，暗绿色或棕绿色，卷缩易碎，完整者呈三回羽状深裂，小裂片矩圆形或长椭圆形，两面被短毛。气香特异，味微苦。以色绿，叶多，香气浓者为佳。

功能主治：清透虚热，凉血除蒸，解暑，截疟。用于暑邪发热，阴虚发热，夜热早凉，骨蒸劳热，疟疾寒热，湿热黄疸。该品苦寒清热，辛香透散，善使阴分伏热透达外散，为阴虚发热要药，此外青蒿兼有解暑，截虐之功。解暑可治外感暑热，发热烦渴；截虐主治疟疾引起的寒热往来；凉血退虚热，善治阴虚发热，骨蒸劳热，及温热病后期，热入阴分，夜热早凉者。

猴头菌丝体中的活性物质最重要的是多糖及糖蛋白，目前国内外对猴头多糖的研究表明，猴头菌多糖具有多种生物活性和药理作用，能增强巨噬细胞的吞噬功能，促进溶血素的形成，抗白细胞下降，降血糖、抗幽门螺杆菌、抗血栓、抗突变和抗衰老等。因此，猴头菌多糖备受人们关注，成为近年来分子生物学、医药、食品科学等领域研究和开发应用的热点。《湖南省中药材标准》2009年版，122～123页记载了猴头菌培养物，本发明所述的猴头菌丝体是该标准记载的猴头菌培养物。

生物双向转化“菌丝体”是指利用菌丝体(包括真菌)的代谢功能，使中药分解的生物化学反应过程。借鉴中医药组方思想，将单味中药、具有类似或协同作用的中药作为部分培养基进行菌丝体转化，目的是产生新化合物、增强功效或者降低单一药物不良作用。同时中药的特殊有效成分诱变菌丝体，促进菌丝体新陈代谢，促进菌丝体生物转化。生物双向转化技术在中药领域的应用,能够显著提升传统中药的临床疗效、发现传统中药的临床新价值、显著提高中药材资源的利用率、批量创新中药,从而促进中药的产业化发展。

据文献记载，猴头菌丝体具有抗幽门螺杆菌作用，但作用并不明显，而青蒿主要用于杀菌抗痢疾，未有报导抗幽门螺杆菌。现有报道中，没有使用中药作为猴头菌的培养基，更没有使用青蒿作为培养基来进行生物双向转化文献报道。

发明内容

本发明旨在克服现有技术的不足，提供一种生物双向转化“菌丝体”及其提取物。

所述一种生物双向转化“菌丝体”的培养基包括如下重量份的组分：

麦麸65～75；玉米面15～25；谷糠5～15；青蒿25～150；水68.75～150。

优选地，所述的菌丝体培养基包括如下重量份的组分：

麦麸70；玉米面20；谷糠10；青蒿25～150；水68.75～150。

更优选地，所述的菌丝体培养基包括如下重量份的组分：

麦麸70；玉米面20；谷糠10；青蒿66.67；水100。

所述的一种生物双向转化“菌丝体”是将猴头菌接种至上述培养基中，在20～27℃条件下菌丝体转化30～40天，取出，烘干，即得。

所述这种生物双向转化“菌丝体”的提取物通过如下步骤制得：

(1)将上述生物双向转化菌丝体进行第一次50-90％乙醇溶液提取，提取1～2小时，然后进行第二次50-90％乙醇溶液提取，提取1～2小时；两次提取中，50-90％乙醇的重量为生物双向转化菌丝体重量的4～8倍。

(2)提取液过滤、合并，40-60℃下减压浓缩回收乙醇，得浓缩液，每次用浓缩液同体积的乙酸乙酯萃取，萃取2-4次，合并萃取液，40-60℃下减压浓缩，浓缩液在不超过60℃条件下真空干燥或冷冻干燥。

