CN105146509B - 一种利用石斛叶生产益生菌石斛酵素的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种利用石斛叶生产益生菌石斛酵素的方法，属于生物医药技术领域。该工艺包括石斛叶的收集和除杂、石斛叶的研磨、一次发酵、菊芋粉的选择、二次发酵基质的配制、二次发酵菌种的驯化与制备、接种益生菌发酵母种并二次发酵处理、复配处理和益生元的添加、灌装及包装九大步骤。本发明充分利用了废弃的石斛叶子的药理功能，复合益生菌对消化道微生态环境的修补功能，益生元对消化道益生菌群的促进功能，三方面协同作用对人体生理功能进行综合调节。本发明的产品能促进消化道微生态平衡，明显改善消化功能，调节机体代谢，调节免疫功能，同时具有提高运动耐力、加速消除疲劳、抗氧化保护肝脏的保健效果。

Description

一种利用石斛叶生产益生菌石斛酵素的方法
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种新型益生菌石斛酵素及其生产工艺。
背景技术
石斛为兰科石斛属多年生附生草本植物，是传统的名贵中药材。石斛资源紧缺，价格昂贵，目前常以茎入药，其“叶”大量在采收时舍弃。在传统功效和现代药理学验证的基础上，充分开发利用茎以外的其他部位（叶），可有效利用资源，并创造更多具有药理功效的产品，满足不同消费人群的需求。经过含量分析检测发现，石斛茎、叶具有类似成分，有较高相似度，可考虑将石斛叶作为药用部位，并且，其“叶”也含有独特的成分，以黄酮类和各类挥发油为主，有较高的药用价值，适用于益生菌发酵产品的开发及综合利用。
中药多以植物药为主，其有效成分多存在于细胞的胞浆中，而植物细胞的细胞壁是由纤维素、半纤维素等构成的，其结构致密，因而不易被提取。通过微生物发酵处理后，微生物在代谢过程中产生的纤维素酶、果胶酶等多种胞外酶进入培养基，从而引起中药材细胞破裂，其有效成分得以暴露出来，从而极大增加有效成分的利用率。
酵素技术指多菌种复合型微生物群体发酵的技术，是一门新型的生物技术。常见的水果、蔬菜、糙米、菇类、药食同源中药等都可以作为酵素发酵的原料。但是传统酵素产品发酵周期长，其有效成分的中益生菌、益生元含量偏低，难以最大化的发挥酵素产品的功效。
发明内容
为了变废为宝，充分利用石斛采收中废弃不用的“叶”。本发明将以石斛叶为主要发酵基质，采用二次发酵方式，第一次发酵以石斛叶的原浆为发酵基质，接种纯种酵母菌，主要是促进石斛叶中药理成分的溶出。第二次发酵基质在第一次发酵液的基础上复配菊芋，添加多种纯种益生菌控温发酵，利用菊芋中富含的益生元成促进益生菌的大量增殖，大大缩短发酵周期，并且在终产物中补充益生元，开发出一种石斛叶的益生菌类酵素产品。
本发明采用的技术方案如下：
一种利用石斛叶生产益生菌石斛酵素的方法，包括如下步骤：
收集新鲜石斛叶子，去除杂质，洗净，荫干，将石斛叶子研磨至浆状，得到石斛叶的原浆；
将纯种酵母菌菌种按5～7:100的重量比加入到制备的石斛叶原浆中进行发酵，于28～36℃下，有氧发酵23～25h，之后厌氧发酵47～50h，得到一次发酵液；
向一次发酵液中加入菊芋粉使菊芋粉的浓度达到150～200g/L，之后经巴氏消毒，得到二次发酵基质；
采用少量二次发酵基质分别对植物乳杆菌、嗜热链球菌和双歧杆菌驯化，得到驯化植物乳杆菌菌种、驯化嗜热链球菌菌种和驯化双歧杆菌菌种；
向三等份二次发酵基质中分别加入驯化植物乳杆菌菌种、驯化嗜热链球菌菌种和驯化双歧杆菌菌种，然后置于36～42℃下发酵6～15h，将发酵后的三种发酵液混合均匀，再向其中添加质量百分含量为1％～9％的低聚果糖，混合均匀后，在无菌条件下进行灌装包装，得到成品。
进一步，优选的是所述的新型益生菌石斛酵素的生产工艺，包括如下步骤：
步骤(1)，石斛叶的除杂、洗净和荫干：
于石斛采收时收集丢弃的石斛叶子，进行筛选以除去霉变、虫蛀、腐烂的叶子，并用清水洗净，之后放到阴凉处荫干。
步骤(2)，石斛叶的研磨：
将步骤(1)得到的石斛叶子研磨至浆状，得到石斛叶的原浆；
步骤(3)，一次发酵：
取步骤(2)得到的石斛叶的原浆为发酵基质，将纯种的酵母菌菌种与发酵基质按5～7:100的重量配比混合均匀，置于28～36℃下，先通入无菌空气有氧发酵23～25h，之后厌氧发酵47～50h，停止发酵，得到一次发酵液；
步骤(4)，菊芋粉的选择：
