CN106520562A - 一种利用参类提取物培养冬虫夏草菌的方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种利用参类提取物培养冬虫夏草菌的方法及其应用，所述方法在冬虫夏草种子培养和发酵培养过程中，将参类提取物添加到所述培养基中，按冬虫夏草常规工艺继续进行培养和发酵。所述冬虫夏草菌可为无性型中华被孢霉、有性型中华被孢霉、虫草头孢霉、弯颈霉、束丝霉或蝙蝠蛾拟青霉。本发明提供的培养方法简单、方便，所需参类提取物少，成本低；用所述培养方法培养菌种的菌丝体强壮，生长速度快，发酵后得到的菌丝体中虫草素含量高；用本发明提供的方法培养所得的发酵液和菌丝体的，可用于生产虫草保健品。

Description

一种利用参类提取物培养冬虫夏草菌的方法及其应用

技术领域

本发明涉及微生物培养、发酵领域，具体涉及一种利用参类提取物培养冬虫夏草菌方法及其应用。

背景技术

冬虫夏草是我国的一种名贵、稀有中药，用药历史悠久，与人参、鹿茸并列三大滋补品之一，用于补益肺肾两虚，久咳，支气管炎，阳痿，月经不调，高血脂，心供血不足等症，具有抗肿瘤，增强免疫力、抗病毒，抗真菌等药理作用，科学研究发现冬虫夏草含有腺苷、虫草素、虫草酸，多糖等药物化学物质，是冬虫夏草发挥药效，也是制定冬虫夏草质量标准的重要物质基础，近几年，国内外科学家发现，虫草素能干扰基因细细RNA和DNA的合成，抑制癌细胞等不正常细胞的分裂，表现出很强的抗真菌、抗HlV－I型病毒和抑制梭菌活性，作为抗癌、抗病毒新药，虫草素在美国己通过FDA的安全评价，并进入到三期临床价段。

冬虫夏草菌是从新鲜、经消毒的冬虫夏草的虫体或子座中分离得到的一种药用真菌，用深层液体发酵生产得到的虫草菌丝，含有与野生冬虫夏草相同的药物成分，用冬虫夏草菌丝体制得多种药产品，如金水宝、百灵胶囊等作为国家一类新药已收入于中国药典，具有很好的市场前景。十多年来，国内许多单位，尽管已经对冬虫夏草菌的生长特征、发酵培养基优化和发酵工艺进行大量研究工作，冬虫夏草菌丝体活性成分还较低，特别是冬虫夏草菌丝体中虫草素含量更低，因此有必要提高冬虫夏草菌的虫草素含量。现有提高虫草素的技术方案一般是对发酵培养基进行改良，或在发酵过程加入一些化学物质，如油酸或其前体物类似物或植物生长调节剂等到发酵培养基中，由于发酵培养基体积大，所需原材料或添加物的重量大，成本高。很少见到通过对冬虫夏草菌种子培养基的研究，来提高虫草素含量的研究。因此，冬虫夏草真菌的种子培养和发酵工艺技术研究的创新，对提高发酵冬虫夏草菌发酵液和菌丝体的虫草素含量，改善冬虫夏草菌的产品质量和药用效果有积极意义。

参类是传统的中药，包括产于我国东北黑龙江、吉林长白山的人参，朝鲜、韩国的高丽参和美国、加拿大的西洋参等。药理药化研究表明：参类含有多种皂甙和多糖成分，具有大补元气，复脉固脱，补脾益肺，生津安神，人力衰褐，滋阴补正，扶正固本的功效，但未见参类用于真菌发酵、特别是未见用于冬虫夏草菌发酵、提高虫草素含量的报导。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，提出了一种利用参类提取物培养冬虫夏草菌的方法，该方法是在冬虫夏草种子培养和发酵培养过程中，将参类提取物添加到所述培养基中，继续按冬虫夏草常规工艺进行培养和发酵。

