CN104830695B - 具有诱导丹参毛状根酚酸积累作用的内生菌及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及丹参内生菌及其用途‑‑用于丹参毛状根培养时可提高酚酸类物质的积累。具体而言，本发明公开了一种内生菌，为Olivibacter soli LG3，其保藏号为：CCTCC NO:M2015084。该Olivibacter soli LG3能促进丹参毛状根中酚酸类物质(丹酚酸B、迷迭香酸)含量的积累，还能促进丹参毛状根增重。

Description

具有诱导丹参毛状根酚酸积累作用的内生菌及其用途
技术领域
本发明涉及一种丹参内生菌及其用途--用于丹参毛状根培养时可提高酚酸类物质的积累。
背景技术
丹参(学名：Salvia miltiorrhiza)是唇形科鼠尾草属植物，丹参根为中国传统中药。丹参最早在典籍里出现是《神农本草经》，该典籍将丹参列为上品药材，意思就是没有毒性。2010年版《中华人民共和国药典》记载，丹参具有活血通经，清心除烦，祛瘀止痛，消炎养血等作用，主治经闭痛经、月经不调、热痹肿痛、心烦不眠等，尤其是被广泛用于治疗心脑血管疾病，疗效显著。现有研究表明丹参中主要的活性成分可以分为脂溶性的丹参酮类化合物及水溶性丹酚酸类化合物，两者具有不同的药用活性。近年来，水溶性成分的药用价值越来越受到人们的重视，其主要成分包括丹参素钠(3,4-二羟基苯基乳酸)、原儿茶酸、肉桂酸、咖啡酸、对香豆酸、迷迭香酸、丹酚酸A、B、C、E等。2010年版《中华人民共和国药典》中以丹酚酸B含量作为酚酸类物质的指标，用以判断丹参药材的品质。
丹参的市场需求正日益增大，但现有丹参的野生资源有限，且采挖野生丹参会破坏自然环境的生态平衡，丹参资源不能满足人们需求；且不同地区丹参药材质量差别很大，栽培丹参的生长周期长且有效成分含量低；批量生产和临床使用就比较困难。因此通过组织培养丹参细胞、器官等直接获得丹参的有效成分，有可能解决这一问题。基于此，近年来通过发根农杆菌感染丹参产生毛状根并培养得到丹参的主要生物活性物质具有很大的发展潜力。
进一步的研究表明，丹参毛状根生产丹参酮受非生物与生物诱导子的影响。当在毛状根培养体系中添加了适量的Ag+、Co2+等非生物诱导子和酵母提取物、寡半乳糖醛酸、真菌诱导子等几种生物诱导子后能显著提高产生的丹参酮含量。但当前的研究均集中选用非生物诱导子或生物类诱导子中的真菌或酵母，且产量提高的成分集中在丹参酮类化合物，没有在细菌类诱导子及水溶性酚酸类成分含量提高的研究。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种内生菌--Olivibacter soli LG3，该菌株可促进丹参毛状根酚酸类物质的积累。
为了解决上述技术问题，本发明提供一种内生菌，为Olivibacter soli LG3，其保藏号为：CCTCC NO:M 2015084。
本发明还同时提供了上述内生菌的用途：促进丹参毛状根中酚酸类物质含量的积累。酚酸类物质主要是指迷迭香酸、丹酚酸B。
作为本发明的内生菌的用途的改进：促进丹参毛状根增重。
该菌株Olivibacter soli LG3是从丹参植株中采用平板稀释法分离得到一株内生细菌，经鉴定其菌体及发酵菌体具有促进丹参毛状根迷迭香酸和丹酚酸B成分积累的作用。
具体分离方法为：
1)、将丹参的根经表面消毒处理后，加入无菌水进行研磨稀释，涂布于营养琼脂上，于28～32℃培养1～3天；
营养琼脂配方：蛋白胨10g，牛肉膏3g，NaCl 5g，琼脂18g和蒸馏水1000mL，pH＝7.2～7.4。
2)、挑取单菌落于相同的营养琼脂平板划线纯化，于28～32℃培养1～3天；
3)、重复步骤2)，直至获得纯培养物。