选择市场上出售的优质菊芋粉为原料，要求无霉烂变质；
步骤(5)，二次发酵基质的配制：
将步骤(3)得到的一次发酵液与步骤(4)选择的菊芋粉混合，使菊芋粉的浓度达到150～200g/L，之后经巴氏消毒，得到二次发酵基质；
步骤(6)，二次发酵菌种的驯化与制备：
分别取少量3份步骤(5)得到的二次发酵基质作为驯化基质，分别取植物乳杆菌、嗜热链球菌、双歧杆菌三种益生菌为发酵菌种，将每一种发酵菌种与1 份发酵基质按99～101亿CFU发酵菌种/千克发酵基质的比例充分搅拌混合，置于40～43℃下培养8～12h，分别得到驯化植物乳杆菌菌种、驯化嗜热链球菌菌种和驯化双歧杆菌菌种；
步骤(7)，接种益生菌发酵母种并二次发酵处理：
取三等份步骤(5)得到的二次发酵基质，分别与步骤(6)得到的驯化植物乳杆菌菌种、驯化嗜热链球菌菌种和驯化双歧杆菌菌种按照100:3～5的重量配比混合均匀，置于36～42℃下发酵6～15h，分别得到驯化植物乳杆菌发酵熟料、驯化嗜热链球菌发酵熟料和驯化双歧杆菌发酵熟料；
步骤(8)，复配处理：
将步骤(7)得到的驯化植物乳杆菌发酵熟料、驯化嗜热链球菌发酵熟料和驯化双歧杆菌发酵熟料均匀混合，即得到石斛叶酵素半成品；
步骤(9)，益生元的添加、灌装及包装：
在步骤(8)中所获得的石斛叶酵素半成品里添加质量百分含量为1％～9％的低聚果糖，混合均匀后，在无菌条件下进行灌装包装，得到成品。
进一步，优选的是所述的新型益生菌石斛酵素的生产工艺，包括如下步骤：
步骤(1)，石斛叶的除杂、洗净和荫干：
于石斛采收时收集丢弃的石斛叶子，进行筛选以除去霉变、虫蛀、腐烂的叶子，并用清水洗净，之后放到阴凉处荫干。
步骤(2)，石斛叶的研磨：
将步骤(1)得到的石斛叶子研磨至浆状，得到石斛叶的原浆；
步骤(3)，一次发酵：
取步骤(2)得到的石斛叶的原浆为发酵基质，将纯种的酵母菌菌种与发酵基质按5～7:100的重量配比混合均匀，置于28～36℃下，先通入无菌空气有氧发酵24h，之后厌氧发酵48h，停止发酵，得到一次发酵液；
步骤(4)，菊芋粉的选择：
选择市场上出售的优质菊芋粉为原料，要求无霉烂变质；
步骤(5)，二次发酵基质的配制：
将步骤(3)得到的一次发酵液与步骤(4)选择的菊芋粉混合，使菊芋粉的浓度达到150～200g/L，之后经巴氏消毒，得到二次发酵基质；
步骤(6)，二次发酵菌种的驯化与制备：
分别取少量3份步骤(5)得到的二次发酵基质作为驯化基质，分别取植物乳杆菌、嗜热链球菌、双歧杆菌三种益生菌为发酵菌种，将每一种发酵菌种与1 份发酵基质按100亿CFU发酵菌种/千克发酵基质的比例充分搅拌混合，置于4 0～43℃下培养8～12h，分别得到驯化植物乳杆菌菌种、驯化嗜热链球菌菌种和驯化双歧杆菌菌种；
步骤(7)，接种益生菌发酵母种并二次发酵处理：
取三等份步骤(5)得到的二次发酵基质，分别与步骤(6)得到的驯化植物乳杆菌菌种、驯化嗜热链球菌菌种和驯化双歧杆菌菌种按照100:3～5的重量配比混合均匀，置于36～42℃下发酵6～15h，分别得到驯化植物乳杆菌发酵熟料、驯化嗜热链球菌发酵熟料和驯化双歧杆菌发酵熟料；
步骤(8)，复配处理：
将步骤(7)得到的驯化植物乳杆菌发酵熟料、驯化嗜热链球菌发酵熟料和驯化双歧杆菌发酵熟料均匀混合，即得到石斛叶酵素半成品；
步骤(9)，益生元的添加、灌装及包装：
在步骤(8)中所获得的石斛叶酵素半成品里添加质量百分含量为1％～9％的低聚果糖，混合均匀后，在无菌条件下进行灌装包装，得到成品。
本发明与现有技术相比，其有益效果为：
本发明采用纯种益生菌多次发酵形式，第一次发酵以石斛叶的原浆为发酵基质，纯种酵母菌为发酵菌种。酵母细胞壁裂解后可产生多种酶类，活的酵母细胞也可胞外分泌多种酶，如蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶及植酸酶等，能够分解植物细胞壁促进石斛叶子的原生质体内有效药理成分的渗出；酵母菌在无氧条件下生成的乙醇，也有利于石斛叶中醇溶性药理成分的溶出，以提高石斛叶药理成分的利用率。
第二次发酵的发酵基质是在第一次发酵液的基础上添加菊芋粉，菊芋块茎中含大量碳水化合物，约占鲜质量的18％～20％，果聚糖含量占碳水化合物的8 0％左右，也称为菊糖或者菊粉，是促进益生菌增殖的极好的益生元，这将大大提高发酵终产物中的益生菌的数量。
