CN106434380A - 一种利用黄芪培养冬虫夏草菌的方法及其应用 - Google Patents
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Classifications
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Abstract
本发明涉及一种利用黄芪培养冬虫夏草菌的方法及其应用，所述方法是在冬虫夏草种子培养和/或发酵过程中，将黄芪添加到冬虫夏草菌的培养基中，继续按冬虫夏草常规工艺进行培养和发酵；所述冬虫夏草菌优选为无性型中华被孢霉、有性型中华被孢霉、虫草头孢霉、弯颈霉、束丝霉或蝙蝠蛾拟青霉。本发明提供的方法简单、方便，所需黄芪提取物少，成本低；菌种生长快、质佳，所得到的发酵液和菌丝体虫草素含量高。采用本发明所述方法培养所得的发酵液和菌丝体可用于生产虫草保健品。
Description
技术领域
本发明涉及微生物培养、发酵领域，具体涉及一种利用黄芪培养冬虫夏草菌的方法及其应用。
背景技术
冬虫夏草是我国的一种名贵、稀有中药，是麦角菌科真菌寄生在蝙蝠蛾幼虫形成的子座和幼虫尸体的复合体，主要产于西藏，青海，四川，云南等省的青藏高寒地区，冬虫夏草用药历史悠久，与人参、鹿茸并列三大滋补品之一，用于补益肺肾两虚，久咳，支气管炎，阳痿，月经不调，高血脂，心供血不足等症，具有抗肿瘤，增强免疫力、抗病毒，抗真菌等药理作用，科学研究发现冬虫夏草含有腺苷、虫草素、虫草酸，多糖等药物化学物质，是冬虫夏草发挥药效，也是制定冬虫夏草质量标准的重要物质基础，近几年，国内外科学家发现，虫草素能干扰基因细细RNA和DNA的合成，抑制癌细胞等不正常细胞的分裂，表现出很强的抗真菌、抗HlV－I型病毒和抑制梭菌活性，作为抗癌、抗病毒新药，虫草素在美国己通过FDA的安全评价，并进入到三期临床价段。
冬虫夏草菌是从新鲜、经消毒的冬虫夏草的虫体或子座中分离得到的一种药用真菌，用深层液体发酵生产得到的虫草菌丝，含有与野生冬虫夏草相同的药物成分，用冬虫夏草菌丝体制得多种药产品，如金水宝、百灵胶囊等作为国家一类新药已收入于中国药典，具有很好的市场前景。十多年来，国内许多单位，尽管已经对冬虫夏草菌的生长特征、发酵培养基优化和发酵工艺进行大量研究工作，冬虫夏草菌丝体活性成分还较低，特别是冬虫夏草菌丝体中虫草素含量更低，因此有必要提高冬虫夏草菌的虫草素含量。现有提高虫草素的技术方案一般是对发酵培养基进行改良，或在发酵过程，把一些化学物质，如油酸或其前体物类似物或植物生长调节剂等加入到发酵培养基中，由于发酵培养基体积大，所需原材料或添加物的重量大，成本高。很少见到通过对冬虫夏草菌种子培养基的研究，来提高虫草素含量的研究。因此，冬虫夏草真菌的种子培养和发酵工艺技术研究的创新，对提高发酵冬虫夏草菌发酵液和菌丝体的虫草素含量，改善冬虫夏草菌的产品质量和药用效果有积极意义。
黄芪是我国常用的药食同用传统中药之一，主产于我国东北、华北和西北各省，黄芪药用已有2000年历史，具有增强机体免疫力，抗衰老，调节血糖，改善心肌供血等功能。但至今未见黄芪用于调控微生物代谢报导，更未见黄芪用于促进虫草菌产生更高活性成分的报导。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，提出了一种利用黄芪培养冬虫夏草菌的方法，该方法是在冬虫夏草种子培养和/或发酵过程中，将黄芪粉碎物、黄芪提取液或黄芪粉末状提取物添加到所述培养基中，继续按冬虫夏草常规工艺进行培养和发酵，培养得到冬虫夏草发酵液和菌丝体。
