CN106086147A - 利用真菌激发子诱导从桦褐孔菌中提取白桦脂酸的方法 - Google Patents

利用真菌激发子诱导从桦褐孔菌中提取白桦脂酸的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种利用真菌激发子诱导从桦褐孔菌中提取白桦脂酸的方法，包括：将可产孢子的丝状真菌进行液体培养，培养后离心、洗涤得到菌丝体，破碎细胞，离心取沉淀，然后用蒸馏水配制成浓度为8‑12mg/mL的细胞碎片溶液，灭菌，得到真菌激发子；将活化的桦褐孔菌(Inonotus obliquus)CFCC 83414接入液体培养基，于24‑26℃发酵培养8‑14天，在发酵第4‑8天加入真菌激发子，发酵完成后，分离菌体和发酵液，通过后处理从菌体和发酵液中分离纯化得到白桦脂酸。本发明通过在发酵中期加入真菌激发子刺激桦褐孔菌的生长，无需引入基因工程菌株或外加酶，后处理简单，能有效提高桦褐孔菌中白桦脂酸的产量。

Description

利用真菌激发子诱导从桦褐孔菌中提取白桦脂酸的方法
技术领域
本发明涉及微生物发酵及代谢领域，尤其涉及一种利用真菌激发子诱导从桦褐孔菌中提取白桦脂酸的方法。
背景技术
桦褐孔菌(Inonotus obliquus)是一种十分珍稀而名贵的药用真菌，属于真菌门、担子菌亚门、层菌纲、非褐菌目、多孔菌科、褐卧孔菌属。主要分布于俄罗斯、芬兰、波兰、日本北海道等北半球北纬40°～50°的地区和我国的黑龙江大兴安岭、吉林长白山一带。从16世纪以来，俄罗斯、波兰、芬兰等国家的民间就广泛使用桦褐孔菌来治疗各种疑难杂症，如各种癌症、心脏病和糖尿病等。
桦褐孔菌是生长在寒带的木腐菌，引起白桦、银桦、榆树、赤杨的白腐。在木材中的桦褐孔菌菌丝在零下40℃也不会冻死，是极耐寒的种类。桦褐孔菌含有多糖、三萜类、桦褐孔菌醇、多种氧化三萜类化合物、栓菌酸、多种羊毛甾醇型三萜类化合物、叶酸衍生物、芳香族的香草酸、丁香酸及γ羟基苯甲酸，还有报道称已分离出单宁化合物、类固醇、生物碱类化合物、黑色素类、低分子多酚类及木质素类化合物。其中，白桦脂酸，是一种非常重要的天然活性物质。
白桦脂酸(Betulinic acid，BA)，又名桦木酸，是一种五环三萜类化合物。广泛分布于多种植物中，如鼠李科的酸枣仁、桦木科的白桦树皮、豆科的皂角刺、蔷薇科的光皮木瓜、五加科刺五加、大戟科重阳木、锦葵科木芙蓉花等。最早分离于生长在非洲东部的鼠李科常绿植物的树皮。在我国，白桦脂酸最丰富的自然资源是白桦树皮。近年来的研究表明，白桦脂酸具有诸多的生物活性，如抗肿瘤、抗HIV、抗炎、抗菌、抗疟疾等，尤其是在抗肿瘤方面，特别是针对黑色素瘤，有突出的表现。同时还具有作用机制特异、分子质量小、低毒性等优点，有广泛的应用开发前景，是一类很有潜力的药物先导化合物。目前，白桦脂酸的来源主要有三种：第一，从天然植物中提取分离得到。第二，以白桦脂醇为前体，通过有机合成得到白桦脂酸。第三，以白桦脂醇为前体，通过微生物生物转化形成白桦脂酸。
目前，有研究表明，桦褐孔菌中可以分离到白桦脂酸。但是，在实验的过程中，发现从桦褐孔菌中直接提取白桦脂酸时，得到的量非常低，几乎没有，所以希望找到一种更为高效的提高白桦脂酸产量的方法。
发明内容
本发明提供了一种利用真菌激发子诱导从桦褐孔菌中提取白桦脂酸的方法，该方法无需引入基因工程菌株或外加酶，后处理简单，能有效提高桦褐孔菌中白桦脂酸的产量。