二次发酵基质配好后，将二次发酵基质分为3份，分别接种驯化好的植物乳杆菌、双歧杆菌和嗜热链球菌，分别发酵，之后将发酵产物混合，以期获得高益生菌含量的酵素产品。最后在发酵产物中添加适量的低聚果糖，作为益生元。这样，本发明就充分利用了废弃的石斛叶子对有机体生理调节的药理功能，益生菌对消化道微生态环境的修补功能，益生元对消化道益生菌群的促进功能，三方面作用对人体生理机能进行调节。
本发明的产品能促进消化道微生态平衡，明显改善消化功能，调节机体代谢，增强免疫能力，同时具有提高运动耐力、加速消除疲劳、抗氧化保护肝脏的保健效果
附图说明
图1是本发明新型益生菌石斛酵素的生产工艺流程框图；
图2为正常组、生理盐水组、联苯双酯组和益生菌石斛酵素组的肝脏组织切片光镜下观察图；其中，a为正常组，b为生理盐水组，c为联苯双酯组，d为益生菌石斛酵素组。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的详细描述。
本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过购买获得的常规产品。
实施例1
一种新型益生菌石斛酵素的生产工艺，包括如下步骤：
步骤(1)，石斛叶的除杂、洗净和荫干：
于石斛采收时收集丢弃的石斛叶，进行筛选以除去霉变、虫蛀、腐烂的叶子，并用清水洗净，之后放到阴凉处荫干。
步骤(2)，石斛叶的研磨：
将步骤(1)得到的石斛叶子研磨至浆状，得到石斛叶的原浆；
步骤(3)，一次发酵：
取步骤(2)得到的石斛叶的原浆为发酵基质，将纯种的酵母菌种与发酵基质按5:100的重量配比混合均匀，置于28℃下，先通入无菌空气有氧发酵23h，之后厌氧发酵47h，停止发酵，得到一次发酵液；
步骤(4)，菊芋粉的选择：
选择市场上出售的优质菊芋粉为原料，要求无霉烂变质；
步骤(5)，二次发酵基质的配制：
将步骤(3)得到的一次发酵液与步骤(4)选择的菊芋粉混合，使菊芋粉的浓度达到150g/L，之后经巴氏消毒，得到二次发酵基质；
步骤(6)，二次发酵菌种的驯化与制备：
分别取少量3份步骤(5)得到的二次发酵液作为发酵基质，分别取植物乳杆菌、嗜热链球菌、双歧杆菌三种益生菌为发酵菌种，将每一种发酵菌种与1 份发酵基质按99亿CFU发酵菌种/千克发酵基质的比例充分搅拌混合，置于4 0℃下培养10h，分别得到驯化植物乳杆菌菌种、驯化嗜热链球菌菌种和驯化双歧杆菌菌种；
步骤(7)，接种益生菌发酵母种并二次发酵处理：
取三等份步骤(5)得到的二次发酵基质，分别与步骤(6)得到的驯化植物乳杆菌菌种、驯化嗜热链球菌菌种和驯化双歧杆菌菌种按照100:3的重量配比混合均匀，置于36℃下发酵15h，分别得到驯化植物乳杆菌发酵熟料、驯化嗜热链球菌发酵熟料和驯化双歧杆菌发酵熟料；
步骤(8)，复配处理：
将步骤(7)得到的驯化植物乳杆菌发酵熟料、驯化嗜热链球菌发酵熟料和驯化双歧杆菌发酵熟料均匀混合，即得到石斛酵素半成品；
步骤(9)，益生元的添加、灌装及包装：
在步骤(8)中所获得的石斛酵素半成品里添加质量百分含量为1％的低聚果糖，混合均匀后，在无菌条件下进行灌装包装，得到成品。
实施例2
一种新型益生菌石斛酵素的生产工艺，包括如下步骤：
步骤(1)，石斛叶的除杂、洗净和荫干：
于石斛采收时收集丢弃的石斛叶子，进行筛选以除去霉变、虫蛀、腐烂的叶子，并用清水洗净，之后放到阴凉处荫干。
步骤(2)，石斛叶的研磨：
将步骤(1)得到的石斛叶研磨至浆状，得到石斛叶的原浆；
步骤(3)，一次发酵：取步骤(2)得到的石斛叶的原浆为发酵基质，将纯种的酵母菌菌种与发酵基质按7:100的重量配比混合均匀，置于36℃下，先通入无菌空气有氧发酵25h，之后厌氧发酵50h，停止发酵，得到一次发酵液；
步骤(4)，菊芋粉的选择：
选择市场上出售的优质菊芋粉为原料，要求无霉烂变质；
步骤(5)，二次发酵基质的配制：
将步骤(3)得到的一次发酵液与步骤(4)选择的菊芋粉混合，使菊芋粉的浓度达到200g/L，之后经巴氏消毒，得到二次发酵基质；
步骤(6)，二次发酵菌种的驯化与制备：
分别取少量3份步骤(5)得到的二次发酵基质作为驯化基质，分别取植物乳杆菌、嗜热链球菌、双歧杆菌三种益生菌为发酵菌种，将每一种发酵菌种与1 份发酵基质按101亿CFU发酵菌种/千克发酵基质的比例充分搅拌混合，置于4 3℃下培养8h，分别得到驯化植物乳杆菌菌种、驯化嗜热链球菌菌种和驯化双歧杆菌菌种；
