CN105349431B - 一种丹参内生真菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及微生物技术领域，具体是一种丹参内生真菌，是从唇形科鼠尾草属植物丹参植物活体中采用内生真菌分离纯化技术分离获得的，分类命名为球状茎点霉D14(Phoma glomerata)，保藏编号为CGMCC No.11305。本发明还通过丹参内生真菌菌株液体发酵，产生了丹酚酸C。本发明的丹参内生真菌是寻找丹酚酸C新资源的重要微生物，具有较大的应用价值。

Description

一种丹参内生真菌及其应用

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，具体地说，是一种丹参内生真菌及其应用。

背景技术

丹酚酸是中药丹参的一类水溶性成分。丹酚酸C是其中的一种，主要有抗氧化，抗肿瘤和明显的抗血小板聚集的作用。丹酚酸C主要来源于唇形科鼠尾草属植物丹参(Salviamiltiorrhiza Bunge)的根。虽然丹参资源区域广阔，且已进行大量的人工栽培；但是其分布不集中，资源更新周期长，且人工栽培技术要求高，药材质量参差各异。随着丹酚酸C众多药理活性的发现，其市场需求增大，通过直接采收丹参天然和人工资源将不能满足市场需求。另一方面，丹酚酸C化学合成困难，难以实现产业化。研究者们试图通过生物技术方法获得丹酚酸C，因此，近年来这已成为人们关注的课题。

中国专利文献CN102676392A公开了一种丹参内生真菌及其应用，是从丹参植物活体中采用内生真菌分离纯化技术分离获得的，经微生物分类学鉴定为木霉Trichodermaatroviride，保藏号为CGMCC No.4712，通过其液体发酵，产生了丹参酮化合物丹参酮I和丹参酮II A。中国专利文献CN104830717A公开了具有诱导丹酚酸B积累作用的丹参内生真菌，为Pseudomonas psychrotolerans LG4，其保藏号为：CCTCC NO:M2015085，可促进丹参毛状根中酚酸类物质(丹酚酸B)含量的积累。中国专利文献CN103992961A公开了一株提高丹参产量及酚酸类成分含量的真菌，它是保藏编号为CGMCC No.6627的拟青霉(Paecilomycessp.)，栽培丹参时在每株丹参幼苗根部分别施予固体培养的菌材0.5-1.5g，经与丹参幼苗共生栽培4-6月，能提高收获期时丹参的产量和丹参总酚酸及丹酚酸B的含量。

关于一种能够通过微生物发酵产生丹酚酸C的丹参内生真菌及其应用目前还未见报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种能够通过微生物发酵产生丹酚酸C的丹参内生真菌及其应用。

本发明的第一方面，提供了一种丹参内生真菌，命名为球状茎点霉D14(Phomaglomerata)。

所述的丹参内生真菌是从唇形科鼠尾草属植物丹参(Salvia miltiorrhizaBunge)植物活体中采用内生真菌分离纯化技术分离获得的，经微生物分类学鉴定为球状茎点霉D14(Phoma glomerata)。该菌株已保藏，保藏号为CGMCC No.11305，保藏日期2015年09月09日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编：100101。

本发明所述的丹参内生真菌的固体培养特征为：

在马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基上28℃培养，生长缓慢，菌落圆形，平坦，最初为白色，渐变为边缘白色，中间灰褐色，绒状，边缘整齐，背面蓝黑色。

本发明所述的丹参内生真菌的液体培养特征为：

(1)马铃薯液体培养基(PDB，200g土豆，20g葡萄糖，1000ml蒸馏水)，摇瓶培养7天，培养温度28℃；

(2)发酵培养特征：

培养第1天有少许1-2mm白色菌丝球出现，培养液澄清；培养第2天，菌丝球数量变多，直径增大至3-4mm，培养液澄清；培养第3天，菌丝球明显增多，直径增大至5-6mm；培养第4天，菌丝球开始变黑，培养液也变黑；培养第5天，菌丝球已经明显全部变黑；培养第6天和第7天，菌丝球与第5天没有明显差别。

本发明所述的丹参内生真菌形态特征为：培养的菌丝体无色、没有分枝，粗1.2-1.6um，平滑，由没有横隔，多核的菌丝体构成。

本发明所述的丹参内生真菌的ITS和5.8S rDNA 碱基序列如SEQ ID NO.1所示。将测序结果于NCBI网站进行序列比对

(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)。同球状茎点霉Phoma glomerataAY183371相比同源性为100％。