一种利用真菌激发子诱导从桦褐孔菌中提取白桦脂酸的方法，包括：
(1)将可产孢子的丝状真菌进行液体培养，培养后离心、洗涤得到菌丝体，破碎细胞，离心取沉淀，然后用蒸馏水配制成浓度为8-12mg/mL的细胞碎片溶液，灭菌，得到真菌激发子；
(2)将活化的桦褐孔菌(Inonotus obliquus)CFCC 83414接入液体培养基，于24-26℃发酵培养8-14天，在发酵第4-8天加入真菌激发子，发酵完成后，分离菌体和发酵液，通过后处理从菌体和发酵液中分离纯化得到白桦脂酸；
其中，所述可产孢子的丝状真菌为刺盘孢菌、黑曲霉、米曲霉和尖孢镰刀菌中的至少一种。
白桦脂酸属于一种次生代谢产物，主要在桦褐孔菌的代谢过程中产生，桦褐孔菌的发酵周期一般为12天。真菌激发子是来源于真菌的一类化学物质，具有诱导细胞中防卫基因的表达并促进细胞中特定次生代谢产物的合成等功能，在植物或微生物的次级代谢产物合成的研究过程中，被广泛用做诱导物质。本发明在研究中发现，在发酵中期加入真菌激发子可有效提高桦褐孔菌中白桦脂酸的含量。
本发明中，所述真菌激发子可采用如下方法制备：将可产孢子的丝状真菌接种于PDA培养基并在25±1℃培养7d，然后转入PDB液体培养基中，25℃条件下震荡培养3d(摇床转速为140r/min)；培养完成后，于3500r/min离心10min，菌丝体用蒸馏水洗涤3次，用50mmol/L磷酸盐缓冲液(pH为7.2)洗涤3次，采用超声波细胞粉碎机破碎细胞(300W，1min×5)，3500r/min离心10min后取沉淀，在显微镜下观察时，菌丝体应均为碎片状；然后用上述缓冲液洗涤3次，蒸馏水洗涤3次；用蒸馏水配制成一定浓度的细胞碎片溶液，高压蒸汽灭菌后，得到真菌激发子；放4℃冰箱中保存备用。
所述桦褐孔菌(Inonotus obliquus)CFCC 83414菌株购自中国林业微生物菌种保藏管理中心，菌株编号CFCC 83414。
所述桦褐孔菌(Inonotus obliquus)CFCC 83414活化用的固体培养基为马铃薯葡萄糖琼脂合成培养基和麸皮水浸提液的混合物。马铃薯葡萄糖琼脂合成培养基可以为市售产品。
所述固体培养基中原料质量百分比组成可以为：马铃薯浸出粉1％，葡萄糖2％，琼脂1.8％，氯霉素0.01％，余量为麸皮水浸提液；其中，麸皮水浸提液为麸皮按照4-6％质量百分比浓度加入水中，经熬制、除杂后得到。
固体培养基可以通过如下方法制备：将麸皮按照4-6％质量百分比浓度加入水中，熬制0.4-0.6小时后用八层纱布过滤除去大颗粒；然后加入马铃薯葡萄糖琼脂合成培养基，混匀，煮沸，分装在玻璃管中，之后在121℃下灭菌20min，灭菌后摆成斜面待其凝固。
所述液体培养基为马铃薯葡萄糖合成培养基和麸皮水浸提液的混合物。马铃薯葡萄糖合成培养基可以为市售产品。
所述液体培养基中原料质量百分比组成可以为：马铃薯浸出粉0.8％，葡萄糖2％，余量为麸皮水浸提液；其中，麸皮水浸提液为麸皮按照4-6％质量百分比浓度加入水中，经熬制、除杂后得到。
液体培养基可以通过如下方法制备：将麸皮按照4-6％质量百分比浓度加入水中，熬制0.4-0.6小时后用八层纱布过滤除去大颗粒；然后加入马铃薯葡萄糖合成培养基，混匀，分装，之后在121℃下灭菌20min。采用此培养基配方，更有利于菌体的生长和代谢。