步骤(7)，接种益生菌发酵母种并二次发酵处理：
取三等份步骤(5)得到的二次发酵基质，分别与步骤(6)得到的驯化植物乳杆菌菌种、驯化嗜热链球菌菌种和驯化双歧杆菌菌种按照100:5的重量配比混合均匀，置于42℃下发酵6h，分别得到驯化植物乳杆菌发酵熟料、驯化嗜热链球菌发酵熟料和驯化双歧杆菌发酵熟料；
步骤(8)，复配处理：
将步骤(7)得到的驯化植物乳杆菌发酵熟料、驯化嗜热链球菌发酵熟料和驯化双歧杆菌发酵熟料均匀混合，即得到石斛酵素半成品；
步骤(9)，益生元的添加、灌装及包装：
在步骤(8)中所获得的石斛酵素半成品里添加质量百分含量为9％的低聚果糖，混合均匀后，在无菌条件下进行灌装包装，得到成品。
实施例3
一种新型益生菌石斛酵素的生产工艺，包括如下步骤：
步骤(1)，石斛叶的除杂、洗净和荫干：
于石斛采收时收集丢弃的石斛叶子，进行筛选以除去霉变、虫蛀、腐烂的叶子，并用清水洗净，之后放到阴凉处荫干。
步骤(2)，石斛叶的研磨：
将步骤(1)得到的石斛叶研磨至浆状，得到石斛叶的原浆；
步骤(3)，一次发酵：
取步骤(2)得到的石斛叶的原浆为发酵基质，将纯种的酵母菌种与发酵基质按6.5:100的重量配比混合均匀，置于33℃下，先通入无菌空气有氧发酵23. 5h，之后厌氧发酵48h，停止发酵，得到一次发酵液；
步骤(4)，菊芋粉的选择：
选择市场上出售的优质菊芋粉为原料，要求无霉烂变质；
步骤(5)，二次发酵基质的配制：
将步骤(3)得到的一次发酵液与步骤(4)选择的菊芋粉混合，使菊芋粉的浓度达到180g/L，之后经巴氏消毒，得到二次发酵基质；
步骤(6)，二次发酵菌种的驯化与制备：
分别取少量3份步骤(5)得到的二次发酵基质作为驯化基质，分别取植物乳杆菌、嗜热链球菌、双歧杆菌三种益生菌为发酵菌种，将每一种发酵菌种与1 份发酵基质按99.5亿CFU发酵菌种/千克发酵基质的比例充分搅拌混合，置于 42℃下培养10h，分别得到驯化植物乳杆菌菌种、驯化嗜热链球菌菌种和驯化双歧杆菌菌种；
步骤(7)，接种益生菌发酵母种并二次发酵处理：
取三等份步骤(5)得到的二次发酵基质，分别与步骤(6)得到的驯化植物乳杆菌菌种、驯化嗜热链球菌菌种和驯化双歧杆菌菌种按照100:4.5的重量配比混合均匀，置于40℃下发酵10h，分别得到驯化植物乳杆菌发酵熟料、驯化嗜热链球菌发酵熟料和驯化双歧杆菌发酵熟料；
步骤(8)，复配处理：
将步骤(7)得到的驯化植物乳杆菌发酵熟料、驯化嗜热链球菌发酵熟料和驯化双歧杆菌发酵熟料均匀混合，即得到石斛酵素半成品；
步骤(9)，益生元的添加、灌装及包装：
在步骤(8)中所获得的石斛酵素半成品里添加质量百分含量为7％的低聚果糖，混合均匀后，在无菌条件下进行灌装包装，得到成品。
实施例4
一种新型益生菌石斛酵素的生产工艺，包括如下步骤：
步骤(1)，石斛叶的除杂、洗净和荫干：
于石斛采收时收集丢弃的石斛叶子，进行筛选以除去霉变、虫蛀、腐烂的叶子，并用清水洗净，之后放到阴凉处荫干。
步骤(2)，石斛叶的研磨：
将步骤(1)得到的石斛叶研磨至浆状，得到石斛叶的原浆；
步骤(3)，一次发酵：
取步骤(2)得到的石斛叶的原浆为发酵基质，将纯种的酵母菌菌种与发酵基质按6.2:100的重量配比混合均匀，置于30℃下，先通入无菌空气有氧发酵 24h，之后厌氧发酵49h，停止发酵，得到一次发酵液；
步骤(4)，菊芋粉的选择：
选择市场上出售的优质菊芋粉为原料，要求无霉烂变质；
步骤(5)，二次发酵基质的配制：
将步骤(3)得到的一次发酵液与步骤(4)选择的菊芋粉混合，使菊芋粉的浓度达到170g/L，之后经巴氏消毒，得到二次发酵基质；
步骤(6)，二次发酵菌种的驯化与制备：
分别取少量3份步骤(5)得到的二次发酵基质为驯化基质，分别取植物乳杆菌、嗜热链球菌、双歧杆菌三种益生菌为发酵菌种，将每一种发酵菌种与1 份发酵基质按100亿CFU发酵菌种/千克发酵基质的比例充分搅拌混合，置于4 1℃下培养11h，分别得到驯化植物乳杆菌菌种、驯化嗜热链球菌菌种和驯化双歧杆菌菌种；
步骤(7)，接种益生菌发酵母种并二次发酵处理：
取三等份步骤(5)得到的二次发酵基质，分别与步骤(6)得到的驯化植物乳杆菌菌种、驯化嗜热链球菌菌种和驯化双歧杆菌菌种按照100:4的重量配比混合均匀，置于40℃下发酵12h，分别得到驯化植物乳杆菌发酵熟料、驯化嗜热链球菌发酵熟料和驯化双歧杆菌发酵熟料；
步骤(8)，复配处理：