本发明所述冬虫夏草菌是指从新鲜、经消毒的冬虫夏草的虫体或子座中分离得到的药用真菌；优选为本领域公知的无性型中华被孢霉、有性型中华被孢霉、虫草头孢霉、弯颈霉、束丝霉或蝙蝠蛾拟青霉。
本发明通过大量实践发现，将黄芪粉碎物、黄芪提取液或黄芪粉末状提取物用于冬虫夏草菌的培养过程，可以显著提高冬虫夏草菌的质量，尤其可以提冬虫夏草菌发酵液和菌丝中虫草素的含量，从而提高其药用价值。
具体而言，本发明所述方法包括以下步骤：将冬虫夏草菌接入种子培养基中进行种子培养，得种子液；将所述种子液接入发酵培养基中进行发酵培养；期间，将黄芪粉碎物、黄芪提取液或黄芪粉末状提取物添加到种子培养基或/和发酵培养基中。
本发明所述黄芪粉碎物、黄芪提取液或黄芪粉末状提取物在使用时，可以将其单独使用，或与已知的有利于冬虫夏草菌发酵的物质组合使用，也可以在优化培养基、优化培养条件后使用；可以在冬虫夏草菌的种子培养期或发酵期单独使用，或者在种子和发酵期组合使用。
为了更好地提高虫草素的含量，同时尽量减少黄芪的用量，本发明将黄芪粉碎物、黄芪提取液或黄芪粉末状提取物添加到所述种子培养基中。具体而言，优选在未接入种子前或接入种子后的指数生长期内将黄芪粉碎物、黄芪提取液或黄芪粉末状提取物添加到种子培养基中。
本发明还可以将黄芪粉碎物、黄芪提取液或黄芪粉末状提取物添加到所述发酵培养基中。具体而言，优选在所述发酵培养的延滞期或所述发酵培养的指数生长期，将黄芪粉碎物、黄芪提取液或黄芪粉末状提取物添加到所述发酵培养基中。
本发明还可以将黄芪粉碎物、黄芪提取液或黄芪粉末状提取物添加到所述种子培养基和发酵培养基中。优选在未接入种子前或种子生长到指数生长期内，和发酵培养的延滞期或指数生长期，将黄芪粉碎物、黄芪提取液或黄芪粉末状提取物添加到种子培养基和发酵培养基中。
本发明所述黄芪属于豆科多年生本草植物，栽种于我国东北、华北、西北各省，有野生或人工种植二种，也有一年生、二年生、三年生不同，但作为具有促进冬虫夏草菌产生更高活性成分的黄芪和作为制备提取物原料，均没有特别要求，只要是黄芪即可。作为制备提取物原料，以黄芪根为宜，但为了降低原料成本，黄芪茎或叶也可以采用。在本发明中，为显示更好的促进作用，或获得更好质量的提取物，或为获得高的提取率，本发明所述黄芪优选为三年生黄芪的根部。
为促进冬虫夏草菌产生更高活性成分的使用，可以把黄芪根干燥、粉碎、研磨或超微粉碎成微粉直接使用，也可以将黄芪根作原料，经提取、浓缩制备成稳定的提取液或粉末状提取物。
作为本发明的一种方案，所述黄芪粉碎物以黄芪根为原料，经机械粉碎后所得。优选其粒径为250～350目。
在实际添加时，本发明优选所述黄芪粉碎物在所述培养基中的添加量为4～6g/L。
作为本发明的一种方案，所述黄芪提取液由包括如下步骤的方法制备而成：取黄芪根干燥、粉碎后，加水，在40～70℃下，超声波负压回流提取20～40分钟，减压浓缩，即得黄芪提取液；所述黄芪提取液的体积ml相当于所述黄芪根质量g的0.5～1.5倍。
具体而言，本发明所述黄芪提取物的制备方法包括下列步骤：(1)原料干燥；(2)粉碎；(3)提取；(4)浓缩。
步骤(1)中，作为原料使用的黄芪根，新采收的含水量较高，从市场购买的黄芪，粉碎前需要进一步干燥脱水，干燥方法可用烘箱烘干，也可用干燥热风吹干，干燥温度没有特别限制，可以在80～90℃高温干燥或20～30℃低温干燥，在本发明所述方案中，优选在40～65℃干燥。