本发明的内生菌的保藏信息具体如下：Olivibacter soli LG3，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国武汉武汉大学，保藏编号：CCTCC NO:M 2015084，保藏时间2015年3月4日。
本发明提供的内生菌-----Olivibacter soli LG3(CCTCC NO:M 2015084)在营养琼脂培养24h后菌落呈圆形，菌落不透明，边缘整齐，表面凸起，产淡黄色色素。
本发明提供的Olivibacter soli LG3(CCTCC NO:M 2015084)革兰氏染色阴性，好氧，杆状，不产芽胞；在生长温度为15～37℃、pH值为6.0～8.0的环境中生长良好，最佳培养温度28℃，最适培养pH为7.0；明胶水解阳性，能代谢葡萄糖、鼠李糖、核糖等产酸。
该Olivibacter soli LG3(CCTCC NO:M 2015084)的16S rDNA序列分析表明与Genbank国际数据库中记录的菌株Olivibacter soli的相似性为99％。
本发明的Olivibacter soli LG3(CCTCC NO:M 2015084)所得的菌体诱导子在丹参毛状根培养体系中分别促进迷迭香酸和丹酚酸B的积累。
本发明的Olivibacter soli LG3(CCTCC NO:M 2015084)所得的菌体诱导子(即，以发酵菌体作为诱导子)可促进毛状根鲜重增加23.9％，迷迭香酸含量提高16％，丹酚酸B含量提高44％。对人畜无毒无害，对环境不造成污染。可在丹参毛状根培养中得到应用，产生一定的经济效益。
本发明的Olivibacter soli LG3(CCTCC NO:M 2015084)用于促进丹参毛状根酚酸类物质积累时，只需将利用该Olivibacter soli LG3(CCTCC NO:M 2015084)制备的菌体诱导子接于毛状根培养基中，在促进丹参毛状根丹高产的同时又能促进丹酚酸B和迷迭香酸含量的提高。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1、Olivibacter soli LG3(CCTCC NO:M 2015084)的分离培养方法，依次进行以下步骤：
1、于四川中江采集野生丹参植株，根部洗净后25KHz超声波处理5分钟；
2、在无菌条件下，对步骤1所得的供试材料用灭菌去离子水冲洗3次，并依次用75％(v/v)的酒精和3％(m/V)次氯酸钠溶液表面消毒；
3、在无菌环境中，继续将步骤2所得供试材料用无菌水冲洗3次，取100μl最后1次冲洗的无菌水冲洗液涂布接种于营养琼脂上，30℃培养24h后，进行无菌验证。
如无菌落产生，则继续后续的步骤4；如有菌落产生，则返回步骤2继续表面消毒处理。
4、在超净台中，取处理好的丹参根样品1～2g，在无菌研钵中充分研磨，并加入5mL无菌水，混匀，静置15min，取100μl上清稀释涂布于营养琼脂培养基中，置于28～32℃(较佳30℃)培养1～3天；
5、挑取步骤4中所产的单菌种于相同培养基划线纯化分离，置于28～32℃(较佳30℃)培养1～3天，继续挑取单菌落；
重复上述操作直至得到纯培养为止。
6、将步骤5中所得到的单菌落进行16s rDNA序列测定，经序列比对，确定菌株，并保藏。得Olivibacter soli LG3(CCTCC NO:M 2015084)。
实施例2、Olivibacter soli LG3(CCTCC NO:M 2015084)菌体诱导子的制备方法，依次进行以下步骤：
1、Olivibacter soli LG3(CCTCC NO:M 2015084)转接于营养琼脂斜面，28℃培养2天；
营养琼脂斜面：蛋白胨10g，牛肉膏3g，NaCl 5g，琼脂18g和蒸馏水1000mL，pH＝7.2～7.4。
2、用接种环挑取1环步骤1所得的斜面菌种，接种于含50ml营养肉汤培养基的250ml三角瓶中，于28℃以220rpm培养72h，得Olivibacter soli LG3CCTCC M 2015084发酵原液；
