CN101565694A - 丹酚酸酶及丹酚酸酶和人参皂苷混合酶及其转化药材的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种丹酚酸酶，能水解丹酚酸B，使之变成丹参素、咖啡酸和其二聚体化合物，来源于微生物包括曲霉菌、细菌或酵母菌，丹参植物或谷物芽。本发明还提供了丹酚酸酶转化丹酚酸B的方法。本发明也提供了一种丹酚酸酶和三七人参皂苷酶的混合酶，来源于微生物包括曲霉菌、细菌或酵母菌，丹参植物或谷物芽。本发明还提供了一种处理丹参和三七混合药材或提取物的方法，该方法能使丹参中的丹酚酸B转化为丹参素、咖啡酸和其和二聚体，使三七皂苷转化为活性更高的Rg3、C－K、Rg2、Rh2、Rh1次生皂苷和苷元。其酶转化提取成分，活性高，可用于医药、功能食品和功能化妆品。
Description
技术领域：
本发明涉及酶转化/生物转化法处理中药材的方法领域，特别是酶转化/生物转化法处理丹参和三七的方法领域。
背景技术：
丹参(Salvia Miltiorrhiza)为唇形科鼠尾草属的多年生草本植物丹参的干燥根及根茎，因其色红而且形状似参而得名丹参；丹参又名赤参，为唇形科鼠尾草多年生草本植物，丹参的干燥根及根茎是我国的传统中药，在医疗上应用历史悠久，功效甚广。传统医学记载，丹参性寒、味苦，归心经、心包经，专走血分。丹参能通血脉，功擅活血化瘀，是治疗心血管病的重要中草药。
丹参主要成份是水溶性成分和油溶性丹参酮；水溶性成分主要成份丹酚酸B为主，中国药典2005年版上规定丹参药材的丹酚酸B(Salvianolic acid B)含量3％以上，还有少量的丹参素与咖啡酸两分子缩合丹酚酸A和二分子丹参素与咖啡酸缩合丹酚酸C。丹酚酸B是三分子丹参素与一分子咖啡酸缩合的，其结构是
在丹参丹参素和咖啡酸单体、丹参素二分子聚合物(丹参酸丙)、丹参素和咖啡酸二分子聚合物(迷迭香酸)含量很低，往往加工降解中出现的，化学结构如下：
(1)丹参素(danshensu)的结构式： (2)咖啡酸结构式：
(3)丹参酸丙结构式： (4)迷迭香酸结构式：
丹参的油溶性成分是丹参酮，丹参酮是二萜醌类化合物，丹参中含量较高的丹参酮结构为：
三七又称田七，是五加科人参属植物，学名为Panax notoginseng(Burk.)F.H.Chen。三七根部为我国名贵的中药材，具有活血化瘀、消肿止痛、滋补强壮等功效，是治疗跌打损伤的良药。三七人参皂苷为主要有效成分之一，含量较高的主要皂苷为人参皂苷为Rb1、Rg1和R1，中国药典2005年版上规定三七药材Rb1、Rg1和R1皂苷含量5％以上，还含0.2％左右的的Re和Rd。其三七人参皂苷结构和酶转化的次生皂苷结构为：
| 人参皂苷 | R1 | R2 |
| Rb1 | Glc1-2Glc- | Glc1-6Glc-(S) |
| Rd | Glc1-2Glc- | Glc-(S) |
| F2 | Glc- | Glc-(S) |
| Rg3 | Glc1-2Glc- | H-(R，S) |
| Rh2 | Glc- | H-(R，S) |
| C-K | H- | Glc-(S) |
表1原人参二醇人参皂苷(Protopanaxadiol type ginsenosides，PPD)
| Ginsenoside | R1 | R2 |
| Re | Rha1-2Glc- | Glc-(S) |
| R1 | Xyl1-2Glc | Glc-(S) |
| Rg1 | Glc- | Glc-(S) |
| Rg2 | Rha1-2Glc- | H-(S，R) |
| Rh1 | Glc- | H-(S，R) |
表2原人参三醇人参皂苷(Protopanaxatriol type ginsenosides，PPT)
如上所述丹参药材的主要成分是丹酚酸B和丹参酮，三七的主要皂苷Rb1、Rg1和R1、Re和Rd。目前丹参和三七提取物主要用于制备复方丹参片和复方丹参滴丸；其提取方法是：用乙醇提取丹参酮等丹参脂溶性物质、再用水提取水溶性物质，与三七粉或者三七水提取或醇类提取混合，制备复方丹参片；还有丹参和三七混合水煎提取水溶性成分，用于制备复方丹参滴丸(中华人民共和国药典，2005年版，化学工业出版社，p527-528)；也就是说丹参和三七有效成分提取是水或者醇提取法(王雪莉等，新技术在中药制剂研究中的应用，中草药，2001年，32卷第二期，176-178)；由此丹参和三七提取物中的主要有效成分基本上没有变化。
发明内容
本发明的目的在于提供一种能水解丹酚酸B，使之变成活性更好的丹参素、咖啡酸和其二聚体化合物的丹酚酸酶。
本发明的目的还在于提供一种用所述的丹酚酸酶转化丹酚酸B的方法。