将步骤(7)得到的驯化植物乳杆菌发酵熟料、驯化嗜热链球菌发酵熟料和驯化双歧杆菌发酵熟料均匀混合，即得到石斛酵素半成品；
步骤(9)，益生元的添加、灌装及包装：
在步骤(8)中所获得的石斛酵素半成品里添加质量百分含量为6％的低聚果糖，混合均匀后，在无菌条件下进行灌装包装，得到成品。
实施例5
一种新型益生菌石斛酵素的生产工艺，包括如下步骤：
步骤(1)，石斛叶的除杂、洗净和荫干：
于石斛采收时收集丢弃的石斛叶子，进行筛选以除去霉变、虫蛀、腐烂的叶子，并用清水洗净，之后放到阴凉处荫干。
步骤(2)，石斛叶的研磨：
将步骤(1)得到的石斛叶研磨至浆状，得到石斛叶的原浆；
步骤(3)，一次发酵：
取步骤(2)得到的石斛叶的原浆为发酵基质，将纯种的酵母菌种与发酵基质按5:100的重量配比混合均匀，置于28℃下，先通入无菌空气有氧发酵24h，之后厌氧发酵49.5h，停止发酵，得到一次发酵液；
步骤(4)，菊芋粉的选择：
选择市场上出售的优质菊芋粉为原料，要求无霉烂变质；
步骤(5)，二次发酵基质的配制：
将步骤(3)得到的一次发酵液与步骤(4)选择的菊芋粉混合，使菊芋粉的浓度达到150g/L，之后经巴氏消毒，得到二次发酵基质；
步骤(6)，二次发酵菌种的驯化与制备：
分别取少量3份步骤(5)得到的二次发酵基质作为驯化基质，分别取植物乳杆菌、嗜热链球菌、双歧杆菌三种益生菌为发酵菌种，将每一种发酵菌种与1 份发酵基质按100亿CFU发酵菌种/千克发酵基质的比例充分搅拌混合，置于4 0℃下培养12h，分别得到驯化植物乳杆菌菌种、驯化嗜热链球菌菌种和驯化双歧杆菌菌种；
步骤(7)，接种益生菌发酵母种并二次发酵处理：
取三等份步骤(5)得到的二次发酵基质，分别与步骤(6)得到的驯化植物乳杆菌菌种、驯化嗜热链球菌菌种和驯化双歧杆菌菌种按照100:3的重量配比混合均匀，置于36℃下发酵15h，分别得到驯化植物乳杆菌发酵熟料、驯化嗜热链球菌发酵熟料和驯化双歧杆菌发酵熟料；
步骤(8)，复配处理：
将步骤(7)得到的驯化植物乳杆菌发酵熟料、驯化嗜热链球菌发酵熟料和驯化双歧杆菌发酵熟料均匀混合，即得到石斛酵素半成品；
步骤(9)，益生元的添加、灌装及包装：
在步骤(8)中所获得的石斛酵素半成品里添加质量百分含量为1％的低聚果糖，混合均匀后，在无菌条件下进行灌装包装，得到成品。
实施例6
一种新型益生菌石斛酵素的生产工艺，包括如下步骤：
步骤(1)，石斛叶的除杂、洗净和荫干：
于石斛采收时收集丢弃的石斛叶子，进行筛选以除去霉变、虫蛀、腐烂的叶子，并用清水洗净，之后放到阴凉处荫干。
步骤(2)，石斛叶的研磨：
将步骤(1)得到的石斛叶研磨至浆状，得到石斛叶的原浆；
步骤(3)，一次发酵：
取步骤(2)得到的石斛叶的原浆为发酵基质，将纯种的酵母菌菌种与发酵基质按7:100的重量配比混合均匀，置于36℃下，先通入无菌空气有氧发酵2 4h，之后厌氧发酵48h，停止发酵，得到一次发酵液；
步骤(4)，菊芋粉的选择：
选择市场上出售的优质菊芋粉为原料，要求无霉烂变质；
步骤(5)，二次发酵基质的配制：
将步骤(3)得到的一次发酵液与步骤(4)选择的菊芋粉混合，使菊芋粉的浓度达到200g/L，之后经巴氏消毒，得到二次发酵基质；
步骤(6)，二次发酵菌种的驯化与制备：
分别取少量3份步骤(5)得到的二次发酵基质作为驯化基质，分别取植物乳杆菌、嗜热链球菌、双歧杆菌三种益生菌为发酵菌种，将每一种发酵菌种与1 份发酵基质按100亿CFU发酵菌种/千克发酵基质的比例充分搅拌混合，置于4 3℃下培养8h，分别得到驯化植物乳杆菌菌种、驯化嗜热链球菌菌种和驯化双歧杆菌菌种；
步骤(7)，接种益生菌发酵母种并二次发酵处理：
取三等份步骤(5)得到的二次发酵基质，分别与步骤(6)得到的驯化植物乳杆菌菌种、驯化嗜热链球菌菌种和驯化双歧杆菌菌种按照100:5的重量配比混合均匀，置于42℃下发酵6h，分别得到驯化植物乳杆菌发酵熟料、驯化嗜热链球菌发酵熟料和驯化双歧杆菌发酵熟料；
步骤(8)，复配处理：
将步骤(7)得到的驯化植物乳杆菌发酵熟料、驯化嗜热链球菌发酵熟料和驯化双歧杆菌发酵熟料均匀混合，即得到石斛酵素半成品；
步骤(9)，益生元的添加、灌装及包装：
在步骤(8)中所获得的石斛酵素半成品里添加质量百分含量为9％的低聚果糖，混合均匀后，在无菌条件下进行灌装包装，得到成品。
性能检测：