步骤(2)中，对于干燥的原料，为了提高提取效率，简单的切片达不到理想效果，要进一步粉碎，对粉碎方法本专利没有特别规定和要求，可以采用气流粉碎，也可以采用物理粉碎，如用研磨机、粉碎机粉碎或超微粉碎，粉碎过程最好可控制粉碎温度在40～65℃范围，优选具有降温条件的粉碎设备。
步骤(3)中，提取设备可用超声波提取器，也可采用多功能提取器，可在常压、负压力或脉冲压力下进行，对提取温度也没有严格限制，提取选用的溶剂可以是纯水或含有少量低级醇的水溶液，优选超声波提取器，纯水作溶剂，温度40～70度，负压力条件下，，超声提取时间20～40分钟。
步骤(4)中，提取液浓缩可以借用生物化工或植物提取物质的浓缩设备和方法，可采用陶瓷膜或管式膜过滤后，用纳滤浓缩或反渗透除去溶剂，也可以使用多效浓缩器减压浓缩蒸去溶剂，得到提取液。
在实际添加时，本发明优选所述黄芪提取液在所述培养基中的添加量为3～8ml/L。
作为本发明的一种方案，所述黄芪粉末状提取物是所述黄芪提取液经醇沉、干燥后所得。具体而言，为了对所述黄芪提取液进行进一步的纯化，可以在所述提取液中加入乙醇，静置后滤去上清液，得膏状物，再依次加入乙醇、丙酮溶液进行提纯，干燥，即得粉末状提取物。
本发明的中药和用上述提取方法提取分离得具有促进冬虫夏草菌产生更高活性成分的提取物，含有如下物质：黄芪多糖，黄芪总苷，还含有少量的蛋白质、氨基酸、黄酮、还原糖、矿物质。作为本发明的优选方案，所述黄芪粉末状提取物中黄芪多糖的含量大于60％，黄芪总皂苷的含量大于0.6％。
在实际添加时，本发明优选所述黄芪粉末提取物在所述培养基中的添加量为0.35～0.5g/L。
本发明采用的种子培养基中包含碳源、氮源以及无机盐。所述碳源、氮源以及无机盐均可选用本领域常规的组分。具体而言，所述碳源，可选用马铃薯或/和燕麦片以及葡萄糖或/和蔗糖，所述氮源，可选用蛋白胨以及酵母膏；所述无机盐可选用磷酸二氢钾以及硫酸镁。
为了确保各组分之间协同作用，进一步全面提高种子品质，本发明优选所述种子培养基中包含如下重量份的成分：马铃薯150～250份，葡萄糖10～20份，蛋白胨1～5份，酵母膏1～2份，磷酸二氢钾0.1～1份，硫酸镁0.1～1份。
优选地，所述种子培养基为液体培养基，其中包含如下成分：马铃薯150～250g/L，葡萄糖10～20g/L，蛋白胨1～5g/L，酵母膏1～2g/L，磷酸二氢钾0.1～1g/L，硫酸镁0.1～1g/L，蒸馏水余量。
本发明所述种子培养基，可按常规培养基的配制方法配制。如将上述质量配比称取原料，放入容器，加热，溶解，混合均匀后按常规灭菌方法灭菌即可。
为了确保各组分之间协同作用，进一步全面提高发酵产物的品质，本发明优选所述发酵培养基中包含如下重量份的成分：蔗糖5～10份，葡萄糖10～20份，蛋白胨5～10份，酵母膏2～3份，磷酸二氢钾0.1～1份，硫酸镁0.1～1份，维生素Bl 0.0001～0.001份。
优选地，所述发酵培养基为液体培养基，其中包含如下成分：蔗糖5～10g/L，葡萄糖10～20g/L，蛋白胨5～10g/L，酵母膏2～3g/L，磷酸二氢钾0.1～1g/L，硫酸镁0.1～1g/L，维生素Bl 0.1～1mg/L，蒸馏水余量。
本发明所述发酵培养基，可按常规培养基的配制方法配制。如将上述质量配比称取原料，放入容器，加热，溶解，混合均匀后按常规灭菌方法灭菌即可。
本发明所述培养可以指深层液体培养或固态培养，可以指虫草菌单菌培养或含有虫草菌的多菌混合培养。
具体而言，本发明所述种子培养方法以及发酵方法均为本领域常规操作，本发明不做特殊限定。