本发明的第二方面，提供上述丹参内生真菌在制备丹酚酸C中的应用。

所述的丹酚酸C是采用所述的丹参内生真菌通过液体发酵制备得到。

丹酚酸C，别名：丹参酚酸C，英文名：Salvianolic acid C，分子式：C₂₆H₂₀O₁₀，CAS：115841-09-3，化学结构式如下：

本发明所述的丹参内生真菌，经发酵可得丹酚酸类化合物丹酚酸C，其工艺步骤如下：

菌种活化→种子培养→发酵培养→发酵产物甲醇匀浆→超声提取→减压浓缩→HPLC和LC-HRMS/MS分析→丹酚酸类化合物。

其中，发酵原料为马铃薯液体培养基(PDB)，发酵方式为液体摇瓶培养；菌种活化采用平板固体培养基，培养基为PDA；种子培养为马铃薯液体培养基(PDB)；发酵培养基为马铃薯液体培养基(PDB)。培养时间：菌种平板培养活化72小时，种子液摇床培养72小时，发酵培养7天。培养温度：平板活化、种子摇床培养和发酵培养均为28℃。摇床转速：种子摇床培养和发酵培养均为180rpm。发酵物提取：发酵完毕，收集发酵产物，甲醇重悬匀浆，超声提取，减压浓缩即得发酵物甲醇提取物，甲醇溶解残留物采用HPLC、LC-MS/MS和LC-HRMS/MS等分析方法分析得到丹酚酸C。

本发明的第三方面，提供采用上述丹参内生真菌经液体发酵制备丹酚酸C的方法，包括以下步骤：

(A)取本发明的丹参内生真菌菌种，在无菌条件下，用接种针挑取少量菌丝，接入已灭菌的固体PDA培养基试管，于28℃活化培养72小时；

(B)取活化培养后的菌种，在无菌条件下，转接入已灭菌的液体PDB种子培养基中，28℃下180rpm摇床培养72小时，得种子；

(C)配制好的PDB液体培养基，分装入250ml的三角瓶中，每瓶约100ml，灭菌处理，冷却备用。无菌条件下，按照10％的接种量接种入种子，28℃下180rpm摇床培养7天；

(D)发酵完毕，收集培养物过滤后，将菌丝体悬于5倍体积的甲醇中匀浆5min，发酵液旋至粘稠加甲醇，超声处理60min；而后过滤减压蒸干，甲醇复溶残留物既得丹酚酸C。

选用甲醇提取发酵产物是因为甲醇提取能力强，渗透性高，可更完全的提取菌丝体中的成分。

本发明优点在于：

本发明所述的丹参内生真菌，通过菌株液体发酵能够产生丹酚酸类化合物丹酚酸C，是寻找丹酚酸C新资源的重要微生物，具有较大的应用价值。

生物材料样品的保藏信息：

保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心

地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号

保藏日期：2015年9月9日

保藏编号：CGMCC NO.11305

分类命名：球状茎点霉D14(Phoma glomerata)

附图说明

图1.本发明所述丹参内生真菌在PDA平板培养基上的形态图。

图2.本发明所述丹参内生真菌在PDA液体培养基中的形态图。

图3.本发明所述丹参内生真菌菌丝体甲醇提取物(b)和发酵液甲醇提取物(c)中丹酚酸C与标准品(a)HPLC比对图谱。

图4.本发明所述丹参内生真菌菌丝体甲醇提取物(e)和发酵液甲醇提取物(f)中丹酚酸C与标准品(d)的LC-HRMS/MS比对图谱。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明提供的具体实施方式作详细说明。

实施例1

本发明的丹参内生真菌为从陕西商洛丹参叶中得到的菌株。

本发明的丹参内生真菌按以下步骤分离获得：自来水冲洗30min去净泥沙后，用去离子水洗3次。将叶片按以下程序进行表面消毒：75％乙醇，30s→1.3M次氯酸钠(3-5％有效氯)，1min→75％乙醇，30s→无菌去离子水洗3次。滤纸吸干残留水份后，用灭过菌的手术刀将叶片剪成1cm×1cm大小的组织块，置于含有100mg/L青霉素的PDA(土豆200g/L，葡萄糖20g/L，琼脂15g/L)培养基上28℃培养。每天观察样品真菌生长的情况。5-7天后有菌丝长出，挑取菌丝尖端转移到新的PDA培养基上纯化培养，并按形态合并，一共分离得到58株内生真菌，其中，只有本发明的一株丹参内生真菌能够产生丹酚酸C。其分类命名为球状茎点霉D14(Phoma glomerata)，保藏编号为CGMCC No.11305。