蛋白酶、脂肪酶和超氧化物歧化酶是微生物酵素类保健食品的主要功效酶，其中蛋白酶和脂肪酶对食物的分解消化有促进作用。采用紫外分光光度法测定本发明酵素中蛋白酶活力为9975.5U/g。采用NaOH滴定法测定脂肪酶活力为6.41U/g。采用邻苯三酚自氧化法测定超氧化物歧化酶活力1811.112U/g。
嗜热链球菌、植物乳杆菌和双歧杆菌三种益生菌总数按国家GB 4789.35—2 010检测，本发明产品中活菌数为1亿CFU/g。
对本发明所制备的复合鲜花果蔬草本酵素进行了微生物检测，结果如表1所示。
表1
序号 检验项目 单位 实测结果
1 大肠菌群 MPN/100g ＜30
2 霉菌 CFU/g 2
3 酵母 CFU/g 266
4 沙门氏菌 / 未检出
5 志贺氏菌 / 未检出
6 金黄色葡萄球菌 / 未检出
7 副溶血性弧菌 / 未检出
检测和判定依据为：
GB 4789.3-2010《食品微生物学检验大肠菌群计数》
GB 4789.15-2010《食品微生物学检验霉菌和酵母计数》
GB 4789.4-2010《食品微生物学检验沙门氏菌检验》
GB 4789.5-2012《食品微生物学检验志贺氏菌检验》
GB 4789.10-2010《食品微生物学检验金黄色葡萄球菌检验》
GB 4789.7-2013《食品微生物学检验副溶血性弧菌检验》
动物实验
1、抗疲劳实验
方法:将小鼠随机分为4组，阴性对照组以及低、中、高三个剂量组。小鼠经口灌胃同体积不同剂量本发明实施例4产品30天，阴性对照组灌胃同体积的生理盐水，观察各组小鼠负重游泳时间、肝糖元、以及游泳后血乳酸、尿素氮、肌酸激酶、白细胞和血红蛋白指标的变化，结果如表2所示。
表2对小鼠负重游泳时间、血清尿素、肝糖原和血乳酸的影响
参照《保健食品检验与评价技术规范》对小鼠负重游泳时间、血清尿素、肝糖原和血乳酸进行检测，结果见表。阴性对照组负重游泳时间为565s，三个剂量组小鼠负重游泳时间与阴性对照组比较均有明显延长，差异均有显著性，中高剂量组延长时间更为显著。肝糖原和游泳后血清尿素含量在四个组中均未见明显差异。阴性对照组小鼠游泳后0min血乳酸值为7.8，低、中、高剂量组小鼠血乳酸值分别为5.7，5.2，5.5，差异均有统计学意义；同时，三个剂量组血乳酸曲线下面积较阴性对照组显著降低。
结果：与阴性对照组相比，本发明实施例4产品三个剂量组小鼠负重游泳时间均显著延长，血乳酸和肌酸激酶含量均显著降低，差异有统计学意义。结论：本发明益生菌石斛酵素能提高运动耐力和加速消除疲劳。
2、免疫调节实验
每批按体重随机分为4组(对照组、低剂量组、中剂量组、高剂量组)，每组10只。参照卫生部《保健食品检验与评价技术规范》增强免疫力功能试验中的相关试验方法，分别进行小鼠迟发型变态反应(DTH)试验；抗体生成细胞数和半数溶血值(HC50)实验，结果如表3和表4所示。
(1)细胞免疫功能试验
低剂量组、中剂量组和高剂量组注射同体积不同剂量的本发明产品，对照组注射同体积的生理盐水。
表3益生菌石斛酵素对小鼠细胞免疫功能的影响
绵羊红细胞(SRBC)诱导的小鼠迟发型变态反应(DTH)：各剂量组小鼠足跖肿胀度均高于对照组，益生菌石斛酵素组高剂量组有极显著差异(P＜0.0 1)，中剂量组有显著差异(P＜0.05)，提示高剂量益生菌石斛酵素具有增强SR BC引起的小鼠迟发型变态反应作用。ConA诱导的小鼠淋巴细胞转化实验(MT T法)：各剂量的光密度差值均高于对照组，高剂量组差异显著(P＜0.05)，提示高剂量益生菌石斛酵素具有增强小鼠淋巴细胞增殖能力。
(2)体液免疫功能试验
低剂量组、中剂量组和高剂量组注射同体积不同剂量的本发明产品，对照组注射同体积的生理盐水。
表4益生菌石斛酵素对小鼠体液免疫功能的影响
抗体生成细胞检测(Jerne改良玻片法)各剂量组空斑数均高于对照组，益生菌石斛酵素高剂量组差异显著(P＜0.05)：血清溶血性试验各剂量组小鼠血清半数溶血值(HC50)均高于对照组提示中益生菌石斛酵素有增强小鼠产生抗体生成细胞的能力和血清溶血素的能力。
结果：本实验结果显示益生菌石斛酵素可使细胞免疫和体液免疫功能明显增强，根据保健食品增强免疫力功能评价标准，表明益生菌石斛酵素具有调节免疫功能的作用。
3、抗氧化作用实验
益生菌石斛酵素对羟基自由基的清除作用