本发明的目的也在于提供一种丹酚酸酶和三七人参皂苷酶的混合酶，它能使丹参中的丹酚酸B转化为丹参素和二聚体、使三七皂苷转化为活性更高的Rg3、C-K、Rg2、Rh2、Rh1次生皂苷和苷元。
本发明的目的还在于提供一种用所述的丹酚酸酶和三七人参皂苷酶的混合酶处理丹参和三七混合药材的方法。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
一种丹酚酸酶，能水解丹酚酸B，使之变成丹参素、咖啡酸和其二聚体化合物，来源于微生物包括曲霉菌、细菌或酵母菌，丹参植物或谷物芽，通过下述方法制得：
用在液态或者固态用丹酚酸B诱导培养所述的微生物，其中固态培养之后用缓冲液
浸出、离心除渣得酶液；液态培养后，离心除渣得酶液；或者
将丹参植物破碎，用缓冲液浸出，离心除渣得酶液；或者
将谷物芽破碎，用缓冲液浸出，离心除渣得酶液；
其中任选地包括将酶液浓缩，再用缓冲液溶解，除渣得所述的丹酚酸酶浓缩液。
所述的丹酚酸酶的制备方法还可以进一步包括浓缩的步骤，其中所述的浓缩是采取加入硫酸铵或者乙醇沉淀酶蛋白的方法，其中所述的缓冲液为醋酸、磷酸、Tris或NaCl，缓冲液的浓度为0.001-0.5M，pH为3-10。
所述的丹酚酸酶转化丹酚酸B的方法，包括使丹酚酸酶与丹酚酸B单体和/或含有丹酚酸B的药材和/或其提取物中丹酚酸B反应的步骤，反应温度20-70℃，反应时间为10-40小时。
一种丹酚酸酶和三七人参皂苷酶的混合酶，来源于微生物包括曲霉菌、细菌或酵母菌，丹参植物或谷物芽，通过下述方法制得：
在液态或者固态用丹酚酸B和三七人参皂苷诱导培养所述的微生物，其中固态培养
之后用缓冲液浸出、离心除渣得酶液；液态培养后，离心除渣得酶液；或者
将丹参和三七植物破碎，用缓冲液浸出，离心除渣得酶液；或者
将谷物芽破碎，用缓冲液浸出，离心除渣得酶液；
其中任选地包括将酶液浓缩，再用缓冲液溶解，除渣得所述的丹酚酸酶浓缩液。
所述的酶的制备方法还可以进一步包括浓缩的步骤，其中所述的浓缩是采取加入硫酸铵或者乙醇沉淀酶蛋白的方法，其中所述的缓冲液为醋酸、磷酸、Tris或NaCl，缓冲液的浓度为0.001-0.5M，pH为3-10。
一种处理丹参和三七混合药材或提取物的方法，该方法能使丹参中的丹酚酸B转化为丹参素、咖啡酸和其和二聚体，使三七皂苷转化为活性更高的Rg3、C-K、Rg2、Rh2、Rh1次生皂苷和苷元，方法如下：
使丹酚酸酶和三七人参皂苷酶的混合酶和丹参、三七混合药材反应，反应温度20-70℃，反应时间为10-50小时；或者
将曲霉菌、细菌或酵母菌直接接种到丹参或丹参和三七的混合药材中，发酵培养3-8天；或者
使丹参和三七的混合药材自身的酶发挥丹酚酸酶或三七人参皂苷酶作用，包括以下步骤：丹参和三七生药材或者干药材加2-20倍水、混合，泡开药材，迅速加热至100℃并保持2-5分钟，然后迅速冷却至50℃，保持原酶活的60％以上，在50-90℃并保持酶反应0.5-2小时；在100-120℃灭酶1-2小时。
丹酚酸酶和三七皂苷酶的混合酶处理丹参和三七混合药材，使其丹酚酸B和三七皂苷转化成活性更高的丹参素、丹参素咖啡酸二具体，Rg3、C-K、Rg2、Rh2、Rh1次生皂苷；还可以进一步制备其水溶性成分和脂溶性成分。水溶性成分和脂溶成分经硅胶柱、C18硅胶柱、分子筛分离方法得到丹参素、咖啡酸和其二聚体、丹参酮和三七皂苷酶转化的单体。上述酶转化提取成分，活性更高，可用于医药、功能食品和功能化妆品。
定义
丹酚酸酶：本发明所述的丹酚酸酶是指水解丹酚酸B，变成丹参素、咖啡酸和其二聚体化合物的酶。
丹酚酸酶活力单位的定义：精确称取1g丹参原生药粗粉，加入5毫升0.02摩尔、pH5.0醋酸缓冲液，再加入3毫升酶液，于40℃下进行反应10-20小时，煎煮灭酶，溶液过滤定容到18毫升，做薄层层稀(TLC)，硅胶版为Silica Gel 60F254，点样量10μL，展开剂为乙酸乙脂∶甲酸＝7∶1(V∶V)，展开后用三氯化铁溶液显色，再用工具Bandscan测定丹参素斑点，与丹参素标准品斑点比较计算产物丹参素的产率。上述条件下每小时生成0.1摩尔丹参素所用的丹酚酸酶量为一个酶活力单位。
本发明所述的三七人参皂苷酶，包括三七二醇皂苷酶和三七三醇皂苷酶：三七二醇皂苷酶是指水解三七二醇皂苷Rb1、Rd的糖基，变成Rg3、Rh2、C-K和其苷元的酶；三七三醇皂苷酶是指水解三七三醇皂苷Re、R1、Rg1的糖基，变成Rg2、Rh1和其苷元的酶
