CN112138040B - 一种丹参提取物、注射剂及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种丹参提取物、注射剂及其用途，涉及药物化学技术领域。该丹参提取物的制备方法，具体为：菌种活化，将球孢白僵菌接种在SDA培养基上进行培养；菌种扩增，将上述活化菌种接种在液体培养基中培养得到菌种培养液；药材发酵，丹参粉碎成末，加入水、灭菌，加入含有隐绿原酸的菌种培养液进行发酵得到发酵药材；分离纯化，用甲醇水溶液浸泡上述发酵药材，超声、过滤、减压旋蒸得到丹参提取物。本发明制得的丹参提取物得率高，具有优异的药理活性，抗炎作用增强；可制作注射剂，用于治疗阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征合并高血压，效果显著。

Description

一种丹参提取物、注射剂及其用途
技术领域
本发明属于药物化学技术领域，具体涉及一种丹参提取物、注射剂及其用途。
背景技术
丹参为唇型科Labiatae植物丹参Salvia miltiorrhiza Bge.的干燥根及根茎，因其根皮丹而肉紫，且具有滋补强壮的功效，故名丹参，始载于汉代《神农本草经》，并被列为上品，属活血调经之要药。其主要的药效物质为水溶性的丹参酚酸和脂溶性的丹参酮类化合物。丹参属传统中药，功能活血祛瘀，通经止痛，凉血消痈，具有显著的抗炎、抗菌、抗氧化和抗肿瘤等作用，以多种形式应用于临床，如注射液、滴丸、片剂等。因丹参具有明显的药用价值，因而丹参中有效成分的提取也愈加值得关注。
传统中药材的使用历史在中国可以追溯到2000年以前。相对于西药而言，中药材存在一些诸如含量低、成分复杂、有一定的毒副作用等缺点。但通过某些生物转化作用恰恰可以弥补上述缺点。微生物转化是一种酶催化反应，具有酶促反应的一系列特点：高度的立体结构选择性和专一性，从而减少了产物分解、异构、消旋和重排的情况，对结构的药物的立体选择性合成具有显著意义；反应条件温和，操作简单，环保公害低，利于工业化扩大生产。
睡眠呼吸暂停低通气综合征(SAHS)是继发性高血压的重要原因，其特点是睡眠过程中反复、频繁出现呼吸暂停和低通气，并与高血压常合并发生。成人睡眠呼吸暂停综合征包括OSAHS、中枢型睡眠呼吸暂停综合征、睡眠低通气综合征等，临床上以OSAHS最为常见。阻塞性睡眠呼吸暂停相关性高血压是指与OSAHS相关联的高血压。丹参酚酸类提取物应用于睡眠呼吸暂停低通气综合征合并高血压尚未见报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种丹参提取物、注射剂及其用途，该丹参提取物得率较好，药效强度高，具有优异的抗炎作用；且对阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征合并高血压的治疗作用强。
本发明为实现上述目的所采取的技术方案为：
一种丹参提取物的制备方法，包括：
菌种活化，将球孢白僵菌(Beauveria bassiana)接种在SDA培养基上进行培养；
菌种扩增，将上述活化菌种接种在液体培养基中培养得到菌种扩增培养液；
药材发酵，丹参粉碎成末，加入水、灭菌，加入含有隐绿原酸的菌种扩增培养液进行发酵得到发酵药材；
分离纯化，用甲醇水溶液浸泡上述发酵药材，超声、过滤、减压旋蒸得到丹参提取物。微生物转化法，具有高度的立体结构选择性和专一性，反应条件温和，操作简单，环境友好，转化效率高；隐绿原酸来源于金银花，杜仲等中药，作用于菌种可促进其胞外酶的分泌，增加酶种类，提升酶活性；与丹参协同作用，改变菌种的代谢途径，产生新的代谢产物，有效地提高提取物药效。本发明制得的丹参提取物，利用微生物代谢转化成糖基化丹参多酚酸化合物，其中：丹酚酸B糖基化合物含量为72～78％；丹酚酸Y糖基化合物含量为5.6～8％；迷迭香酸糖基化合物含量为4.5～7％；该提取物具有更高的药理活性，进一步提高抗炎作用，降低药物毒性；除此之外，本发明制得的丹参提取物，对阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征合并高血压具有较好的治疗效果，可降低患者血清中MIP-1α、BNP和HGF的水平，减轻患者病情程度。