本发明所述冬虫夏草菌是指从新鲜、经消毒的冬虫夏草的虫体或子座中分离得到的药用真菌；优选为本领域公知的无性型中华被孢霉、有性型中华被孢霉、虫草头孢霉、弯颈霉、束丝霉或蝙蝠蛾拟青霉。

本发明通过大量实践发现，将参类提取物用于冬虫夏草菌的培养过程，可以显著提高冬虫夏草菌的质量，尤其可以提冬虫夏草菌发酵液和菌丝体中虫草素的含量，从而提高其药用价值。

具体而言，所述方法包括以下步骤：将冬虫夏草菌接入种子培养基中进行种子培养，得种子液；将所述种子液接入发酵培养基中进行发酵培养；期间，将参类提取物添加到所述种子培养基或/和发酵培养基中。

为了更好地提高虫草素的含量，同时尽量减少参类提取物的用量，本发明将参类提取物添加到所述种子培养基中。具体而言，优选在未接入种子前或接入种子生长到指数生长期内任意时间，将参类提取物添加到种子培养基中。

本发明还可以将参类提取物添加到所述发酵培养基中。具体而言，优选在所述发酵培养的延滞期或所述发酵培养的指数生长期，将参类提取物添加到所述发酵培养基中。

本发明还可以将参类提取物添加到所述种子培养基和发酵培养基中。具体而言，优选在未接入种子前或种子生长到指数生长期内将参提取物添加到种子培养基中，并在发酵培养的延滞期或指数生长期将参提取物添加到发酵培养基中。

本发明所述参类具体是指本领域公知的人参，高丽参或西洋参。

所述参类提取物优选由以下方法制备而成：将人参，高丽参或西洋参与水或含有少量低级醇水溶液(如5～35％的乙醇水溶液)混合，在温75～95℃充分浸泡提取，过滤后浓缩滤液，即得。

进一步优选由以下方法制备而成：将人参，高丽参或西洋参以质量体积比1:5～15与水或含有少量低级醇水溶液(如5～35％的乙醇水溶液)混合；采用超声波提取或回流提取方法，在75～95℃提取2～3次，每次30～60min；过滤，合并提取液，减压浓缩，即可。

所述浓缩优选为浓缩至液体体积ml相当于参类原料质量g的1～2倍。在实际添加过程中，本发明优选所述参类提取物的添加体积占所述种子培养基或发酵培养基体积的0.3～1.0％。

本发明采用的种子培养基中包含碳源、氮源以及无机盐。所述碳源、氮源以及无机盐均可选用本领域常规的组分。具体而言，所述碳源可选用马铃薯或/和燕麦片以及葡萄糖或/和蔗糖，所述氮源可选用蛋白胨以及酵母膏；所述无机盐可选用磷酸二氢钾以及硫酸镁。

为了确保各组分之间协同作用，进一步全面提高种子品质，本发明优选所述种子培养基中包含如下重量份的成分：马铃薯150～250份，葡萄糖10～15份，蛋白胨1～5份，酵母膏1～5份，磷酸二氢钾0.1～1份，硫酸镁0.1～1份。

优选地，所述种子培养基为液体培养基，其中包含如下成分：马铃薯150～250g/L，葡萄糖10～15g/L，蛋白胨1～5g/L，酵母膏1～5g/L，磷酸二氢钾0.1～1g/L，硫酸镁0.1～1g/L，蒸馏水余量。

本发明所述种子培养基，可按常规培养基的配制方法配制。如将上述质量配比称取原料，放入容器，加热，溶解，混合均匀后按常规灭菌方法灭菌即可。

为了确保各组分之间协同作用，进一步全面提高发酵产物的品质，本发明优选所述发酵培养基中包含如下重量份的成分：葡萄糖10～20份，蔗糖5～10份，小米5～15份，蛋白胨5～10份，酵母膏1～5份，豆饼粉10～20份，磷酸二氢钾0.1～1份，硫酸镁0.1～1份，维生素B1 0.01～0.05份。