作为一种具体的实施方式，所述种子培养方法为：将母种接入种子培养基，在温度19～23℃、旋转速度为160～210r/min的摇瓶中培养36～48小时。
作为一种具体的实施方式，所述发酵培养方法为：将种子液接入发酵培养基，在温度20～25℃、旋转速度为150～200r/min的条件下，通气培养发酵48～80小时。
本发明进一步保护所述方法在制备虫草保健品中的应用。所述应用具体为：以所述方法培养得到的冬虫夏草菌发酵液和/或菌丝体为原料生产虫草保健品。
作为一种具体应用方式，本发明优选将所述发酵液按体积比1：0.8～1.4与纯粮米酒混合，均质，陈酿，得到虫草原浆保健酒。
为了提高所述保健酒的综合品质，使虫草素在陈酿过程中充分发挥作用，本发明优选所述纯粮米酒的酒精度为52～56度。在实际应用过程中，所述纯粮米酒可以用药酒代替，所述所述药酒的制备方法为：取人参25g、肉苁蓉30g、黄精20g为原料，加入500ml的酒度为56-62度纯粮米酒，在40-55℃的条件下超声回流提取30-50min，过滤得到药酒。
作为一种具体应用方式，本发明优选采用低级醇水溶液以及水溶液依次对所述菌丝体进行超声波提取，过滤后取滤液，浓缩滤液，得到冬虫夏草口服液。
为了提高提取效果，本发明优选将所述菌丝体以重量体积比(g/ml或kg/L)为1：8～12的比例分别先加入(30-70％)乙醇水溶液在温度55～95℃的条件下超声波提取2～3次，每次30-60min；再加入同样比例的水溶液在55～95℃条件下超声波提取2～3次，每次30～60min。
本发明创造性地将黄芪以黄芪粉碎物、黄芪提取液或黄芪粉末状提取物的形式应用于冬虫夏草菌的培养和/或发酵培养过程中。用本发明所述方法培养的菌种生长快、质量佳，。本发明通过在冬虫夏草菌特定的培养期添加黄芪粉碎物、黄芪提取液或黄芪粉末状提取物的形式，可显著提高发酵液以及菌丝体中虫草素含量。
本发明提供的方法，操作简便，不改变冬虫夏草菌原有的培养工艺条件，易于在工业生产中应用；本发明添加物黄芪是药食两用中药，安全无毒，来源方便，添加量少，成本低廉，可用于冬虫夏草保健品，医药品的工业生产。用本发明提供的方法生产冬虫夏草保健品，含有冬虫夏草和黄芪的药物成份，具有黄芪和冬虫夏草的药用和保健作用。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1
(1)黄芪超微粉的制备：
从药材市场购买产于山西的黄芪根，清除表面尘土，置鼓风电热干燥箱内，控制温度为55度，干燥10小时，切0.3cm小段，送入机械粉碎机间歇性粉碎，得60目细粉，喂入超微粉碎机间歇性控温粉碎，控制粉碎过程温度少于65度，得粒度300目的黄芪超微粉。所述黄芪超微粉可作为促进剂添加到冬虫夏草种子培养和/或发酵过程中。
(2)黄芪提取液的制备：
取所述黄芪超微粉100克，置超声波提取器，加入800毫升纯水，控制水温65度，超声提取功率300W，提取30分钟，滤出提取液，重复一次上述操作，合併提取液，置旋转薄膜浓缩器，控制水浴温度为65度，浓缩器真空度为0.097Mpa，得100毫升浅棕黄色溶液。所述黄芪提取液可作为促进剂添加到冬虫夏草种子培养和发酵过程中。
(3)黄芪粉末状提取物的制备：
取所述浅棕黄色溶液100ml，向其中加入600毫升95％乙醇，在温度6度下静置12小时，抽去上清液，向棕黄色膏状物中加入95％乙醇捣松散，静置，滤去上清液，用乙醇丙酮溶液进一步捣松脱水，在温度60度真空干燥，得7.43克棕黄色粉末状的提取物。该提取物含有黄芪多糖，皂苷外还可含有少量蛋白质、氨基酸、黄酮、还原性糖和矿物质。