优选地，菌种活化条件为：温度28～30℃，培养时间6～7d；菌种扩增条件为：沙氏葡萄糖液体培养基，温度28～30℃，转速180～200rpm，培养45～48h。
优选地，药材发酵过程中丹参与水的固液比为1：2g/mL；隐绿原酸的加入量为0.05～0.08％；分离纯化中得到的丹参提取物为糖基化产物。
本发明还公开了一种丹参提取物在制备注射剂中应用。
本发明的又一目的，在于提供一种注射剂，包括，丹参提取物、氯化钠注射液。
优选地，注射剂为静脉滴注。
本发明还公开了注射剂的制备，具体为：0.9～1％氯化钠注射液先溶解丹参提取物，再稀释至丹参提取物浓度为0.4～0.6mg/mL。
优选地，注射剂的使用方法为：1次/4d，100～150mg/次。
优选地，注射剂以静脉滴注9～12周或更久的方式施用。
本发明的又一目的，在于提供丹参提取物在治疗阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征合并高血压中的用途。
本发明的又一目的，在于提注射剂在治疗阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征合并高血压中的用途。
本发明的又一目的，在于提供丹参提取物和水杨苷在治疗阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征合并高血压中的用途。丹参提取物与水杨苷配伍对阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征合并高血压的治疗作用强，有效降低患者血清中MIP-1α、BNP和HGF的水平，甚至恢复正常水平；且患者对其产生的不良反应小，为阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征合并高血压的治疗寻找了一条新途径。
优选地，在治疗阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征合并高血压中丹参提取物和水杨苷的用量比为1：0.8～1.2。
相比于现有技术，本发明具有如下有益效果：
微生物转化法发酵丹参药材过程中加入隐绿原酸，可促进球孢白僵菌菌株胞外酶的分泌，提升酶活性；与丹参协同作用，改变菌种的代谢途径，有效地提高丹参提取物药效。本发明制得的丹参提取物，具有较高的抗炎作用，进一步增强药理活性。除此之外，本发明制得的丹参提取物，可降低患者血清中MIP-1α、BNP和HGF的水平，对阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征合并高血压具有较好的治疗效果。且其与水杨苷配伍，增强对阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征合并高血压的治疗作用，有效降减轻患者的症状，甚至恢复正常水平；为阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征合并高血压的治疗寻找了一条新途径。
因此，本发明提供了一种丹参提取物、注射剂及其用途，该丹参提取物得率较好，药效强度高，具有优异的抗炎作用；且对阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征合并高血压的治疗作用强。
附图说明
图1为本发明实施例1中红外吸收光谱测试结果示意图；
图2为本发明实施例3中胞外酶活性测试结果对比示意图；
图3为本发明实施例7中抗炎活性测试结果对比示意图；
图4为本发明实施例8中患者血清指标水平测试结果对比示意图；
图5为本发明实施例9中患者血清指标水平测试结果对比示意图。
具体实施方式
以下结合具体实施方式和附图对本发明的技术方案作进一步详细描述：
本发明实施例所用球孢白僵菌购自中国农业微生物菌种保藏管理中心，菌种编号为：ACCC 30713。
实施例1：
一种丹参提取物的制备方法，包括：
菌种活化，使用划线法将球孢白僵菌接种在SDA培养基上，置于28℃培养箱中培养7d得到活化菌种；
菌种扩增，将上述活化菌种接种在沙氏葡萄糖液体培养基中，温度设置为28℃，摇床转速为180rpm，培养48h得到菌种扩增培养液；
药材发酵，丹参粉碎成末，加入自来水(固液比1：2g/mL)使药材润湿，过夜。121℃下灭菌30min，在药材冷却后加入含有0.05％的隐绿原酸的菌种扩增培养液(固液比为15：1g/mL)，于28℃培养箱中发酵30d，发酵期间不时轻摇药材，使真菌发酵均匀，得到发酵药材；