优选地，所述发酵培养基为液体培养基，其中包含如下成分：葡萄糖10～20g/L，蔗糖5～10g/L，小米5～15g/L，蛋白胨5～10g/L，酵母膏1～5g/L，豆饼粉10～20g/L，磷酸二氢钾0.1～1g/L，硫酸镁0.1～1g/L，维生素B1 0.01～0.05g/L，蒸馏水余量。

本发明所述发酵培养基，可按常规培养基的配制方法配制。如将上述质量配比称取原料，放入容器，加热，溶解，混合均匀后按常规灭菌方法灭菌即可。

上述所述种子培养方法以及发酵方法均为本领域常规操作，本发明不做特殊限定。

作为一种具体的实施方式，所述种子培养方法为：将母种接入种子培养基，在温度19～23℃、旋转速度为160～210r/min的摇瓶中培养36～48小时。

作为一种具体的实施方式，所述发酵培养方法为：将种子液接入发酵培养基，在温度21～25℃、旋转速度为160～200r/min条件下，通气培养48～80小时。

本发明同时保护所述方法培养得到的冬虫夏草菌发酵液和/或菌丝体。

本发明进一步保护所述方法在制备虫草保健品中的应用。所述应用具体为：以所述方法培养得到的冬虫夏草菌发酵液和/或菌丝体为原料生产虫草保健品。

作为一种具体应用方式，本发明优选将所述发酵液按体积比1：0.8～1.4与纯粮米酒混合，均质，陈酿，得到虫草原浆保健酒。为了提高所述保健酒的综合品质，使虫草素在陈酿过程中充分发挥作用，本发明优选所述纯粮米酒的酒精度为52～56度。

作为一种具体应用方式，本发明优选采用低级醇水溶液以及水溶液依次对所述菌丝体进行超声波提取，过滤后取滤液，浓缩滤液，得到冬虫夏草口服液。为了提高提取效果，本发明优选将所述菌丝体以重量体积比(g/ml或kg/L)为1：8～12的比例分别先加入(30-70％)乙醇水溶液在温度55～95℃的条件下超声波提取2～3次，每次30-60min；再加入同样比例的水溶液在55～95℃条件下超声波提取2～3次，每次30～60min。

本发明创造性地将参类提取物用于冬虫夏草菌的培养中。用所述培养方法培养的菌种生长速度快、质量佳。本发明通过在冬虫夏草菌特定的培养期添加参类提取物，可显著提高菌丝体中虫草素含量；本发明提供的培养方法，操作简便，不改变冬虫夏草菌原有培养工艺条件，易于在工业生产中应用。本发明添加的参类物质是药食两用的中药，来源方便，添加量少，成本低廉，安全无毒，可用于医药、保健品和食品的工业生产。用本发明提供的方法生产冬虫夏草保健品，含有冬虫夏草和参类的药物成份，具有参类和冬虫夏草的药用和保健作用。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1

人参提取物的制备：取市购东北吉林长白山移山参，清除尘土杂质，烘干粉碎，过80目筛得粗粉。取300g粗粉，置于超声波提取器，加入3000ml纯水，在浸取温度75度，功率300W，超声浸取30分钟，滤出浸出液，向浸提残渣重新加入2000ml纯水，在浸取温度75度，功率300W，超声浸取30分钟，滤出浸出液，滤液合并，置旋转薄膜浓缩器，在水浴温度为75度，真空度为0.097Mpa下，浓缩至残留浸取液450ml结束。