三七的二醇皂苷酶活力单位的定义：酶反应底物为20毫摩尔、pH0.5的醋酸缓冲液(含20％乙醇)的0.02摩尔的三七(人参)皂苷Rb1。0.5毫升的Rb1和0.5毫升的酶混合，在40℃反应10-20小时，加入1毫升水饱和正丁醇摇匀使皂苷转入正丁醇层。用薄层层稀(TLC)方法测定正丁醇层的Rb1，硅胶版为Silica Gel 60 F254，点样量10μL，展开剂为氯仿∶甲酸∶水＝7∶3∶0.5(V∶V，下层)，展开后用10％硫酸显色，用工具Bandscan测定Rb1斑点，计算Rb1的减少量。上述条件下每小时减少1摩尔Rb1所用的酶量为一个三七二醇皂苷酶活力单位。
三七的三醇皂苷酶活力单位的定义：酶反应底物为0.02摩尔、pH0.5的醋酸缓冲液(含20％乙醇)的20毫摩尔的三七(人参)皂苷Re。0.5毫升的Re和0.5毫升的酶混合，在40℃反应10-20小时，加入1毫升水饱和正丁醇摇匀使皂苷转入正丁醇层。用薄层层稀(TLC)方法测定正丁醇层的Re，硅胶版为Silica Gel 60 F254，点样量10μL，展开剂为氯仿∶甲酸∶水＝7∶3∶0.5(V∶V，下层)，展开后用10％硫酸显色，用工具Bandscan测定Re斑点，计算Re的减少量。上述条件下每小时减少1摩尔Re所用的酶量为一个三七三醇皂苷酶活力单位。
具体实施方式
本发明的丹酚酸酶，来源于微生物包括曲霉菌、细菌或酵母菌，丹参植物或谷物芽。从微生物中制备丹酚酸酶的方法：
用在液态或者固态用丹酚酸B诱导培养所述的微生物，其中固态培养之后用缓冲浸出、离心除渣得酶液；液态培养后，离心除渣得酶液。
其中所述的液态培养是加入诱导物丹酚酸酸B、或0.1％-3％的丹参粉、或相当于0.1％-3％丹参干物的丹参提取物，发酵培养2-8天；固态培养时加入培养基1％-30％的丹酚酸酸B和/或丹参粉和/或丹参提取物，培养2-8天。上述酶液还可以进一步用如下方法得到浓缩酶，其酶液中加入硫酸铵或者乙醇而沉淀酶蛋白，收集沉淀再用原酶液1/5到1/10的缓冲液溶解，离心除渣得到所述的酶的浓缩液；其中所述的缓冲液为醋酸、磷酸、Tris、NaCl等缓冲液，缓冲液的浓度为0.001-0.5M，pH为3-10。
所述的曲霉菌是曲霉属(Aspergillus genus)菌，优选的是黑曲霉菌Aspergillusniger和米曲霉菌Aspergillus oryzae。所述的细菌包括乳杆菌属(Lactobacillus genus)菌、芽孢杆菌属(Bacillus genus)菌，更优选芽孢杆菌Bacillus sp.JF2。所述的酵母菌包括假丝酵母属(Candida genus)、酿酒酵母属(Sacharomyces genus)和罗伦隐球酵母菌(Cryptociccus laurentii)；更优选的是罗伦隐球酵母菌(Cryptociccus laurentii)。
从谷物芽中制备丹酚酸酶的方法：
其谷物芽是可以是任何谷物的芽，包括但不限于麦芽、玉米芽或高粱芽，优选麦芽。谷物芽的丹酚酸酶与三七皂苷酶混合酶制备方法是，大麦、小麦、玉米或高粱，先浸水、在谷物发芽中过程中喷射含丹酚酸的物质，如丹参药材或提取物诱导产酶，发芽温度12-25℃，发芽时间是3-6天，然后用缓冲液浸出谷物芽，离心除渣得酶液；其酶液用如下方法得到浓缩酶，其中任选地包括加入硫酸铵或者乙醇而沉淀酶蛋白，再用缓冲液溶解，除渣得到所述的酶的浓缩液；其中所述的缓冲液为醋酸、磷酸、Tris、NaCl等缓冲液，缓冲液的浓度为0.001-0.5M，pH为3-10。
从丹参植物种制备丹酚酸酶的方法：
丹参药材与2-20倍水混合，泡开药材，升温90-100℃处理2-5分钟，迅速冷却至50℃，离心除渣得酶液；其酶液用如下方法得到浓缩酶，其中任选地包括加入硫酸铵或者乙醇而沉淀酶蛋白，再用缓冲液溶解，除渣得到所述的酶的浓缩液；其中所述的缓冲液为醋酸、磷酸、Tris、NaCl等缓冲液，缓冲液的浓度为0.001-0.5M，pH为3-10。
本发明的丹酚酸酶，能使丹酚酸B转化为丹参素、咖啡酸和其二聚体化合物，转化方法包括使丹酚酸酶与丹酚酸B单体和/或含有丹酚酸B的药材和/或其提取物中丹酚酸B反应的步骤，反应温度20-70℃，优选温度40-50℃；反应时间为10-40小时、优选时间15-20小时。
酶与丹参药材反应后，用氨水调pH至8-10，加热100-120℃、20-60分钟使酶蛋白沉淀，过滤、减压浓缩、干燥得酶转化得丹参素、咖啡酸、其2分子聚体的混合物。其渣用乙醇或者甲醇提取脂溶性成分丹参酮。
本发明提供一种丹酚酸酶和三七人参皂苷酶的混合酶，来源于微生物包括曲霉菌、细菌或酵母菌，丹参植物或谷物芽。