分离纯化，用80％甲醇水溶液浸泡上述发酵药材，超声提取3次，每次30min，过滤、合并滤液，于旋转蒸发仪上45℃减压蒸干得到丹参提取物；提取率为90.3％。
1、红外光谱测定(FT-IR)
将样品在恒温干燥箱中除水处理后，取少量样品与溴化钾在玛瑙研钵中混合均匀、研磨和压片后，放置在TENSOR 27型红外光谱仪上进行测试，其中扫描波数范围为4000～500cm-1，扫描分辨率为6cm-1，扫描次数为18。
对实施例1中制备得到的丹参提取物以及丹参药材进行红外测试，结果如图1所示。从图中分析可知，在3390cm-1附近的吸收峰是酚酸的-OH基团的伸缩振动峰，在2956cm-1附近的吸收是-CH3，-CH2等基团的伸缩振动峰，1605cm-1附近的吸收峰是酚酸C＝O基团的伸缩振动峰；与丹参药材的红外光谱信号相比，丹参提取物红外光谱中，1725cm-1附件的吸收峰为酯的C＝O基团的伸缩振动峰，1235cm-1附近出现的吸收峰为Ar-O-CR的伸缩振动，且在500～700cm-1范围内出现的吸收峰为葡萄糖糖环结构的特征峰；以上信息表明葡萄糖键连在部分酚羟基与羧基上，丹参药材发酵后得到丹参提取物为糖基化产物。
2、丹参提取物部分成分含量测定
色谱条件
色谱柱：Agilent Eclipse Plus C18(4.6mm×250mm，5μm)；流动相：乙腈-0.05％磷酸水(22：78)等度洗脱；流速：0.7mL·min-1；检测波长288nm；柱温25℃；进样量10μL。
混合对照品储备液的制备
分别精密称取迷迭香酸糖基化合物、丹酚酸B糖基化合物、丹酚酸Y糖基化合物对照品适量，加纯水制成混合对照品溶液，浓度分别为40.00μg·mL-1、544.00μg·mL-1、114.40μg·mL-1的混合对照品溶液。
线性关系测试分别精密量取混合对照品溶液0.5、1、2、3、4、5mL置5mL量瓶中，用超纯水定容至刻度，摇匀，得到系列标准溶液。分别进样10μL，记录峰面积A，以峰面积Y对质量浓度X进行线性回归，绘制标准曲线，得到各成分的回归方程及线性范围。
样品溶液的制备及测定
取丹参提取物6mg，精密称定，加甲醇溶解并定容到10mL，摇匀，即得。接着进行进样测定，采用外标法计算样品中3种成分含量，分别为：丹酚酸B糖基化合物，73.3％；丹酚酸Y糖基化合物，6.38％；迷迭香酸糖基化合物，5.86％。
实施例2：
一种丹参提取物的制备方法与实施例1的不同之处在于药材发酵过程中不添加隐绿原酸；丹参提取物的提取率为76.8％。
1、丹参提取物的提取率
对比实施例1和实施例2可知，实施例1中的丹参提取物的提取率高于实施例2，说明隐绿原酸的加入能够提高丹参提取物的提取率。
2、丹参提取物部分成分含量测定
同实施例1相同。测得结果为：丹酚酸B糖基化合物，52.9％；丹酚酸Y糖基化合物，4.53％；迷迭香酸糖基化合物，3.21％。
对比实施例1和实施例2可得，实施例1制得的丹参提取物中，上述3中组分的含量明显高于实施例2的，且丹酚酸B糖基化合物成分占比显著增高。
实施例3：
胞外酶活性测定
1、菌株液体培养、粗酶液制备
将球孢白僵菌菌株在SDA平板上(25±1)℃恒温培养10d，在无菌条件下刮取孢子粉，放于装有少量含0.05％吐温-80无菌水的组织研磨器中充分研磨后，倒入灭菌后的小烧杯中，用血球计数板计数，并将孢子悬液浓度调至1亿个/mL备用；
取两等份上述孢子悬液，以1％的量接种到100mL SDB培养基中(置于250mL三角瓶中)，其中一份加入0.05％的隐绿原酸(实验组)，一份不加(对照组)；于(25±1)℃恒温摇床中150r/min振荡培养5d，过滤后留滤液测定胞外酶活性。
2、蛋白酶活性测定
用Tris-HCl缓冲液(0.05mol/L，pH值为8.5)将底物酪蛋白配成10mg/mL酪蛋白溶液，取1mL分别加入1mL上述滤液中，37℃水浴反应30min，每个处理3次重复；用2mL 0.4mol/L三氯乙酸终止反应并过滤，留滤液用Folin-酚试剂进行检测，每管加入400μL滤液，2mLFolin等A、B混合液(1：50的比例配制)室温下静置反应10min，加入200μL酚试剂，静置30min，在650nm波长处测量吸光度，以1min催化分解生成1μg酪氨酸的酶量为1个活性单位(U/mL)，用酪氨酸标准溶液制作标准曲线，从而测定胞外蛋白酶的活性。