采用西藏那曲地区天然冬虫夏草上分离纯化、并经菌种的培养特征、显微特征、rRNA基因序列等分子生物学鉴定为冬虫夏草的菌种。

按照以下步骤进行培养：

(1)将冬虫夏草菌种接入液体种子培养基，按常规方法(在温度19～23℃、旋转速度为180r/min的摇瓶中培养36-42小时)培养种子液；

所述液体种子培养基的配方为：马铃薯200g/L，葡萄糖12g/L，蛋白胨2.5g/L，酵母膏2g/L，磷酸二氢钾0.8g/L，硫酸镁0.5g/L，蒸馏水余量；

其中，在进行种子平行培养的情况下，在所述种子培养的指数生长前期加入占所述液体种子培养基体积0.45％的人参提取物，作为试验组；未添加人参提取物的作为对照组；

(2)将所述种子液接入液体发酵培养基，所述种子液的接入体积为所述液体发酵培养基体积的10～12％，按常规方法(在温度21～25℃、旋转速度为190r/min条件下，通气培养48-72小时)发酵，收集发酵液；

所述液体发酵培养基的配方为：葡萄糖15g/L，蔗糖7g/L，小米10g/L，蛋白胨6g/L，豆饼粉15g/L，酵母浸膏2.5g/L，磷酸二氢钾0.8g/L，硫酸镁0.5g/L，维生素B1 0.03g/L，蒸馏水余量。

发酵结束后，分别收集试验组和对照组的冬虫夏草菌丝体，干燥。用高效液相色谱法测定试验组和对照组中虫草素的含量。

其中，所述干燥菌丝体的获取方法为：将发酵液在相对离心力12000g条件下离心15分钟，重复离心操作洗涤菌丝体二次，在65℃下干燥至恒重。

在进行高效液相色谱检测前，对所述干燥菌丝体进行如下前处理：精密称取菌丝体重量，加入流动相(甲醇：水＝60:40)，所述流动相体积ml相当于所述菌丝体重量g的10倍，在功率400W、频率30KHz的条件下超声处理30分钟，定容。

所述高效液相色谱法测定的条件为：采用C18柱(十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂)，以甲醇：水＝60:40为流动相，梯度洗脱，检测波长为260nm，柱温为25℃。

检测结果如表1所示。

表1：每100ml发酵液中菌丝体所含的虫草素含量

	虫草素含量(mg/100ml)
		对照组	0.040
试验组	0.156

实施例2

与实施例1相比，区别仅在于：在进行种子平行培养的情况下，试验组在所述种子培养基未接入种子前加入占所述液体种子培养基体积0.75％的人参提取物，作为试验组；未添加人参提取物的作为对照组。

发酵结束后，分别收集1000ml试验组和对照组的冬虫夏草菌丝体，以1：8重量体积比分别加入70％乙醇水溶液和水溶液，分别在55℃和95℃提取3次，每次30min；进行超声提取，过滤，浓缩滤液得到385ml冬虫夏草口服液。

并用所述高效液相色谱法测定试验组和对照组冬虫夏草口服液中虫草素的含量，检测结果如表2所示

表2：每100ml口服液中所含的虫草素含量

	虫草素含量(mg/100ml)
		对照组	0.083
试验组	0.405

实施例3

与实施例1相比，区别仅在于：在进行种子平行培养的情况下，试验组在所述种子培养的指数生长未期加入占所述液体种子培养基体积0.95％的人参提取物，作为试验组；未添加人参提取物的作为对照组。

发酵结束后，分别收集试验组和对照组的冬虫夏草发酵液。将所述发酵液按体积比为1：1.1的比例加入的酒精度52-56度的纯粮米酒，经过均质机处理(操作压力为90MPa)，陈酿后得到虫草原浆保健酒。

并用所述高效液相色谱法测定试验组和对照组虫草原浆保健酒中虫草素的含量，检测结果如表3所示。

表3：每100ml虫草原浆保健酒所含的虫草素含量

	虫草素含量(mg/100ml)
		对照组	0.020
试验组	0.058

实施例4

与实施例1相比，区别仅在于：在进行发酵平行培养的情况下，在试验组所述发酵培养的延滞期加入占所述液体发酵培养基体积0.55％的人参提取物，作为试验组；未添加人参提取物的作为对照组。