据检测，所述黄芪粉末状的提取物中含有黄芪多糖63.4％，皂苷0.83％。所述黄芪粉末状提取物可作为促进剂添加到冬虫夏草种子培养和发酵过程中。
实施例2
采用西藏那曲地区天然冬虫夏草上分离纯化、并经菌种的培养特征、显微特征、rRNA基因序列等分子生物学鉴定为冬虫夏草的菌种。
按照以下步骤进行培养和发酵：
(1)将冬虫夏草菌种接入液体种子培养基，按常规方法培养种子液；
所述液体种子培养基的配方为：马铃薯200g/L，葡萄糖16g/L，蛋白胨3g/L，酵母膏1.5g/L，磷酸二氢钾0.5g/L，硫酸镁0.3g/L，蒸馏水余量；
在进行种子平行培养的情况下，在试验组所述种子培养的指数生长期向所述液体种子培养基中加入4g/L黄芪超微粉，作为试验组；未添加黄芪超微粉的作为对照组。
(2)将所述种子液接入液体发酵培养基，所述种子液的接入体积为所述液体发酵培养基体积的10％，按常规方法发酵，收集发酵液；
所述液体发酵培养基的配方为：蔗糖7g/L，葡萄糖15g/L，蛋白胨8g/L，酵母浸膏2.5g/L，磷酸二氢钾0.8g/L，硫酸镁0.5g/L，维生素B1 0.5mg/L，蒸馏水余量。
发酵结束后，分别收集试验组和对照组的冬虫夏草干燥菌丝体，高效液相色谱法测定试验组和对照组菌丝体中腺苷和虫草素的含量。
其中，所述干燥菌丝体的获取方法为：将发酵液在相对离心力12000g条件下离心15分钟，重复离心操作洗涤菌丝体二次，在65℃下干燥至恒重。
在进行高效液相色谱检测前，对所述干燥菌丝体进行如下前处理：精密称取菌丝体重量，加入流动相(甲醇：水＝60:40)，所述流动相体积ml相当于所述菌丝体重量g的10倍，在功率400W、频率30KHz的条件下超声处理30分钟，定容。
所述高效液相色谱法测定的条件为：采用C18柱(十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂)，以甲醇：水＝60:40为流动相，梯度洗脱，检测波长为260nm，柱温为25℃。
检测结果如表1所示。
表1：每100ml发酵液中菌丝体所含腺苷和虫草素含量
| 腺苷含量(mg/100ml) | 虫草素含量(mg/100ml) | |
| 对照组 | 3.05 | 0.041 |
| 试验组 | 4.13 | 0.512 |
实施例3
与实施例2相比，区别仅在于：在进行种子平行培养的情况下，试验组在所述种子培养基未接入种子前期向所述液体种子培养基中加入6g/L黄芪超微粉，作为试验组；未添加黄芪超微粉的作为对照组。
发酵结束后，分别取试验组和对照组冬虫夏草菌发酵液。按体积比为1：1.2的比例加入甲醇，在功率400W、频率30KHz的条件下超声处理30分钟，提取液按所述高效液相色谱法测定试验组和对照组发酵液中腺苷和虫草素的含量，检测结果如表2所示。
表2：每100ml发酵液中所含腺苷和虫草素含量
| 腺苷含量(mg/100ml) | 虫草素含量(mg/100ml) | |
| 对照组 | 2.99 | 0.042 |
| 试验组 | 4.37 | 0.407 |
实施例4
与实施例2相比，区别仅在于：在进行种子平行培养的情况下，试验组在所述种子培养基未接入种子前向所述液体种子培养基中加入5ml/L黄芪提取液，作为试验组；未添加黄芪提取液的作为对照组。