3、结果分析
测试结果如图2所示。分析可知，相比于对照组，实验组胞外蛋白酶的活性明显增强；表明隐绿原酸的加入有利于菌株胞外酶的分泌，增强酶活性，进而作用于丹参药材，提升丹参提取物的产率，增强药效。
实施例4：
一种丹参提取物的制备与实施例1相同。
一种注射剂的制备：取0.9％的氯化钠注射液，加入丹参提取物，搅拌溶解，再加入氯化钠注射液稀释至丹参提取物浓度为0.4mg/mL，用0.1mol/L盐酸溶液调节pH至6.0，分装于中性玻璃容器中，用流通蒸汽100℃下，灭菌30min。
实施例5：
一种丹参提取物的制备与实施例1相同。
一种注射剂的制备：取1％的氯化钠注射液，加入丹参提取物，搅拌溶解，再加入氯化钠注射液稀释至丹参提取物浓度为0.5mg/mL，用0.1mol/L盐酸溶液调节pH至5.5，分装于中性玻璃容器中，用流通蒸汽100℃下，灭菌30min。
实施例6：
一种丹参提取物的制备与实施例1相同。
一种注射剂的制备：取0.9％的氯化钠注射液，加入丹参提取物，搅拌溶解，再加入氯化钠注射液稀释至丹参提取物浓度为0.6mg/mL，用0.1mol/L盐酸溶液调节pH至6.5，分装于中性玻璃容器中，用流通蒸汽100℃下，灭菌30min。
实施例7：
丹参提取物对二甲苯致小鼠耳廓肿胀的影响
1、供试药液：称取丹参提取物，加入0.9％的氯化钠水溶液配置浓度为0.4mg/mL的母液。
2、实验方法：昆明小鼠45只，雄性，随机分成3组，药物组1(实施例1制得的丹参提取物)、药物组2(实施例2制得的丹参提取物)、空白对照组(生理盐水)，每组15只；每组每四天给药1次，连用12d。其中，药物组和对照组均注射给药。末次给药30min后，每只小鼠右耳内、外侧涂布二甲苯，左耳作为对照。30min后脱颈椎处死小鼠，用直径6.0mm打孔器在左右耳廓同一位置打取耳片，分别称重，计算肿胀率和抑制率。
耳肿胀率＝(致炎侧耳片重-非致炎侧耳片重)/非致炎侧耳片重×100％
抑制率＝(对照组平均肿胀度-给药组平均肿胀度)/对照组平均肿胀度×100％
3、结果分析
二甲苯可使小鼠耳廓毛细管通透性增加，造成局部急性渗出性炎症水肿，常用于验证药物的抗炎作用。测试结果如图3所示，分析可知，相比于空白对照组丹参提取物能均可显著抑制二甲苯导致的小鼠耳肿胀，且实施例1的效果要高于实施例2，表明发酵过程中加入隐绿原酸可促进丹参提取物的得率，提升丹参提取物的抗炎作用，具有增强药效的效果。
实施例8：
丹参提取物治疗阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征(OSAHS)合并高血压
选择100例OSAHS合并高血压患者根据临床治疗方法随机分为2组，治疗1组：实施例1制得的丹参提取物；治疗2组：实施例2制得的丹参提取物；选取同期50例健康体检者作为对照组。治疗组年龄40～70岁；病情程度相当；BMI 22.6～27.5kg/m2；病程4～5.6年。对照组年龄40～70岁；BMI 22.0～27.0kg/m2。研究对象年龄、BMI等基线资料，差异均无统计学意义(P＞0.05)，均衡可比。所有患者均进行常规的基础治疗；其中，治疗1组和2组患者，丹参提取物，药物浓度为0.4mg/mL，静脉滴注，1次/4d，100mg/次。以4周为1个疗程，观察3个疗程。
1、结果测试
对照组、治疗组(治疗前以及治疗后)分别抽取所有研究对象空腹静脉血4mL，室温条件下3000r/min离心15min(离心半径为4.5cm)，取上清液，以美国Bio-RAD公司Bio-RAD550型酶标仪与配套试剂盒经酶联免疫吸附法测定MIP-1α及HGF水平，以放射免疫法测定血清BNP水平。
2、结果分析
测试结果如图4所示。分析可知，治疗组患者治疗前血清中MIP-1α、HGF及BNP水平明显高于对照组；治疗组药物治疗后，三项指标均有明显的下降，表明丹参提取物对OSAHS合并高血压均具有一定的治疗效果；且实施例1制得丹参提取物的效果要好于实施例2的。差异均有统计学意义(P＜0.05)。
实施例9：
丹参提取物和水杨苷治疗阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征(OSAHS)合并高血压