丹酚酸酶与三七皂苷酶混合酶的微生物诱导发酵制备方法：曲霉菌、细菌或酵母菌可用液态发酵或者固态发酵法制备酶；液态发酵产酶加入培养基0.1％-3％丹酚酸酸B和/或丹参粉和/或丹参提取物，以及三七人参皂苷和/或三七粉和/或三七提取物，其量相当于0.1％-3％的药材干物，发酵培养2-8天、离心除渣，得到酶液；固态培养时加入丹酚酸酸B和/或丹参粉和/或丹参提取物，以及三七人参皂苷和/或三七粉和/或三七提取物，其量相当于0.1％-3％的药材干物，培养2-8天；用缓冲液浸出、离心除渣得酶液；液态培养后，离心除渣得酶液。上述酶液用如下方法得到浓缩酶，其酶液中加入硫酸铵或者乙醇而沉淀酶蛋白，收集沉淀再用原酶液1/5到1/10的缓冲液溶解，离心除渣得到所述的酶的浓缩液；其中所述的缓冲液为醋酸、磷酸、Tris、NaCl等缓冲液，缓冲液的浓度为0.001-0.5M，pH为3-10。
所述的曲霉菌是曲霉属(Aspergillus genus)菌，更优选的是黑曲霉菌Aspergillusniger和米曲霉菌Aspergilius oryzae。
所述的细菌包括乳杆菌属(Lactobacillus genus)菌、芽孢杆菌属(Bacillus genus)菌，更优选芽孢杆菌Bacillus sp.JF2。
所述的酵母菌包括假丝酵母属(Candida genus)、酿酒酵母属(Sacharomyces genus)和罗伦隐球酵母菌(Cryptociccus laurentii)；更优选的是罗伦隐球酵母菌(Cryptociccuslaurentii)。
本发明还提供一种从谷物芽中制备丹酚酸酶与三七皂苷酶混合酶的方法，其谷物芽可以包括但不限于麦芽、玉米芽或高粱芽。谷物芽的丹酚酸酶与三七皂苷酶混合酶制备方法是，大麦、小麦、玉米或高粱，先浸水、在谷物发芽中过程中喷射丹参或/和三七提取物诱导产酶，发芽温度12-25℃，发芽时间是3-6天，然后用缓冲液浸出谷物芽，离心除渣得酶液；其酶液用如下方法得到浓缩酶，其中任选地包括加入硫酸铵或者乙醇而沉淀酶蛋白，再用缓冲液溶解，除渣得到所述的酶的浓缩液；其中所述的缓冲液为醋酸、磷酸、Tris、NaCl等缓冲液，缓冲液的浓度为0.001-0.5M，pH为3-10。
酶转化方法是用上述的微生物酶和谷物芽酶处理丹酚酸酸B和/或丹参粉和/或丹参提取物，以及三七人参皂苷和/或三七粉和/或三七提取物，其中丹参和三七混合药材中三七的重量百分含量为5-80％，优选20-30％。其中反应温度为20-70℃、优选温度40-50℃；反应时间为10-40小时、优选时间15-20小时。如果是药材，则优选丹参和5-80％三七的混合药材，酶和丹参、三七混合药材反应，反应温度20-70℃，反应时间为10-50小时。
或者也可以将曲霉菌、细菌或酵母菌直接接种丹参和三七混合药材中，培养其微生物、微生物生长过程中产生的酶转化丹参或丹参和三七混合药材成分丹酚酸B转化成丹参素、咖啡酸、其2分子聚体；使三七中的主要皂苷Rb1、Rg1、R1、Rd、Re转化为活性更高的Rg3、C-K、Rg2、Rh1次生皂苷和苷元。混合药材中，含5-80％三七。培养温度25-40℃，培养3-8天。发酵培养3-6天；能使85-95％丹酚酸B或者丹参药材中70-95％丹酚酸B转化成丹参素、咖啡酸、其2分子聚体；使三七中的50-90％的主要皂苷Rb1、Rg1、R1、Rd、Re转化为活性更高的Rg3、C-K、Rg2、Rh1次生皂苷和苷元。所述的曲霉菌是曲霉属(Aspergillus genus)菌，更优选的是黑曲霉菌Aspergillus niger和米曲霉菌Aspergillus oryzae。所述的细菌包括乳杆菌属(Lactobacillus genus)菌、芽孢杆菌属(Bacillus genus)菌，更优选芽孢杆菌Bacillus sp.JF2。所述的酵母菌包括假丝酵母属(Candida genus)、酿酒酵母属(Sacharomyces genus)和罗伦隐球酵母菌(Cryptociccus laurentii)；更优选的是罗伦隐球酵母菌(Cryptociccus laurentii)。
本发明还提供使丹参和三七自身的酶发挥丹酚酸酶或三七人参皂苷酶作用，转化的方法。其方法为，丹参和5-80％三七的混合药材与2-20倍水混合，泡开药材，升温90-100℃处理2-5分钟，迅速冷却至50℃，使丹酚酸酶、三七二醇皂苷酶、三七三醇皂苷酶保持60％活性，酶反应0.5-1.5小时，在100-120℃灭酶30分钟到2小时，使丹参的70-95％丹酚酸B转化成丹参素、咖啡酸、其2分子聚体；使三七中的50-90％主要皂苷Rb1、Rg1、R1、Rd、Re转化为活性更高的Rg3、C-K、Rg2、Rh2、Rh1次生皂苷和苷元。
丹参以及丹参和三七的混和药材，经过所述的丹酚酸酶和三七人参皂苷酶的混合酶处理后，或者用微生物直接培养转化后，或者使其自身的丹酚酸酶和三七人参皂苷酶发挥作用后，可以进一步提取水溶性成份，所余药渣进一步提取脂溶性成分的步骤。
其中提取水溶性成分的方法可以是现有技术中任何提取中药材水溶性成分的方法，例如可以包括以下步骤：反应物水煎、过滤、减压浓缩、干燥得水溶性成分。