营养肉汤培养基配方为：蛋白胨10g，牛肉膏3g，NaCl 5g和蒸馏水1000mL，pH＝7.2～7.4。
上述步骤1和步骤2均在自然光条件下培养。
3、取步骤2所得发酵原液，于4℃，12000rpm，离心2min，菌体沉淀用去离子水清洗3次，重悬于50mL去离子水，121℃，高压灭菌20min。灭菌后的菌体悬浮液用三层0.22μm滤膜进行真空抽滤，所得滤液为菌体诱导子。
实施例3、Olivibacter soli LG3(CCTCC NO:M 2015084)菌体诱导子对丹参毛状根水溶性成分促进实验：
1、0.3g的丹参毛状根(母根)接种于含100ml的6,7-V培养基的250ml三角瓶中，在25℃，100rpm避光培养18天，作为基础物；
实验组：在每个基础物中加入1.5ml的Olivibacter soli LG3(CCTCC NO:M2015084)菌体诱导子(实施例2所得)，继续相同条件(25℃，100rpm，避光)培养6天；作为实验组；
阴性对照：在每个基础物中加入1.5ml的无菌去离子水，继续相同条件(25℃，100rpm，避光)培养6天；作为空白对照组；
上述实验组和阴性对照(空白对照组)分别设置5个重复。
将实验组和阴性对照所得的丹参毛状根分别进行如下操作：
2、培养结束后用蒸馏水将步骤1得到的毛状根清洗三遍，用吸水纸吸干水分中，称鲜重(fresh weight，FW)；后将已称鲜重的毛状根放入烘箱，55℃干燥至恒重，测定干重(dry weight，DW)。
3、取适量烘至恒重的丹参根，研磨成粉末。取0.5g干粉加入2.5mL的70％甲醇，120W超声波清洗机中超声萃取60min(超声过程中水温不可过高，可适当加入冰块，即，控制温度≤20℃)，萃取液过0.45μm微孔滤膜，用高效液相色谱(HPLC)的方法方法进行迷迭香酸和丹酚酸B含量的测定。
测定结果如下：
实验组中加入Olivibacter soli LG3(CCTCC NO:M 2015084)诱导子的毛状根鲜重平均比空白对照组增加了23.9％，迷迭香酸含量比空白对照组高16％，丹酚酸B含量比空白对照组高44％。具体如表1所述。
对比例：分别选用以下现有Olivibacter soli菌株及本属相近种的菌株作为对比例，具体菌株如下：
A、比利时BCCM/LMG保藏机构保藏的代码编号为LMG 23492的Olivibacter soli菌株；
B、比利时BCCM/LMG保藏机构保藏的代码编号为LMG 23491的Olivibacterginsengisoli菌株；
C、比利时BCCM/LMG保藏机构保藏的代码编号为LMG 23494的Olivibacter terrae菌株；
D、德国微生物菌种保藏中心DSMZ保藏的代码编号为DSM 17696的Olivibactersitiensis；
将上述Olivibacter菌株按照上述实施例2所述的“菌体诱导子制备”和实施例3所述的“对丹参毛状根酚酸类物质积累的促进实验”进行，最终所得的结果如下表1所示。
表1.Olivibacter soli LG3CCTCC M 2015084及对比例对丹参毛状根酚酸类物质积累的影响
表中为实验平均值±标准偏差
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

Claims (3)

1.内生菌，其特征是：为Olivibacter soli LG3，其保藏号为：CCTCC NO:M 2015084。
2.如权利要求1中所述的内生菌的用途，其特征是：促进丹参毛状根中酚酸类物质含量的积累，所述酚酸类物质为丹酚酸B和迷迭香酸。
3.如权利要求1中所述的内生菌的用途，其特征是：促进丹参毛状根增重。
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