所述发酵温度可以为25℃，发酵时间可根据发酵方式不同而不同。当采用发酵罐发酵时，培养时间可以为8-10天；当采用三角瓶发酵时，发酵时间可以为11-14天。本发明研究发现发酵罐处理效果更好，发酵罐与三角瓶相比，不易污染，通气量大，溶氧充分，同时，由于桦褐孔菌是好氧真菌，故用发酵罐生长更快，发酵周期更短。
三角瓶发酵培养时，前2-3天转速设为0rpm/min，然后再以90-110rpm/min的转速培养2-3天，之后再以150-180r/min的转速培养。先静置2-3天，是因为刚接种后，培养基中菌体较少，所需要的氧气也较少；然后再以90-110rpm/min的转速培养2-3天，是因为这个时期，菌体已经在逐渐增多，所以要适当增大转速，以满足其对氧气的需求。之后再以150-180r/min的转速培养，是因为此时其菌体量已经达到其最大值，所以要适当加大转速。这样设置转速，更有利于菌体生长和代谢。
优选地，所述可产孢子的丝状真菌为黑曲霉。通过对刺盘孢菌、黑曲霉、米曲霉和尖孢镰刀菌这四类真菌的激发子进行初步比较，结果发现黑曲霉激发子诱导效果最佳。
所述真菌激发子的加入时间可以为发酵第4-5天。因为此时添加，发酵后得到的白桦脂酸的量最多。
以每升发酵液计，所述真菌激发子的添加量可以为10-90mg；优选为30-60mg；更优选为45mg。因为加入激发子的量过少时，诱导效果不明显；激发子加入量过高时，将会抑制白桦脂酸的产生。
所述后处理包括将菌体破碎后用乙酸乙酯萃取，同时将发酵液用乙酸乙酯萃取，之后合并萃取液，浓缩，得到白桦脂酸。
所述菌体破碎、萃取方法为：将菌体先用无菌水洗涤两次，之后加入适量的无菌水，用超声破碎仪破碎5次，每次1min(300W)，然后加入等量的乙酸乙酯进行萃取，于23-27℃超声提取0.8-1.2h，萃取2-3次，合并，得到萃取液。
所述发酵液萃取方法为：将发酵液用等量的乙酸乙酯萃取，于23-27℃超声提取0.8-1.2h，萃取2-3次，合并，得到萃取液。
本发明在桦褐孔菌发酵过程中，于合适的时机添加诱导剂真菌激发子，以提高白桦脂酸产量，具备如下有益效果：
(1)通过在发酵中期添加真菌激发子，有效促进了桦褐孔菌及其发酵液中白桦脂酸产量的提高，可以提高几倍到几十倍不等。
(2)真菌激发子是来源于真菌的一类化学物质，具有诱导细胞中防卫基因的表达并促进细胞中特定次生代谢产物的合成等功能。真菌激发子在添加前需要将菌体破碎成碎片并灭菌。
附图说明
图1为白桦脂酸标准品的液相色谱图。
图2为菌体破碎液的液相色谱图。
图3为发酵液的液相色谱图
图4为本发明的工艺流程图。
具体实施方式
为更好理解本发明，下面结合实施例来阐释本发明。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
以下实施例中：桦褐孔菌(Inonotus obliquus)CFCC 83414菌株购自中国林业微生物菌种保藏管理中心，菌株编号CFCC 83414。
实施例1
1、真菌激发子的制备
先将黑曲霉接种于PDA斜面培养基上并在25±1℃培养7d，然后转入PDB液体培养基中，25℃条件下震荡培养3d(摇床转速为140r/min)。真菌培养物应在培养结束后取，3500r/min离心10min，菌丝体用蒸馏水洗涤3次，用50mmol/L磷酸盐缓冲液(pH 7.2)洗涤3次，用JY96-II V超声波细胞粉碎机破碎细胞(300W，1min×5)，3500r/min离心10min后取沉淀。在显微镜下观察时，菌丝体应均为碎片状。然后用上述缓冲液洗涤3次，蒸馏水洗涤3次。用蒸馏水配制成10mg/mL的黑曲霉细胞碎片溶液，高压蒸汽灭菌后，得到真菌激发子，放4℃冰箱中保存备用。