所述生物双向转化“菌丝体”提取物能用于制备抗幽门螺杆菌药物。

本发明所述猴头菌为猴头菌科真菌猴头菌Hericium erinaceum(Bull.ex Fr.)Pers.，是市售的商业化的菌种；本发明所述猴头菌丝体是《湖南省中药材标准》2009年版，122～123页记载的猴头菌培养物，猴头菌丝体为猴头菌科真菌猴头菌Hericium erinaceum(Bull.ex Fr.)Pers.的菌丝体与其附生固体培养基(培养基均为农副产品)的干燥混合物；本发明所述的生物双向转化“菌丝体”为猴头菌科真菌猴头菌Hericium erinaceum(Bull.ex Fr.)Pers.的菌丝体与其附生含有青蒿成份固体培养基的干燥混合物。

猴头菌丝体具有较弱抗幽门螺杆菌作用，青蒿未有明显的抗幽门螺杆菌效果。猴头菌是一种药用真菌，能很好地吸收培养基中营养，彻底转化培养基，产生新的活性物质及代谢物，为此，本发明将青蒿加入到培养基中，猴头菌对青蒿进行生物双向转化，得到新的菌丝体(即：生物双向转化“菌丝体”)，本发明对所得的生物双向转化“菌丝体”提取物进行了体外抗幽门螺旋杆菌试验，从图1至图3和表1至表2的结果可知,该生物双向转化“菌丝体”提取物能显著抑制幽门螺杆菌，具有显著的抗幽门螺杆菌作用，因此可应用于制备抗幽门螺杆菌药物。为了不影响有关活性物质，本发明采用了低温干燥手段(60℃条件下真空干燥或冷冻干燥)。

附图说明

图1为实施例5中1、2、3、4、5号提取物血琼脂中抗幽门螺杆菌效果图；

图2为实施例5中6、7、8、9、10号提取物血琼脂中抗幽门螺杆菌效果图；

图3为实施例5中7、8、11号提取物及阳性药物阿莫西林血琼脂中抗幽门螺杆菌效果图。

具体实施方式

实施例1

一种生物双向转化“菌丝体”提取物，其制备方法包括如下步骤：

(1)取农副产品麦麸650g、玉米面150g、谷糠50g，以及中药材青蒿粗粉(青蒿)250g，混匀，加入687.5g水拌匀，既得菌丝体培养基，再装瓶、灭菌，接入猴头菌，在20～27℃条件下菌丝体转化培养30～40天，取出生物双向转化“菌丝体”，烘干，即得生物双向转化“菌丝体”；

(2)将上述生物双向转化菌丝体进行第一次50％乙醇溶液提取，提取1小时，然后进行第二次50％乙醇溶液提取，提取1小时；两次提取中，50％乙醇的重量为生物双向转化菌丝体重量的4倍。

(3)提取液过滤、合并，40℃下减压浓缩回收乙醇，得浓缩液，每次用浓缩液同体积的乙酸乙酯萃取，萃取2次，合并萃取液，40℃下减压浓缩，浓缩液在不超过60℃条件下真空干燥或冷冻干燥。

实施例2

一种生物双向转化“菌丝体”提取物，其制备方法包括如下步骤：

(1)取农副产品麦麸700g、玉米面200g、谷糠100g，以及中药材青蒿粗粉(青蒿)666.7g，混匀，加入1000g水拌匀，既得菌丝体培养基，再装瓶、灭菌，接入猴头菌，在20～27℃条件下菌丝体转化培养30～40天，取出生物双向转化“菌丝体”，烘干，即得生物双向转化“菌丝体”；

(2)将上述生物双向转化菌丝体进行第一次75％乙醇溶液提取，提取1.5小时，然后进行第二次75％乙醇溶液提取，提取1.5小时；两次提取中，75％乙醇的重量为生物双向转化菌丝体重量的6倍。

(3)提取液过滤、合并，50℃下减压浓缩回收乙醇，得浓缩液，每次用浓缩液同体积的乙酸乙酯萃取，萃取3次，合并萃取液，50℃下减压浓缩，浓缩液在不超过60℃条件下真空干燥或冷冻干燥。