实施例2

(1)取本发明的丹参内生真菌菌种，在无菌条件下，用接种针挑取少量菌丝，接入已灭菌的固体PDA培养基平板，于28℃活化培养72小时；

(2)取活化培养后的菌种，在无菌条件下，转接入已灭菌的液体PDB种子培养基中，28℃下180rpm摇床培养72小时，得种子；

(3)配制好的PDB液体培养基，分装入250ml的三角瓶中(每瓶约100ml)，灭菌处理，冷却备用。无菌条件下，按照10％的接种量接种入种子，28℃下180rpm摇床培养7天。

(4)发酵完毕，收集培养物过滤后，将菌丝体悬于5倍体积的甲醇中匀浆5min，发酵液旋至粘稠加甲醇，超声处理60min；而后过滤减压蒸干，甲醇复溶残留物即得丹酚酸C。

(5)HPLC色谱条件如下：色谱柱——ZOBAX-EXTEND-C18反相柱(250mm×4.6mm)，流动相——H₂O(+0.1％HCOOH)(A)/乙腈(B)。梯度洗脱——﹝时间(min)：B(乙腈)﹞＝﹝0.00:5％﹞—﹝10.00:5％﹞—﹝20.00:25％﹞—﹝30.00:25％﹞—﹝35.00:55％﹞—﹝40.00:60％﹞—﹝45.00:90％﹞，流速——1mL/min，进样量——10uL，柱温——25℃，检测波长——280nm。

(6)LC-HRMS/MS色谱条件如下：色谱柱——Column Technology C18column(5um,2.1×100mm)；流动相——H₂O(+0.1％HCOOH)–乙腈(+0.1％HCOOH)，梯度洗脱——﹝时间(min)：B(乙腈+0.1％甲酸)﹞＝[0.00:5％]-[1.00:5％]-[7.00:95％]-[8.00:95％]，流速——0.4ml/min，进样量——3μL。HRMS/MS参数——min range—100m/z，max range—1000m/z，scan rate—2Hz，gas temp—350℃，gas flow—11.0/min，Nebulizer—45psi。

(7)经以上HPLC和LC-HRMS/MS分析，如图3和图4所示，表明本发明的丹参内生真菌菌种液体发酵能够产生丹酚酸C。

以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可作出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。

Claims (6)

1.一种丹参内生真菌，其特征在于，所述的丹参内生真菌的分类命名为球状茎点霉(Phoma glomerata)D14，保藏编号为CGMCC No.11305。

2.根据权利要求1所述的丹参内生真菌在制备丹酚酸C中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的丹酚酸C是采用所述的丹参内生真菌通过液体发酵制备得到。

4.一种制备丹酚酸C的方法，其特征在于，所述的丹酚酸C是采用如权利要求1所述的丹参内生真菌通过液体发酵制备得到。

5.根据权利要求4所述的制备丹酚酸C的方法，其特征在于，所述的液体发酵培养基是马铃薯液体培养基，所述的培养基的配方是：200g土豆，20g葡萄糖，1000ml蒸馏水。

6.根据权利要求5所述的制备丹酚酸C的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(A)取所述的丹参内生真菌菌种，在无菌条件下，用接种针挑取少量菌丝，接入已灭菌的固体马铃薯培养基试管，于28℃活化培养72小时；

(B)取活化培养后的菌种，在无菌条件下，转接入已灭菌的液体马铃薯种子培养基中，28℃下180rpm摇床培养72小时，得种子；

(C)配制好所述的液体发酵培养基，分装入250ml的三角瓶中，每瓶100ml，灭菌处理，冷却备用；无菌条件下，按照10％的接种量接种入种子，28℃下180rpm摇床培养7天；

(D)发酵完毕，收集培养物过滤后，将菌丝体悬于5倍体积的甲醇中匀浆5min，发酵液旋至粘稠加甲醇，超声处理60min；而后过滤减压蒸干，甲醇复溶残留物既得丹酚酸C。