采用将邻二氮菲金属铁离子H2O2体系。向试管中分别加入0.75mmol/L邻二氮菲溶液1.0mL、0.150mol/L pH7.4的磷酸缓冲溶液1.5mL充分混匀后，加入0.75mmol/L的FeSO4溶液1.0mL。每加1管立即混匀。然后向试管中分别加入不同体积的益生菌石斛酵素溶液，混匀，加水使总体积为5.3mL，另有两支试管为对照组和空白组不加酵素溶液。再分别加入质量分数为0.01％的H2O2溶液1.0mL，空白组不加H2O2，以蒸馏水补充体积。在37℃保温1h测定A53 6，重复三次。
清除率(％)＝[(A2-A1)/(A0-A1)]×100％
其中，A0空白的吸光值，A1对照的吸光值，A2加酵素液管的吸光值；
益生菌石斛酵素对·OH的清除作用结果如表5所示。
表5益生菌石斛酵素对·OH的清除作用
样品 浓度(mg/mL) 吸光值(A536) 清除率(％)
空白 — 0.236±0.005 —
对照 — 0.079±0.001 —
益生菌石斛酵素 0.24 0.086±0.002 6.12
益生菌石斛酵素 0.39 0.090±0.002 10.36
益生菌石斛酵素 0.57 0.106±0.001 16.51
益生菌石斛酵素 0.72 0.117±0.001 22.85
益生菌石斛酵素 0.86 0.124±0.002 30.05
羟基自由基(·OH)是最活泼也是最具危害的活性氧自由基，对细胞的危害最大，是造成生物有机体过氧化损伤的主要因子。由上表可知，不同浓度的益生菌石斛酵素对羟基自由基均有明显的清除作用，与对照组相比有极显著差异 (P<0.01)，并随着石斛酵素浓度的增加，清除率增大，清除率与石斛酵素浓度之间呈现剂量效应关系，说明益生菌石斛酵素具有较强的·OH清除作用。
4、保护肝脏实验
将24只小鼠随机分为4组，即正常组、生理盐水组、益生菌石斛酵素组和联苯双酯组。正常组和生理盐水组每天给生理盐水，益生菌石斛酵素组和联苯双酯组分别按益生菌石斛酵素(0.5g/kg)和联苯双酯(0.1g/kg)的剂量给药；每只每天灌胃均0.2mL，每日1次，连续9天，同时生理盐水组、益生菌石斛酵素组和联苯双酯组在第3、6、9天分别按0.1mL(0.6g/kg)的剂量腹腔注射 10％四氯化碳—橄榄油溶液，末次造模24h(第10天)后，摘其眼球，取血，分离血清；剖取肝脏，用全自动生化分析仪测定血清丙氨酸氨基移换酶(SGPT) 值；用荧光法测定血浆、肝匀浆过氧化物(LPO)含量；切取肝脏组织，10％甲醛固定肝组织，石蜡包埋切片，HE染色，光镜下观察。
结果如表6、表7和图2所示：
(1)对血清SGPT酶的影响
表6益生菌石斛酵素对SGPT的影响
组别 n SGPT(U/L)
正常 6 28.56±8.72
生理盐水 6 127.25±84.22
益生菌石斛酵素 6 42.57±21.10
联苯双酯 6 30.56±21.85
生理盐水组SGPT活性明显升高，益生菌石斛酵素组、联苯双酯组SGPT 活性明显低于生理盐水组，组间比较差异具有显著性。
(2)对肝损伤小鼠血浆、肝匀浆LPO的影响
表7对肝损伤小鼠血浆、肝匀浆LPO的影响
组别 血浆LPO(mmol/L) 肝匀浆LPO(mmol/L)
正常 3.65±0.45 54.42±6.42
生理盐水 5.50±0.41 215.20±40.62
益生菌石斛酵素 4.32±0.65 165.42±24.56
联苯双酯 4.26±0.61 147.26±12.69
生理盐水组小鼠在腹腔注射四氯化碳(CCl4)24h，血浆、肝匀浆LPO含量明显升高；益生菌石斛酵素组LPO含量明显低于生理盐水组，经统计学处理差异具有显著性。
3、如图2所示，病理组织学检查正常组肝小叶结构正常；生理盐水组肝小叶结构及肝细胞索排列紊乱，可见广泛的细胞浊肿变性，肝细胞灶性坏死，尤以小叶中央区为突出；益生菌石斛酵素组肝窦周边细胞仍见有轻度的浊肿变性，汇管区可见少量炎症细胞浸润；联苯双酯组仅少数肝细胞出现浊肿变性。
临床病例：使用本发明实施例6产品进行治疗，每天饮用本发明产品15～2 0mL，具体病例如表8。
表8
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

Claims (3)

1.一种利用石斛叶生产益生菌石斛酵素的方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤（1），石斛叶的除杂、洗净和荫干：于石斛采收时收集丢弃的新鲜石斛叶子，进行筛选以除去霉变、虫蛀、腐烂的叶子，并用清水洗净，之后放到阴凉处荫干；