实施例3

一种生物双向转化“菌丝体”提取物，其制备方法包括如下步骤：

(1)取农副产品麦麸750g、玉米面250g、谷糠150g，以及中药材青蒿粗粉(青蒿)1500g，混匀，加入1500g水拌匀，既得菌丝体培养基，再装瓶、灭菌，接入猴头菌，在20～27℃条件下菌丝体转化培养30～40天，取出生物双向转化“菌丝体”，烘干，即得生物双向转化“菌丝体”；

(2)将上述生物双向转化菌丝体进行第一次90％乙醇溶液提取，提取2小时，然后进行第二次90％乙醇溶液提取，提取2小时；两次提取中，90％乙醇的重量为生物双向转化菌丝体重量的8倍。

(3)提取液过滤、合并，60℃下减压浓缩回收乙醇，得浓缩液，每次用浓缩液同体积的乙酸乙酯萃取，萃取4次，合并萃取液，60℃下减压浓缩，浓缩液在不超过60℃条件下真空干燥或冷冻干燥。

实施例4 HTJ-QH“菌丝体”提取物抗幽门螺杆菌试验

(一)材料

1.实验药处理方法

取本发明生物双向转化“菌丝体”(代号为：HTJ-QH)200g，加入6倍量的蒸馏水于2000ml圆底烧瓶，用玻璃棒搅浑均匀(无干燥粉末沾壁)，加入小玻璃珠防止暴沸，60℃真空回流提取2h后，冷却，倾倒上清液，再加6倍量单蒸水煮沸回流提取2h。将两次液体均匀装入4个离心瓶中，3000rpm离心10min。离心所得上清液倒入5L旋蒸瓶，50℃下减压浓缩，得浓缩液于100ml锥形瓶4℃保存。

取2.0kgD101大孔吸附树脂以95％乙醇浸泡24h，填入6cm*60cm规格的层析分离柱，以蒸馏水洗尽乙醇。将HTJ-QH浓缩液缓慢加入柱中，得柱高34cm，柱体积约为1000ml。依次以2L水、1L50％乙醇、1L100％乙醇梯度洗脱，分别收集洗脱液，分别在40℃下减压浓缩，分别冷冻干燥，样品依次标注为HTJ-QH-1、HTJ-QH-2、HTJ-QH-3。

取本发明生物双向转化“菌丝体”(代号为：HTJ-QH)200g，加入6倍量的75％于乙醇溶液2000ml圆底烧瓶，用玻璃棒搅浑均匀(无干燥粉末沾壁)，加入小玻璃珠防止暴沸，50℃真空回流提取回流提取1.5h后，冷却，倾倒上清液，再加6倍量75％乙醇溶液煮沸回流提取1.5h，50℃下减压浓缩，加入浓缩液同体积的石油醚(沸程30-60)萃取5min，待溶液稳定分层后倒出上层萃取液，萃取操作进行3次，分别用3个1000ml旋蒸瓶合并3次萃取液，50℃下减压浓缩，浓缩液冷冻干燥，干燥样品标注为HTJ-QH-4。同样，取HTJ-QH样品200g，75％乙醇提取浓缩，浓缩液用同体积的正丁醇萃取，减压浓缩，冷冻干燥，干燥样品标注为HTJ-QH-5。同样，取HTJ-QH样品200g，75％乙醇提取浓缩，浓缩液加同体积的蒸馏水，搅拌，离心，取上清液减压浓缩，冷冻干燥，干燥样品标注为HTJ-QH-6。

同样，按上述实施例1、实施例2、实施例3分别处理的样品，分别标注为HTJ-QH-7、HTJ-QH-8、HTJ-QH-9。同样，分别取猴头菌丝体及青蒿，75％乙醇提取浓缩，乙酸乙酯萃取，萃取液浓缩，冷冻干燥，分别标注为HTJ、QH。