其中提取脂溶性成分可以是现有技术中任何提取中药材脂溶性成分的方法，例如可以包括以下步骤：药渣用5-30倍乙醇或者甲醇提取，减压浓缩、真空干燥、得到脂溶性成分。
为了得到丹参素、咖啡酸和起二聚体、丹参酮和三七皂苷酶转化的单体，还可以进一步包括将水溶性成分和脂溶成分经常规的硅胶柱、C18硅胶柱、分子筛分离方法。
本发明由于丹参和三七主要有效成分转化成更有效的成分，提高提取物的药效，可用于医药、保健食品和功能化妆品。用实施例进一步说明。
如下实施例中所采用的分析方法：
反应物和反应产物的测定：
1)丹参水溶性丹酚酸B，酶反应产物：丹参素、咖啡酸及二聚体产物的薄曾层析(TLC)和高效液相色谱(HPLC)方法测定，按照文献；关丹等，大连轻工业学院学报，26(3)，193-195，2007的方法测定。
2)丹参酮的薄曾层析(TLC)和高效液相色谱(HPLC)方法测定，按照文献；沈雁等，大连轻工业学院学报，26(1，21-23，2007的方法测定。
3)三七皂苷的薄曾层析(TLC)和高效液相色谱(HPLC)方法测定，按照文献薛丽丽等，大连轻工业学院学报，26(1)，1-4，2007的方法测定。
本发明中的中的微生物菌种，除了芽胞杆菌Bacillus sp.JF2以外，全部从中国科学院微生物研究所菌种保藏所得到；中国科学院微生物研究所、中国微生物菌种管理委员会普通微生物中编，菌种目录，科学出版社，1982年出版)。芽胞杆菌Bacillus sp.JF2按照文献的方法得到(金凤燮、Fengxie Jin et al：J.Gen.Appl.Microbiol.，38，293-302，1992)。
实施例1
黑曲霉(Aspergillus niger)菌接种针在液体发酵培养基含相当于1％丹参干物的水提取液、相当于1％三七干物的提取液、麦芽汁和自来水(最终麦芽汁浓度为5°)的500毫升，在30℃振荡培养3-5天，离心除去杂质，收集含酶的上清液。上清液量出一定体积在磁力搅拌条件下加入适量硫酸铵粉末调饱和度至75％，放入4℃冰箱静置、沉淀12hr(沉淀蛋白质)后在13000r.p.m下冷冻离心20分钟，收集沉淀，用0.02摩尔醋酸缓冲液透析，每4小时更换一次缓冲液，离心除渣，得浓缩酶液。酶转化试验：
150克丹参粉、50克三七粉和400毫升水混合，100-120℃灭菌20分钟，冷却，加入150毫升上述酶液，在40℃反应20小时；加水1000毫升，水煎1小时，使酶蛋白沉淀，过滤得到上清；其渣再用加水1000毫升水煎0.5小时，过滤得到上清；合并上清掖，减压浓缩，真空干燥得16-18克的酶转化的丹参和三七水溶性成分。其渣再用1000毫升的95％乙醇回流提取1.5小时提取脂溶性成分，再重复二次，过滤合并上清，减压浓缩，干燥得7-10克脂溶性成分。
用薄层层稀(TLC)、高效掖相色谱(HPLC)方法测定上述提取的水溶性成分和脂溶性成分的分析结果：水溶性成分中90％丹酚酸B转化为丹参素、咖啡酸和丹参素和咖啡酸1-2分子聚合体，丹参素含量比原药材提高了4-9倍；酶转化产的Rg2、Rh1的含量提高了5-12倍。脂溶性成分中丹参酮量与原药材提取相当，酶转化产的Rg3、C-K、Rh2的含量提高了7-15倍。
上述提取的水溶性成分和脂溶性成分合并，取1克溶于20毫升甲醇中，过滤取上清，用薄层层稀(TLC)、高效掖相色谱(HPLC)方法分析结果；原三七中的60-80％主要皂苷Rb1、Rg1、R1、Rd、Re转化为活性更高的Rg3、C-K、Rh2、Rg2、Rh1次生皂苷。也就是说，丹参和三七皂苷酶转化提取后，比原药材提取，90％丹酚酸B转化为丹参素、咖啡酸和丹参素和咖啡酸1-2分子聚合体，丹参素含量比原药材提高了4-9倍，丹参酮量与原药材提取相当；原三七中的60-80％主要皂苷Rb1、Rg1、R1、Rd、Re转化为活性更高的次生皂苷。
实施例2
米曲霉(Aspergillus oryzae)菌接种针在1000克的75％麦夫、10％丹参、15％粉、100％自来水的固体培养基中，在30℃培养3-5天，用5升的0.05摩尔、pH0.5的醋酸缓冲液浸酶1小时，离心除去杂质，收集上清液，加入13升的95％乙醇沉淀酶，收集沉淀，溶于600毫升0.02摩尔、pH0.5的醋酸缓冲液中，离心除渣，得浓缩酶液。丹酚酸酶、人参二醇皂苷酶、人参三醇皂苷酶活力测定方法与实施例1相同。酶转化试验：
160克丹参粉、40克三七粉和400毫升水混合，100-120℃没菌20分钟，冷却，加入100毫升上述酶液，在40℃反应20小时；加水1000毫升，水煎1小时，使酶蛋白沉淀，过滤得到上清；其渣再用加水1000毫升水煎0.5小时，过滤得到上清；合并上清掖，减压浓缩，真空干燥得16-18克的酶转化的丹参和三七水溶性成分。其渣再用1000毫升的95％乙醇回流提取1.5小时提取脂溶性成分，再重复二次，过滤合并上清，减压浓缩，干燥得7-10克脂溶性成分。