发酵结束后，按照实施例1所述方法分别收集试验组和对照组的冬虫夏草菌丝体，以1：10重量体积比分别加入65％乙醇水溶液和水溶液，分别在55℃和95℃提取3次，每次30min；进行超声提取，过滤，浓缩滤液得到冬虫夏草口服液。

并用所述高效液相色谱法测定试验组和对照组虫草口服液中虫草素的含量，检测结果如表4所示。

表4：每100ml虫草口服液所含的虫草素含量

	虫草素含量(mg/100ml)
		对照组	0.117
试验组	0.605

实施例5

与实施例1相比，区别仅在于：在进行发酵平行培养的情况下，在试验组所述发酵培养指数生长前期加入占所述液体发酵培养基体积0.8％的人参提取物，作为试验组；未添加人参提取物的作为对照组。

发酵结束后，分别收集2000ml试验组和对照组的冬虫夏草发酵液。用纳滤(操作压力为25MPa)将所述发酵液浓缩到494ml发酵液，按体积比为1：1.1的比例加入的酒精度52-56度的纯粮米酒，经过均质机处理(操作压力为90MPa)，陈酿后得到虫草原浆保健酒。

并测定试验组和对照组中虫草素的含量，检测结果如表5所示。

表5：每100ml虫草原浆保健酒中菌丝体所含的虫草素含量

	虫草素含量(mg/100ml)
		对照组	0.079
试验组	0.273

实施例6

与实施例1相比，区别仅在于：在进行平行培养发酵的情况下，在所述的种子培养液未接入种子前和发酵培养的指数生长期分别加入占所述种子培养基液体和发酵培养基体积0.3％和0.55％的西洋参提取物，作为试验组；未添加西洋参提取物的作为对照组。

所述西洋参提取物的制备方法为：市购产于美国的西洋参，清除尘土杂质，烘干粉碎，过90目筛得细粉。取200g细粉，置于超声波提取器，加入2000ml纯水，在浸取温度70度，功率300W，超声浸取40分钟，滤出浸出液，向浸提残渣重新加入2000ml纯水，在浸取温度70度，功率300W，超声浸取30分钟，滤出浸出液，滤液合并，置旋转薄膜浓缩器，在水浴温度为70度，真空度为0.097Mpa下，浓缩至残留浸取液200ml结束。

发酵结束后，按照实施例1所述方法分别收集试验组和对照组的冬虫夏草菌丝体，干燥，超微粉碎，得菌丝粉，并按所述高效液相色谱法测定试验组和对照组菌粉中虫草素的含量，检测结果如表6所示。

表6：每100ml发酵液中菌丝粉所含虫草素含量

	虫草素含量(mg/100ml)
		对照组	0.041
试验组	0.247

实施例7

与实施例1相比，区别仅在于：在进行平行培养和发酵的情况下，在所述种子培养指数生长期和发酵培养的延滞期分别加入占所述液体种子和发酵培养基体积0.35％和0.42％的高丽参提取物，作为试验组；未添加高丽参提取物的作为对照组。

所述高丽参提取物的制备方法为：市购产于朝鲜高丽参，清除尘土杂质，烘干粉碎，过90目筛得细粉。取150g细粉，置于超声波提取器，加入1500ml纯水，在浸取温度65度，功率300W，超声浸取50分钟，滤出浸出液，向浸提残渣重新加入1000ml纯水，在浸取温度65度，功率300W，超声浸取25分钟，滤出浸出液，滤液合并，置旋转薄膜浓缩器，在水浴温度为75度，真空度为0.095Mpa下，浓缩至残留浸取液250ml。