2.含药纸片制备 将直径6mm大小的无菌纸片于无菌小瓶中(10片/瓶)，加入0.5mL药液(各药液浓度均为200mg/ml)，37℃干燥，制备成含药纸片(10mg/片)。

3.阳性对照药 阿莫西林胶囊规格0.25g/粒，哈药集团制药总厂产品，产品编号：A1420000094，国药准字号H23020932，生产日期20140926，批号0014092622。克拉霉素分散片规格0.25g/片，国药准字991H99013，生产企业：南京瑞尔医药有限公司产品，生产日期20140617，批号140203。甲硝唑片规格0.2/片，康美药业股份有限公司产品，国药准字号H44024120，生产日期20140116，批号140116-2。实验时上述三种阳性对照药用无菌蒸馏水溶解至10μg/mL，隔水加热60℃30min(甲硝唑为80℃、加热时间25分钟)。

4.选择性抗生素 盐酸万古霉素100mg/瓶，生产批号：0421，BIOSHAPRP公司产品。多粘菌素B 100mg/瓶，生产批号：0699，BIOSHAPRP公司产品。可溶性两性霉素B 25mg/瓶，生产批号：E824，XIASI BIO公司产品。三甲氧苄氨嘧啶1g/瓶，生产批号：09221，RESEARCHORGANICS公司产品。分析天平准确称取万古霉素0.0161g，两性霉素B O.0163g，多粘菌素B0.0007g，3种抗生素在紫外线下照射1h，均匀混合；准确称取三甲氧苄胺嘧啶(TMP)0.008g，溶于l0ml蒸馏水，并加乳酸一滴，煮沸10min后无菌加入以上混合抗生素中，用灭菌蒸馏水加至40ml，混匀，4℃冰储备用。

5.H.pylori培养基 (1)改良空肠弯曲菌琼脂培养基(上海疾病控制中心批号2014020910)实验时称取4.3g，加蒸馏水100ml高压灭菌后，将培基置恒温水域箱恒温至56℃时加入10％的新鲜绵羊血(购自北京鼎国生物公司)和抗生素混合液(选择性抗生素)。

(2)布氏肉汤杭州天和微生物试剂有限公司产品，批号：2013092103称取布氏肉汤粉2.8g溶于蒸馏水20ml中，高压灭菌(温度:121℃，30min)冷却至55℃，加新生小牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司，生产批号：130422)2ml(10％)，10％葡萄糖1ml(5％)，选择抗生素0.lml(0.5％)，淀粉0.1g(0.5％)。

6.菌株 幽门螺杆菌(H.pylori)国际标准株SS1(sydney strain 1),含空泡毒素和细胞毒素相关蛋白(CagA)由湖南中医药大学微生物室提供。(1)H.pylori的活化取0.1ml液氮保存的H.pylori，接种于Skirrow琼脂培养基，37℃微需氧环境(85％N₂,10％CO₂,5％O₂)培养。(2)实验时选用对数生长期细菌，生物镜下计数细菌含量，然后通过麦氏比浊法，用无菌生理盐水将Hp菌悬液调整浓度为l×l0⁸CFU/m1，供实验用。

(二)方法

1.琼脂扩散法(纸片法) 取1.0×10⁸/ml对数生长期菌悬液0.1mL，用无菌T形玻棒均匀涂布血琼脂平皿表面。用无菌镊子分别挟取含有不同药物的滤纸片，贴在已接种细菌的血琼脂平板的表面，每药做5次，37℃微需氧环境(85％N₂,10％CO₂,5％O₂)培养72h，观测抑菌圈有无及大小。

2.MIC测定 采用二倍试管稀释法。在灭菌试管中每管分别H.pylori液体培养基，对药物进行连续二倍稀释：200.00、100.00、50.00、25.00、12.5、6.25、3.13、1.57μg/mL，分别加入1×10⁵CFU/ml各菌悬液0.1ml/管，37℃微需氧环境(85％N₂,10％CO₂,5％O₂)培养72h，观察各药物最低抑菌浓度(minimal inhibitory concentration,MIC)。实验中同时设置加药不加菌的药物对照、加菌不加药的菌株对照及不加药不加菌的培养基对照。