用薄层层稀(TLC)、高效掖相色谱(HPLC)方法测定上述提取的水溶性成分和脂溶性成分的分析结果：水溶性成分中90％丹酚酸B转化为丹参素、咖啡酸和丹参素和咖啡酸1-2分子聚合体，丹参素含量比原药材提高了5-9倍；酶转化产的Rg2、Rh1的含量提高了6-12倍。脂溶性成分中丹参酮量与原药材提取相当，酶转化产的Rg3、C-K、Rh2的含量提高了7-15倍。
上述提取的水溶性成分和脂溶性成分合并，取1克溶于20毫升甲醇中，过滤取上清，用薄层层稀(TLC)、高效掖相色谱(HPLC)方法分析结果；原三七中的70-90％主要皂苷Rb1、Rg1、R1、Rd、Re转化为活性更高的Rg3、C-K、Rh2、Rg2、Rh1次生皂苷。也就是说，丹参和三七皂苷酶转化提取后，比原药材提取，90％丹酚酸B转化为丹参素、咖啡酸、丹参素和咖啡酸1-2分子聚合体，丹参素含量比原药材提高了4-9倍，丹参酮量与原药材提取相当；原三七中的70-90％主要皂苷Rb1、Rg1、R1、Rd、Re转化为活性更高的次生皂苷。
实施例3：
100克丹参切片、或者70克丹参和30克三七切片分别加入100毫升水，在110℃没菌10-20分钟，冷却，接黑曲霉菌(Aspergillus niger)，在28-30℃培养3-6天，分别加入700毫升水，在100-120℃水浸2小时，分离上清；其渣再用500毫升水在100-120℃水浸1小时，分离上清；合并上清，减压浓缩干燥得水溶性物9克。其渣用乙醇提取的4克脂溶性物。上述水溶性物和脂溶性物混合，用薄层层稀(TLC)、高效掖相色谱(HPLC)方法分析结果，原药材提取，90％丹酚酸B转化为丹参素、咖啡酸、丹参素和咖啡酸1-2分子聚合体，丹参素含量比原药材提高了5-9倍，丹参酮量与原药材提取相当；原三七中的70-90％主要皂苷转化为活性更高的Rg3、C-K、Rh2、Rg2、Rh1次生皂苷。
实施例4：
谷物芽酶：大麦1.2公斤，水洗后16℃水浸20小时，空水、喷洒1克丹参和1克三七用50毫升水提取物，在16℃发芽，每各6小时喷水，发芽4天，干燥、去绿芽，粉碎，加入5升的0.02摩尔，pH5的醋酸缓冲液，浸1小时，取上清加入13升95％乙醇，沉淀酶蛋白，收集沉淀，用500毫升5升的0.2摩尔，pH5的醋酸缓冲液溶解，除去不溶物，即为麦芽酶液。
40克丹参、10克三七粉和00毫升水混合，110℃没菌10-20分钟，冷却，加入100毫升麦芽酶，在50℃反应16-20小时，加入250毫升水，100-120℃水浸1-2小时，过滤得上清，减压浓缩、干燥的4.3克水溶成分。其渣用乙醇提取得脂溶性成分。
上述水溶性物和脂溶性物混合，用薄层层稀(TLC)、高效掖相色谱(HPLC)方法分析结果，原药材提取，75％丹酚酸B转化为丹参素、咖啡酸、丹参素和咖啡酸1-2分子聚合体，丹参素含量比原药材提高了4-6倍，丹参酮量与原药材提取相当；原三七中的50-70％主要皂苷Rb1、Rg1、R1、Rd、Re转化为活性更高的Rg3、C-K、Rg2、Rh2、Rh1次生皂苷和苷元。
玉米或者高粱上述方法制备酶，转化丹参和三七得到相同的结果。
实施例5：
实施例1、2、3或者4的酶对丹酚酸B的转化：0.5克的丹酚酸B溶解于25毫升的0.1摩尔、pH5的醋酸缓冲液中溶解，与15毫升实施例1的酶液或者实施例2的酶液混合，在40℃反应20小时，用氨水调pH至8，加入110毫升95％乙醇沉淀酶蛋白，过滤，上清减压浓缩，真空干燥的0.6克的反应产品，用薄层层稀(TLC)、高效掖相色谱(HPLC)方法分析结果，反应产品中20-30％是丹参素。
实施例1、2、3或者4的酶与丹参药材反应：20克丹参粉中加水30毫升，110℃每菌20分钟，冷却、加入上述酶液，在40℃反应20小时，用氨水调pH至8-10，加热100-120℃20-60分钟使酶蛋白沉淀，过滤、减压浓缩、干燥得2克水溶性成分。其渣用20倍的95％乙醇提取得0.6克脂溶性成分。用薄层层稀(TLC)、高效掖相色谱(HPLC)方法分析结果：水溶性成分主要含丹参素、咖啡酸、其2分子聚体；脂溶性成分主要含丹参酮：丹参酮II-a、隐丹参酮和丹参酮I。
实施例6：
微生物直接培养转化：40克丹参、10克三七粉和300毫升水混合，110℃没菌10-20分钟，冷却，接芽孢杆菌(Bacillus sp.JF2，文献：金凤燮、Fengxie Jin et al：J.Gen.Appl.Microbiol.，38，293-302，1992)，在45℃震荡培养3-5天，100-110℃没菌60-90分钟，离心分离上清；其渣用300毫升水在100-110℃浸出60分钟，离心分离上清；合并上清，减压浓缩干燥得水溶性物5克。其渣用乙醇提取的2克脂溶性物。