发酵结束后，分别收集试验组和对照组的冬虫夏草菌发酵液。加入甲醇，超声处理，按所述高效液相色谱法测定试验组和对照组发酵液中虫草素的含量，检测结果如表7所示。

表7：每100ml发酵液中所含的虫草素含量

	虫草素含量(mg/100ml)
		对照组	0.040
试验组	0.258

虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.一种利用参类提取物培养冬虫夏草菌的方法，其特征在于，在冬虫夏草种子培养或/和发酵培养过程中，将参类提取物添加到种子培养基或/和发酵培养基中；

所述冬虫夏草菌优选为无性型中华被孢霉、有性型中华被孢霉、虫草头孢霉、弯颈霉、束丝霉或蝙蝠蛾拟青霉。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：将冬虫夏草菌接入种子培养基中进行种子培养，得种子液；将所述种子液接入发酵培养基中进行发酵培养。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，将参类提取物添加到所述种子培养基中；优选在未接入种子前或接入种子到指数生长期内任意时间将参类提取物添加到所述种子培养基中；

或，将参类提取物添加到所述发酵培养基中；优选在所述发酵培养的延滞期或所述发酵培养的指数生长期将参类提取物添加到所述发酵培养基中；

或，将参提取物添加到所述种子培养基和发酵培养基中；优选在未接入种子前或种子指数生长期内将参提取物添加到所述种子培养基中，并在发酵培养的延滞期或指数生长期将参提取物添加到所述发酵培养基中。

4.根据权利要求1～3任意一项所述的方法，其特征在于，所述参类具体为：人参，高丽参或西洋参。

5.根据权利要求1～4任意一项所述的方法，其特征在于，所述参类提取物的提取溶剂为水或低级醇水溶液；

优选地，所述参类提取物由以下方法制备而成：将参类原料与水或低级醇水溶液混合，在75～95℃充分浸泡提取，过滤，浓缩滤液，即得参类提取物；以ml/g计，所述参类提取物的体积相当于参类原料质量的1～2倍。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述参类提取物的添加体积占所述培养基体积的0.3～1.0％。

7.根据权利要求1～6任意一项所述的方法，其特征在于，所述种子培养基包含如下重量份的成分：马铃薯150～250份，葡萄糖10～15份，蛋白胨1～5份，酵母膏1～5份，磷酸二氢钾0.1～1份，硫酸镁0.1～1份；

优选所述种子培养基为液体培养基，包含如下成分：马铃薯150～250g/L，葡萄糖10～15g/L，蛋白胨1～5g/L，酵母膏1～5g/L，磷酸二氢钾0.1～1g/L，硫酸镁0.1～1g/L，蒸馏水余量。

8.根据权利要求1～6任意一项所述的方法，其特征在于，所述发酵培养基包含如下重量份的成分：葡萄糖10～20份，蔗糖5～10份，小米5～15份，蛋白胨5～10份，酵母膏1～5份，豆饼粉10～20份，磷酸二氢钾0.1～1份，硫酸镁0.1～1份，维生素B1 0.01～0.05份；

优选所述发酵培养基为液体培养基，包含如下成分：葡萄糖10～20g/L，蔗糖5～10g/L，小米5～15g/L，蛋白胨5～10g/L，酵母膏1～5g/L，豆饼粉10～20g/L，磷酸二氢钾0.1～1g/L，硫酸镁0.1～1g/L，维生素B1 0.01～0.05g/L，蒸馏水余量。

9.权利要求1～8任意一项所述方法培养得到的冬虫夏草菌发酵液和/或菌丝体。

10.权利要求1～8任意一项所述方法在制备虫草保健品中的应用，其特征在于，以所述方法培养得到的冬虫夏草菌发酵液和/或菌丝体为原料生产虫草保健品；所述虫草保健品包括虫草原浆保健酒和冬虫夏草口服液；

优选地，将所述发酵液按体积比1：0.8～1.4与纯粮米酒混合，均质，陈酿，得到虫草原浆保健酒；

优选地，采用低级醇水溶液以及水溶液依次对所述菌丝体进行超声波提取，过滤后取滤液，浓缩滤液，得到冬虫夏草口服液。