3.MBC测定 采用点试法将各药物检测出的MIC及MIC以上的浓度药菌培养物，分别用接种环接种于血琼脂表面，37℃微需氧环境(85％N₂,10％CO₂,5％O₂)培养72h，观测有无细菌生长，无菌生长的浓度则判断为最低杀菌浓度(minimum bactericidalconcentration，MBC)。

(三)试验结果

1.琼脂平板中各药物的抗H.pylor作用 见表1

表1HTJ-QH“菌丝体”提取物抗幽门螺杆菌作用n＝5单位mm

注：各含药纸片含药浓度10mg/片

表1结果提示各药物抗菌作用(方差分析)差别有统计学意义p＜0.05。从上述结果可以看出HTJ-QH-8药物对幽门螺杆菌的抑制作用最强，其次为HTJ-QH-9、HTJ-QH-7。

2.液体培养基中药物对H.pylori的抑杀作用(见表2)

表2HTJ-QH“菌丝体”提取物对幽门螺杆菌的MIC单位μg/mL

序号	编号	MIC	MBC	序号	编号	MIC	MBC
								1	HTJ-QH-1	——	——	7	HTJ-QH-7	50.00	100.00
2	HTJ-QH-2	200.00	200.00	8	HTJ-QH-8	12.50	50.00
								3	HTJ-QH-3	200.00	200.00	9	HTJ-QH-9	25.00	100.00
4	HTJ-QH-4	200.00	200.00	10	HTJ	200.00	200.00
								5	HTJ-QH-5	100.00	200.00	11	QH	250.00	250.00
6	HTJ-QH-6	200.00	200.00

表2可以看出各提取物除1号外，各药物均有一定的抑杀幽门螺杆菌作用，特别是8号提取物HTJ-QH-8对幽门螺杆菌的MIC为12.50μg/mL，MBC为50.00μg/mL。

Claims (6)

1.一种抗幽门螺杆菌生物双向转化猴头菌菌丝体的培养基，其特征在于，所述培养基由如下重量份的组分组成：

麦麸65～75；玉米面15～25；谷糠5～15；青蒿25～150；水68.75～150。

2.如权利要求1所述抗幽门螺杆菌生物双向转化猴头菌菌丝体的培养基，其特征在于，所述培养基由如下重量份的组分组成：

麦麸70；玉米面20；谷糠10；青蒿25～150；水68.75～150。

3.如权利要求2所述抗幽门螺杆菌生物双向转化猴头菌菌丝体的培养基，其特征在于，所述培养基由如下重量份的组分组成：

麦麸70；玉米面20；谷糠10；青蒿66.67；水100。

4.一种生物双向转化菌丝体，其特征在于，所述生物双向转化菌丝体是将猴头菌接种至权利要求1至3任一项所述的培养基中，在20～27℃条件下菌丝体转化培养30～40天，取出生物双向转化菌丝体，烘干，即得。

5.一种生物双向转化菌丝体的提取物，其特征在于，所述提取物通过如下步骤制得：

（1）将权利要求4所述的生物双向转化菌丝体进行第一次50-90%乙醇溶液提取，提取1～2小时，然后进行第二次50-90%乙醇溶液提取，提取1～2小时；两次提取中，50-90%乙醇的重量为生物双向转化菌丝体重量的4～8倍；

（2）提取液过滤、合并，40-60℃下减压浓缩回收乙醇，得浓缩液，每次用浓缩液同体积的乙酸乙酯萃取，萃取2-4次，合并萃取液，40-60℃下减压浓缩，浓缩液在不超过60℃条件下真空干燥或冷冻干燥。

6.如权利要求5所述生物双向转化菌丝体的提取物在制备抗幽门螺杆菌药物中的应用。