上述水溶性物和脂溶性物混合，用薄层层稀(TLC)、高效掖相色谱(HPLC)方法分析结果，原药材提取，90％丹酚酸B转化为丹参素、咖啡酸、丹参素和咖啡酸1-2分子聚合体，丹参素含量比原药材提高了5-9倍，丹参酮量与原药材提取相当；原三七中的70-90％主要皂苷转化Rb1、Rg1、R1、Rd、Re为活性更高的Rg3、C-K、Rh2、Rg2、Rh1次生皂苷。
实施例7：
70克丹参、30克三七粉和100毫升水混合，110℃没菌10-20分钟，冷却，接罗伦隐球酵母菌(Cryptociccus laurentii)，在28℃固体培养3-5天，加入500毫升水100-110℃没菌60-90分钟，离心分离上清；其渣用400毫升水在100-110℃浸出60分钟，离心分离上清；合并上清，减压浓缩、干燥得水溶性物8.5克。其渣用乙醇提取的4克脂溶性物。
上述水溶性物和脂溶性物混合，用薄层层稀(TLC)、高效掖相色谱(HPLC)方法分析结果，原药材提取，80％丹酚酸B转化为丹参素、咖啡酸、丹参素和咖啡酸1-2分子聚合体，丹参素含量比原药材提高了5-7倍，丹参酮量与原药材提取相当；原三七中的40-60％主要皂苷Rb1、Rg1、R1、Rd、Re转化为活性更高的Rg3、C-K、Rg2、Rh2、Rh1次生皂苷和苷元。
实施例8：
使三七的自身酶(文献：张春枝…金凤燮：Chem.Pharm.Bull.，49(7)，795-798，2001；Process Biochem.，37，793-798，2002的方法提取自身酶)、丹参自身酶发挥作用酶转化方法：生丹参350克和生三七150绞碎，加入1000毫升水混合，迅速加热至100℃2-5分钟，迅速冷却至50℃，此时的保留的丹酚酸酶、三七二醇皂苷酶、三七三醇皂苷酶活力60％以上，在50-90℃保温反应1-2小时；在100-120℃灭酶1-2小时，分离上清；其渣再用1500毫升水在100-120℃水浸0.5-1.5小时，分离上清；合并上清，减压浓缩干燥得水溶性物12克。其渣用乙醇提取的5克脂溶性物。
或者生晒的丹参粉70克、生晒的三七粉30克，加入400毫升水混合，迅速加热至100℃2-5分钟，迅速冷却至50℃，此时的保留的丹酚酸酶、三七二醇皂苷酶、三七三醇皂苷酶活力60％以上，在50-90℃保温反应1-2小时；在100-120℃灭酶1.5-2小时，分离上清；减压浓缩干燥得水溶性物12克。其渣用乙醇提取的5克脂溶性物。
上述水溶性物和脂溶性物混合，用薄层层稀(TLC)、高效掖相色谱(HPLC)方法分析结果，原药材提取，90％丹酚酸B转化为丹参素、咖啡酸、丹参素和咖啡酸1-2分子聚合体，丹参素含量比原药材提高了5-9倍，丹参酮量与原药材提取相当；原三七中的40-60％主要皂苷Rb1、Rg1、R1、Rd、Re转化为活性更高的Rg3、C-K、Rg2、Rh2、Rh1次生皂苷。
实施例9：
实施例1、2、3、4、6、7或者8中的丹参与三七混合药材酶转化反应后，提取水溶性成分和脂溶性成分的方法是：反应物水煎、过滤、减压浓缩、干燥的水溶性成分；主要含丹酚酸B转化成丹参素、咖啡酸、其2分子聚体，三七中Rb1、Rg1、R1、Rd、Re转化变成的Rg2、Rh1次生皂苷；其渣用5-30乙醇或者甲醇提取，减压浓缩、真空干燥、得到脂溶性成分，主要含原丹参药材的丹参酮(丹参酮II-a、隐丹参酮和丹参酮I)和三七皂苷转化的Rg3、Rh2、C-K和苷元。其水溶性成分和脂溶成分经常规的硅胶柱、C18硅胶柱、分子筛分离方法得到丹参素、咖啡酸和起二聚体、丹参酮和三七皂苷酶转化的单体。
用常用的硅胶柱、C18-硅胶柱方法，从上述酶转化得到的水溶性成分和脂溶成分中分离得到丹参素、和酶转化产的次生皂苷Rg3、C-K、Rg2、Rh2、Rh1；其反应生成人参次生皂苷按照文献(王铁生主编：中国人参，辽宁科学技术出版社，2001年，p691-696)方法分离，可以得到其单体。丹参酮成分用分子筛Sephadex LH-20的方法[文献：吉林师范大学学报(自然科学版)，2004年第二期，100-101]分离得到丹参酮II-a、隐丹参酮和丹参酮I。
Claims (21)
1.一种丹酚酸酶，能水解丹酚酸B，使之变成丹参素、咖啡酸和其二聚体化合物，来源于微生物包括曲霉菌、细菌或酵母菌，丹参植物或谷物芽，通过下述方法制得：
用在液态或者固态用丹酚酸B诱导培养所述的微生物，其中固态培养之后用缓冲液浸出、离心除渣得酶液；液态培养后，离心除渣得酶液；或者
将丹参植物破碎，用缓冲液浸出，离心除渣得酶液；或者
将谷物芽破碎，用缓冲液浸出，离心除渣得酶液；
其中任选地包括将酶液浓缩，再用缓冲液溶解，除渣得所述的丹酚酸酶浓缩液。