发酵结束，分别取试验组和对照组冬虫夏草菌发酵液。按体积比为1：1.2的比例加入甲醇，在功率400W、频率30KHz的条件下，超声处理30分钟，提取液按所述高效液相色谱法测定试验组和对照组发酵液中虫草素的含量，其中，实验组腺苷含量4.64mg/100ml，虫草素含量0.463mg/100ml，对照组腺苷含量3.17mg/100ml，虫草素含量0.038mg/100ml。
测定后按照实施例2所述方法分别收集1000ml试验组和对照组的冬虫夏草菌发酵液，将所述发酵液按体积比为1：1.1的比例加入的酒精度52-56度的纯粮米酒，经过均质机在操作压力为90MPa的条件下均质处理，陈酿后7-10天，得到2082ml草原浆保健酒。并测定试验组和对照组虫草原浆保健酒中虫腺苷和虫草素的含量，检测结果如表3所示
表3：每100ml发酵原浆保健酒所含的腺苷和虫草素含量
| 腺苷含量(mg/100ml) | 虫草素含量(mg/100ml) | |
| 对照组 | 1.49 | 0.020 |
| 试验组 | 2.30 | 0.232 |
实施例5
与实施例2相比，区别仅在于：在进行发酵平行培养的情况下，在所述发酵培养的发酵延滞期向所述液体发酵培养基中加入8ml/L黄芪提取液，作为试验组；未添加黄芪提取液的作为对照组。
发酵结束，按照实施例3所述方法测定试验组和对照组虫草原浆保健酒中腺苷和虫草素的含量，其中，实验组腺苷含量4.71mg/100ml，虫草素含量0.558mg/100ml，对照组腺苷含量3.43mg/100ml，虫草素含量0.041mg/100ml。
按照实施例2所述方法分别收集1000ml试验组和对照组发酵液的冬虫夏草干燥菌丝体，以1：10重量体积比(g/ml或kg/L)的比例，加入65％乙醇水溶液，在55-60℃条件下超声波提取3次，每次30min。过滤，合并滤液，减压浓缩蒸去乙醇水溶液，浓缩得58.6ml，然后加入同样比例的水溶液到滤渣中，在温度90-95℃的条件下超声波提取3次，每次30min；过滤，合并滤液，控制水浴温度为65-70度，浓缩器真空度为0.097Mpa，减压浓缩蒸去水溶液，浓缩得158.4ml，合并浓缩液得217ml，可用作为冬虫夏草口服液，并测定试验组和对照组中腺苷和虫草素的含量，检测结果如表4所示。
表4：每100ml口服液所含的腺苷和虫草素含量
| 腺苷含量(mg/100ml) | 虫草素含量(mg/100ml) | |
| 对照组 | 12.61 | 0.150 |
| 试验组 | 16.93 | 1.832 |
实施例6
与实施例2相比，区别仅在于：在进行发酵平行培养的情况下，在试验组所述发酵培养的指数生长期向所述液体发酵培养基中加入6ml/L黄芪提取液，作为试验组；未添加黄芪提取液的作为对照组。
发酵结束，分别按照实施例3所述方法测定试验组和对照组冬虫夏草菌发酵液中腺苷和中虫草素的含量后，分别收集2000ml试验组和对照组的冬虫夏草发酵液。用纳滤膜在操作压力为25MPa条件下，将所述发酵液纳滤浓缩到516ml发酵液，按体积比为1：1的比例加入的酒精度52-56度的纯粮米酒，在经过均质机在操作压力为90MPa的条件下均质处理，陈酿7-10天后得到虫草原浆保健酒。并测定试验组和对照组原浆保健酒中腺苷和虫草素的含量，检测结果如表5所示。
表5：每100ml原浆保健酒所含的腺苷和虫草素含量
实施例7
与实施例2相比，区别仅在于：在进行发酵平行培养的情况下，在所述发酵培养的发酵延滞期向所述液体发酵培养基中加入0.35g/L黄芪粉末提取物，作为试验组；未添加黄芪粉末提取物的作为对照组。