选择150例OSAHS合并高血压患者根据临床治疗方法随机分为3组，其中治疗1组：丹参提取物(实施例1制得的)；治疗2组：水杨苷；治疗3组：使用丹参提取物和水杨苷；选取同期50例健康体检者作为对照组。治疗组年龄40～70岁；病情程度相当；BMI 22.6～27.5kg/m2；病程4～5.6年。对照组年龄40～70岁；BMI 22.0～27.0kg/m2。研究对象年龄、BMI等基线资料，差异均无统计学意义(P＞0.05)，均衡可比。所有患者均进行常规的基础治疗；其中，治疗1组患者，丹参提取物，药物浓度为0.4mg/mL，静脉滴注，1次/4d，100mg/次；治疗2组：水杨苷，药物浓度为0.4mg/mL，静脉注射，1次/4d，100mg/次；治疗3组：使用丹参提取物和水杨苷，药物浓度均为0.4mg/mL，静脉注射，1次/4d，100mg/次。3组均以4周为1个疗程，观察3个疗程。
1、结果测试
对照组、治疗组(治疗前以及治疗后)分别抽取所有研究对象空腹静脉血4ml，室温条件下3000r/min离心15min(离心半径为4.5cm)，取上清液，以美国Bio-RAD公司Bio-RAD550型酶标仪与配套试剂盒经酶联免疫吸附法测定MIP-1α及HGF水平，以放射免疫法测定血清BNP水平。
2、配伍计算方法
依据金氏公式计算q值，q＝EA+B/(EA+EB-EA×EB)，用于判断两药物配伍使用后的效果是否优于单独给药。若q<0.55，两药作用为显著拮抗；0.55≤q<0.85，两药作用为拮抗；0.85≤q<1.15，两药作用为单纯相加；1.15≤q<20，两药作用为协同增强；q≥20，两药作用为显著增强。
3、结果分析
测试结果如图5所示。分析可知，治疗组患者治疗前血清中MIP-1α、HGF及BNP水平明显高于对照组；治疗组药物治疗后，三项指标有明显的下降，表明丹参提取物和水杨苷对OSAHS合并高血压均具有一定的治疗效果。治疗4周后，治疗1组、治疗2组、治疗3组血清指标中MIP-1α水平下降率分别为50.56％、41.04％、84.65％，依据金氏公式，q＝97.15％/(69.36％+42.56％-69.36％×42.56％)＝1.18，符合1.15≤q<20；同理，治疗3组患者血清中的HGF和BNP的q分别为1.23、1.28；同时从图x中可以看出，治疗3组的效果明显好于治疗1组和治疗2组，表明丹参提取物与水杨苷的配伍协同增强作用，治疗OSAHS合并高血压的效果更佳。差异均有统计学意义(P＜0.05)。
上述实施例中的常规技术为本领域技术人员所知晓的现有技术，故在此不再详细赘述。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。

Claims (6)

1.一种丹参提取物的制备方法，包括：
菌种活化，将球孢白僵菌(Beauveria bassiana)接种在SDA培养基上进行培养；
菌种扩增，将所述活化菌种接种在液体培养基中培养得到菌种扩增培养液；
药材发酵，丹参粉碎成末，加入水、灭菌，加入含有隐绿原酸的菌种扩增培养液进行发酵得到发酵药材；
分离纯化，用甲醇水溶液浸泡所述发酵药材，超声、过滤、减压旋蒸得到丹参提取物；
所述球孢白僵菌购自中国农业微生物菌种保藏管理中心，菌种编号为：ACCC 30713；
所述菌种活化条件为：温度28～30℃，培养时间6～7d；菌种扩增条件为：沙氏葡萄糖液体培养基，温度28～30℃，转速180～200rpm，培养45～48h；
所述药材发酵过程中丹参与水的固液比为1：2g/mL；所述隐绿原酸的加入量为0.05～0.08％。
2.根据权利要求1所述的一种丹参提取物的制备方法，其特征在于：所述分离纯化中得到的丹参提取物为糖基化产物。
3.权利要求1所述制备方法制得的丹参提取物在制备注射剂中应用。
4.一种注射剂，其特征在于，包括权利要求1所述的丹参提取物、氯化钠注射液。
5.权利要求4所述的注射剂的制备方法，其特征在于，包括：0.9～1％氯化钠注射液先溶解丹参提取物，再稀释至丹参提取物浓度为0.4～0.6mg/mL。
6.权利要求1所述制备方法制得的丹参提取物在制备治疗阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征合并高血压的药物中的用途。
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