步骤（2），石斛叶的研磨：将步骤（1）得到的石斛叶子研磨至浆状，得到石斛叶的原浆；
步骤（3），一次发酵：取步骤（2）得到的石斛叶的原浆为发酵基质，将纯种的酵母菌菌种与发酵基质按5~7:100的重量配比混合均匀，置于28~36℃下，先通入无菌空气有氧发酵23~25h，之后厌氧发酵47~50h，停止发酵，得到一次发酵液；
步骤（4），菊芋粉的选择：选择市场上出售的菊芋粉为原料，要求无霉烂变质；
步骤（5），二次发酵基质的配制：将步骤（3）得到的一次发酵液与步骤（4）选择的菊芋粉混合，向一次发酵液中加入菊芋粉使菊芋粉的浓度达到150~200g/L，之后经巴氏消毒，得到二次发酵基质；
步骤（6），二次发酵菌种的驯化与制备：分别取少量3份步骤（5）得到的二次发酵基质作为驯化基质，分别取植物乳杆菌、嗜热链球菌、双歧杆菌三种益生菌为发酵菌种，将每一种发酵菌种与1份发酵基质按99~101亿CFU发酵菌种/千克发酵基质的比例充分搅拌混合，置于40~43℃下培养8~12h，分别得到驯化植物乳杆菌菌种、驯化嗜热链球菌菌种和驯化双歧杆菌菌种；
步骤（7），接种益生菌发酵母种并二次发酵处理：取三等份步骤（5）得到的二次发酵基质，分别与步骤（6）得到的驯化植物乳杆菌菌种、驯化嗜热链球菌菌种和驯化双歧杆菌菌种按照100:3~5的重量配比混合均匀，向三等份二次发酵基质中分别加入驯化植物乳杆菌菌种、驯化嗜热链球菌菌种和驯化双歧杆菌菌种，然后置于36~42℃下发酵6~15h，分别得到驯化植物乳杆菌发酵熟料、驯化嗜热链球菌发酵熟料和驯化双歧杆菌发酵熟料共三种发酵液；
步骤（8），复配处理：将步骤（7）得到的驯化植物乳杆菌发酵熟料、驯化嗜热链球菌发酵熟料和驯化双歧杆菌发酵熟料均匀混合，即得到石斛叶酵素半成品；
步骤（9），益生元的添加、灌装及包装：在步骤（8）中所获得的石斛叶酵素半成品里添加质量百分含量为1%~9%的低聚果糖，混合均匀后，在无菌条件下进行灌装包装，得到成品。
2.根据权利要求1所述的利用石斛叶生产益生菌石斛酵素的方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤（1），石斛叶的除杂、洗净和荫干：于石斛采收时收集丢弃的石斛叶子，进行筛选以除去霉变、虫蛀、腐烂的叶子，并用清水洗净，之后放到阴凉处荫干；
步骤（2），石斛叶的研磨：将步骤（1）得到的石斛叶子研磨至浆状，得到石斛叶的原浆；
步骤（3），一次发酵：取步骤（2）得到的石斛叶的原浆为发酵基质，将纯种的酵母菌菌种与发酵基质按5~7:100的重量配比混合均匀，置于28~36℃下，先通入无菌空气有氧发酵24h，之后厌氧发酵48h，停止发酵，得到一次发酵液；
步骤（4），菊芋粉的选择：选择市场上出售的菊芋粉为原料，要求无霉烂变质；
步骤（5），二次发酵基质的配制：将步骤（3）得到的一次发酵液与步骤（4）选择的菊芋粉混合，使菊芋粉的浓度达到150~200g/L，之后经巴氏消毒，得到二次发酵基质；
步骤（6），二次发酵菌种的驯化与制备：分别取少量3份步骤（5）得到的二次发酵基质作为驯化基质，分别取植物乳杆菌、嗜热链球菌、双歧杆菌三种益生菌为发酵菌种，将每一种发酵菌种与1份发酵基质按100亿CFU发酵菌种/千克发酵基质的比例充分搅拌混合，置于40~43℃下培养8~12h，分别得到驯化植物乳杆菌菌种、驯化嗜热链球菌菌种和驯化双歧杆菌菌种；
步骤（7），接种益生菌发酵母种并二次发酵处理：取三等份步骤（5）得到的二次发酵基质，分别与步骤（6）得到的驯化植物乳杆菌菌种、驯化嗜热链球菌菌种和驯化双歧杆菌菌种按照100:3~5的重量配比混合均匀，置于36~42℃下发酵6~15h，分别得到驯化植物乳杆菌发酵熟料、驯化嗜热链球菌发酵熟料和驯化双歧杆菌发酵熟料；
步骤（8），复配处理：将步骤（7）得到的驯化植物乳杆菌发酵熟料、驯化嗜热链球菌发酵熟料和驯化双歧杆菌发酵熟料均匀混合，即得到石斛叶酵素半成品；
步骤（9），益生元的添加、灌装及包装：在步骤（8）中所获得的石斛叶酵素半成品里添加质量百分含量为1%~9%的低聚果糖，混合均匀后，在无菌条件下进行灌装包装，得到成品。
3.权利要求1~2任意一项所述利用石斛叶生产益生菌石斛酵素的方法制得的益生菌石斛酵素。
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