发酵结束，分别按照实施例3所述方法测定试验组和对照组冬虫夏草菌发酵液中腺苷和中虫草素的含量后，分别收集1000ml试验组和对照组的冬虫夏草发酵液。纳滤膜在操作压力为25MPa的条件下，将所述发酵液纳滤浓缩得487ml发酵液，按体积比为1：1.1的比例加入药酒，经过均质机在操作压力为90MPa的条件下均质处理，陈酿10天后，过滤滤除沉淀物，得808ml虫草保健药酒。其中，所述药酒的制备方法为：取人参25g、肉苁蓉30g、黄精20g为原料，加入500ml的酒度为56-62度纯粮米酒，在40-55℃的条件下超声回流提取30-50min，过滤得到药酒。
测定试验组和对照组虫草保健药酒中腺苷和虫草素的含量，检测结果如表6所示
表6：每100ml虫草保健药酒所含的腺苷和虫草素含量
| 腺苷含量(mg/100ml) | 虫草素含量(mg/100ml) | |
| 对照组 | 3.92 | 0.041 |
| 试验组 | 4.77 | 0.594 |
实施例8
与实施例2相比，区别仅在于：在进行平行培养的情况下，在所述种子培养基未接入种子前和发酵延滞期向所述液体种子培养基和发酵培养基中加入0.5g/L黄芪粉末提取物，作为试验组；未添加黄芪粉末提取物的作为对照组。
发酵结束，分别收集2000ml的试验组和对照组发酵液，用纳滤膜在25MPa条件下，把发酵液浓缩得657ml浓缩发酵液，然后按1：1.2体积比(ml/ml)，加入62度的纯粮米酒，经均质机在操作压力为90-105MPa条件下，均质处理3次，过滤滤除沉淀物，收集清液，在水浴温度为65-70度，浓缩器真空度为0.097Mpa条件下，把清液减压浓缩，蒸去乙醇和水，得791ml浓缩液,可用作为冬虫夏草口服液，并测定试验组和对照组浓缩液中腺苷虫和草素的含量，检测结果如表7所示。
表7：每100ml浓缩液所含的腺苷和虫草素含量
| 腺苷含量(mg/100ml) | 虫草素含量(mg/100ml) | |
| 对照组 | 9.07 | 0.101 |
| 试验组 | 15.10 | 1.489 |
实施例9
与实施例2相比，区别仅在于：在进行平行培养的情况下，在所述种子培养的指数生长期向所述液体种子培养基中加入3ml/L黄芪提取液，并在所述发酵培养的发酵延滞期或指数生长期向所述液体发酵培养基中加入5ml/L黄芪提取液，作为试验组；整个培养过程中均未添加黄芪提取液作为对照组。
发酵结束，分别收集2000ml试验组和对照组的冬虫夏草发酵液。用纳滤膜在25MPa条件下，将所述发酵液浓缩得648ml浓缩发酵液按体积比为1：1.1的比例加入酒精度62度的纯粮米酒，经过均质机处理2次(操作压力为90MPa)，陈酿15天，过滤，滤除沉淀物后，得958ml.酒精度31.8度的清液，可用作虫草保健酒958ml。并测定试验组和对照组虫草保健酒中腺苷和虫草素的含量，检测结果如表8所示
表8：每100ml虫草保健酒所含的腺苷和虫草素含量
| 腺苷含量(mg/100ml) | 虫草素含量(mg/100ml) | |
| 对照组 | 5.01 | 0.057 |
| 试验组 | 8.41 | 0.793 |
虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (10)
1.一种利用黄芪培养冬虫夏草菌的方法，其特征在于，在冬虫夏草种子培养和/或发酵过程中，将黄芪粉碎物、黄芪提取液或黄芪粉末状提取物添加到种子培养基和/或发酵培养基中；