2.如权利要求1的酶，其制备方法还进一步包括浓缩的步骤，其中所述的浓缩是采取加入硫酸铵或者乙醇沉淀酶蛋白的方法，其中所述的缓冲液为醋酸、磷酸、Tris或NaCl，缓冲液的浓度为0.001-0.5M，pH为3-10。
3.如权利要求1或2的酶，其制备方法中所述的液态培养是加入诱导物丹酚酸酸B、或0.1％-3％的丹参粉、或相当于0.1％-3％丹参干物的丹参提取物，发酵培养2-8天；
固态培养时加入培养基1％-30％的丹酚酸酸B和/或丹参粉和/或丹参提取物，培养2-8天。
4.如权利要求3的酶，其中所述的曲霉菌是黑曲霉菌Aspergillus niger。
5.如权利要求3的酶，其中所述的曲霉菌是米曲霉菌Aspergillus oryzae。
6.如权利要求1或2的酶，其中所述的谷物芽是麦芽、玉米芽或高粱芽，在谷物发芽中过程中使之接触丹酚酸B或含有丹酚酸B的药材或药材提取物，发芽温度12-25℃，发芽时间是3-6天。
7.权利要求1～6的丹酚酸酶转化丹酚酸B的方法，包括使丹酚酸酶与丹酚酸B单体和/或含有丹酚酸B的药材和/或其提取物中丹酚酸B反应的步骤，反应温度20-70℃，反应时间为10-40小时。
8.一种丹酚酸酶和三七人参皂苷酶的混合酶，来源于微生物包括曲霉菌、细菌或酵母菌，丹参植物或谷物芽，通过下述方法制得：
在液态或者固态用丹酚酸B和三七人参皂苷诱导培养所述的微生物，其中固态培养之后用缓冲液浸出、离心除渣得酶液；液态培养后，离心除渣得酶液；或者
将丹参和三七植物破碎，用缓冲液浸出，离心除渣得酶液；或者
将谷物芽破碎，用缓冲液浸出，离心除渣得酶液；
其中任选地包括将酶液浓缩，再用缓冲液溶解，除渣得所述的丹酚酸酶浓缩液。
9.如权利要求8的酶，其制备方法还进一步包括浓缩的步骤，其中所述的浓缩是采取加入硫酸铵或者乙醇沉淀酶蛋白的方法，其中所述的缓冲液为醋酸、磷酸、Tris或NaCl，缓冲液的浓度为0.001-0.5M，pH为3-10。
10.如权利要求8或9的酶，其制备方法中所述的液态培养是加入诱导物丹酚酸酸B和/或丹参粉和/或丹参提取物，以及三七人参皂苷和/或三七粉和/或三七提取物，其量相当于0.1％-3％的药材干物；
固态培养时加入培养基0.01％-30％的丹酚酸B和/或丹参粉和/或丹参提取物，以及三七人参皂苷和/或三七粉和/或三七提取物，培养2-8天。
11.如权利要求10的酶，其中所述的曲霉菌是黑曲霉菌Aspergillus niger。
12.如权利要求10的酶，其中所述的曲霉菌是米曲霉菌Aspergillus oryzae。
13.如权利要求8或9的酶，其中所述的谷物芽是麦芽、玉米芽或高粱芽，在谷物发芽中过程中使之接触丹酚酸B或含有丹酚酸B的药材或其提取物，以及三七人参皂苷和/或含有三七人参皂苷的药材或其提取物，发芽温度12-25℃，发芽时间是3-6天。
14.一种处理丹参和三七混合药材或提取物的方法，该方法能使丹参中的丹酚酸B转化为丹参素、咖啡酸和其和二聚体，使三七皂苷转化为活性更高的Rg3、C-K、Rg2、Rh2、Rh1次生皂苷和苷元，方法如下：
使权利要求8～13任一权利要求的酶和丹参、三七混合药材反应，反应温度20-70℃，反应时间为10-50小时；或者
将曲霉菌、细菌或酵母菌直接接种到丹参或丹参和三七的混合药材中，发酵培养3-8天；或者
使丹参和三七的混合药材自身的酶发挥丹酚酸酶或三七人参皂苷酶作用，包括以下步骤：丹参和三七生药材或者干药材加2-20倍水、混合，泡开药材，迅速加热至100℃并保持2-5分钟，然后迅速冷却至50℃，保持原酶活的60％以上，在50-90℃并保持酶反应0.5-2小时；在100-120℃灭酶1-2小时。
15.如权利要求14的方法，其中所述的丹参和三七混合药材中三七的重量百分含量为5-80％。
16.如权利要求14的方法，还包括反应后提取水溶性成份，所余药渣进一步提取脂溶性成分的步骤。
17.如权利要求14的方法，其中所述的丹参和三七混合药材中三七的重量百分含量为5-80％。
18.如权利要求14的方法，还包括反应后提取水溶性成份，所余药渣进一步提取脂溶性成分的步骤。
19.如权利要求18的方法，其中提取水溶性成分包括以下步骤：反应物水煎、过滤、减压浓缩、干燥得水溶性成分。
20.如权利要求18的方法，其中提取脂溶性成分包括以下步骤：药渣用5-30倍乙醇或者甲醇提取，减压浓缩、真空干燥、得到脂溶性成分。
21.如权利要求18的方法，其中还可以进一步包括将水溶性成分和脂溶成分经硅胶柱、C18硅胶柱、分子筛分离方法得到丹参素、咖啡酸和其二聚体、丹参酮和三七皂苷酶转化的单体的步骤。
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