所述冬虫夏草菌优选为无性型中华被孢霉、有性型中华被孢霉、虫草头孢霉、弯颈霉、束丝霉或蝙蝠蛾拟青霉。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，包括如下步骤：将冬虫夏草菌接入种子培养基中进行种子培养，得种子液；将所述种子液接入发酵培养基中进行发酵培养。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，将黄芪粉碎物、黄芪提取液或黄芪粉末状提取物添加到所述种子培养基中；优选在未接入种子前或接入种子到指数生长期内任意时间添加到所述种子培养基中；
或，将黄芪粉碎物、黄芪提取液或黄芪粉末状提取物添加到所述发酵培养基中；优选在所述发酵培养的延滞期或所述发酵培养的指数生长期添加到所述发酵培养基中；
或，将将黄芪粉碎物、黄芪提取液或黄芪粉末状提取物添加到所述种子培养基和发酵培养基中；优选在未接入种子前或种子指数生长期内添加到所述种子培养基中，并在发酵培养的延滞期或指数生长期添加到所述发酵培养基中。
4.根据权利要求1～3任意一项所述的方法，其特征在于，所述黄芪粉碎物是以黄芪根为原料经机械粉碎后得到，优选其粒径为250～350目；
优选地，所述黄芪粉碎物在所述培养基中的添加量为4～6g/L。
5.根据权利要求1～3任意一项所述的方法，其特征在于，所述黄芪提取液由包括如下步骤的方法制备而成：取黄芪根，干燥、粉碎后，加水，在40～70℃下超声回流提取20～40分钟，减压浓缩，即得黄芪提取液；以ml/g计，所述黄芪提取液的体积相当于所述黄芪根质量的0.5～1.5倍；
优选地，所述黄芪提取液在所述培养基中的添加量为3～8ml/L。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述黄芪粉末状提取物是所述黄芪提取液经醇沉、干燥后所得；
优选地，所述黄芪粉末状提取物在所述培养基中的添加量为0.35～0.5g/L。
7.根据权利要求1～6任意一项所述的方法，其特征在于，所述种子培养基包含如下重量份的成分：马铃薯150～250份，葡萄糖10～20份，蛋白胨1～5份，酵母膏1～2份，磷酸二氢钾0.1～1份，硫酸镁0.1～1份；
优选所述种子培养基为液体培养基，包含如下成分：马铃薯150～250g/L，葡萄糖10～20g/L，蛋白胨1～5g/L，酵母膏1～2g/L，磷酸二氢钾0.1～1g/L，硫酸镁0.1～1g/L，蒸馏水余量。
8.根据权利要求1～6任意一项所述的方法，其特征在于，所述发酵培养基包含如下重量份的成分：蔗糖5～10份，葡萄糖10～20份，蛋白胨5～10份，酵母膏2～3份，磷酸二氢钾0.1～1份，硫酸镁0.1～1份，维生素Bl 0.0001～0.001份；
优选所述发酵培养基为液体培养基，包含如下成分：蔗糖5～10g/L，葡萄糖10～20g/L，蛋白胨5～10g/L，酵母膏2～3g/L，磷酸二氢钾0.1～1g/L，硫酸镁0.1～1g/L，维生素Bl 0.1～1mg/L，蒸馏水余量。
9.权利要求1～8任意一项所述方法培养得到的冬虫夏草菌发酵液和/或菌丝体。
10.权利要求1～8任意一项所述方法在制备虫草保健品中的应用，其特征在于，以所述方法培养得到的冬虫夏草菌发酵液和/或菌丝体为原料生产虫草保健品；所述虫草保健品包括虫草原浆保健酒和冬虫夏草口服液；
优选地，将所述发酵液按体积比1：0.8～1.4与纯粮米酒混合，均质，陈酿，得到虫草原浆保健酒；
优选地，采用低级醇水溶液以及水溶液依次对所述菌丝体进行超声波提取，过滤后取滤液，浓缩滤液，得到冬虫夏草口服液。
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