2、固体培养基的制备
将麸皮按照5％质量百分比浓度加入水中，熬制0.5小时后用八层纱布过滤除去大颗粒，得到麸皮水浸提液；然后加入PDA合成培养基(市售)，混合均匀后，将其煮沸后分装在玻璃管中，每管10mL，之后在121℃下灭菌20min。灭完菌后摆斜面至斜面凝固。
其中，原料质量百分比组成为：马铃薯浸出粉1％，葡萄糖2％，琼脂1.8％，氯霉素0.01％，余量为麸皮水浸提液。
3、菌种的活化
将桦褐孔菌CFCC 83414接种到斜面上，在25℃的培养箱中培养15天左右，待其长满整个斜面。
4、液体培养基的制备
将麸皮按照5％(以水的体积计)的比例加入水中，并且熬制半个小时后用八层纱布过滤除去大颗粒，得到麸皮水浸提液；然后加入PDB合成培养基(市售)，混合均匀后，分装在500mL的锥形瓶中，每瓶分装100mL，之后在121℃下灭菌20min。
其中，原料质量百分比组成为：马铃薯浸出粉0.8％，葡萄糖2％，余量为麸皮水浸提液。
5、接种
每个摇瓶接种1块1cm2的桦褐孔菌CFCC 83414菌种。
6、发酵
在25℃温度下培养，先静置2～3天，然后再以100rpm的转速培养2-3天，之后再以180rpm的转速培养。
7、真菌激发子的加入
正常的发酵过程中，在发酵第6天加入真菌激发子，每瓶加0.45mL，使得发酵液中真菌激发子的浓度为45mg/L。
8、菌体和发酵液的分离和提取
将发酵液及菌体倒入50mL离心管，在3500r/min的转速下离心10min，将发酵液和菌体细胞分离。菌体用去离子水洗2次后称其湿重，之后每管加入15mL左右的去离子水，用超声破碎仪破碎5次，每次1min，加入等量的乙酸乙酯，25℃下超声1h，萃取2次；对于每个样品，发酵液每个样取50mL，用量筒称量其体积，然后加入等量的50mL乙酸乙酯萃取，25℃温度下超声1h，之后用离心机离心，转速为3500r/min，时间为10min，每个样品萃取2次。之后用旋蒸仪进行旋转蒸发浓缩，直到将其蒸干为止，旋转蒸发的参数如下：转速为120r/min，水浴的温度为50℃。
得到的晶体用1-2mL甲醇(色谱纯)溶解，用0.22μm的有机系的微孔滤膜过滤除杂，之后等待进样。
9、白桦脂酸浓度的测定：反相液相色谱法(RP-HPLC)。
其色谱检测条件：
色谱柱DiamonsilC18(250mm×4.6mm，5μm)；
流动相为乙腈/水(v/v＝91/9)；
流速1.0mL/min；
检测波长210nm；
柱温25℃；
进样量20μL；
跑样时间25min，梯度洗脱。
绘制标准曲线：取1ml标准品进样，在色谱检测条件下测定对应的峰面积值(A)，以峰面积值A为纵坐标，白桦脂酸的浓度C为横坐标，绘制标准曲线，经统计处理求得白桦脂酸浓度与峰面积的线性回归方程为：A＝9.46836C+0.18939(R2＝0.99798)。
实验组在发酵中期时加入真菌激发子，对照组未进行任何处理。测定结果表明，对照组中湿重菌体中白桦脂酸的含量为0.1004μg/g，添加真菌激发子的实验组中白桦脂酸的含量为2.9316μg/g。对照组发酵液中白桦脂酸的含量为0.1180μg/mL，而添加真菌激发子的实验组发酵液中白桦脂酸的含量为0.7895μg/mL。
由结果可知，添加真菌激发子的实验组白桦脂酸的含量显著高于自然发酵的对照组。可见适量的加入真菌激发子能起到提高白桦脂酸含量的作用。
实施例2
参照实施例1的桦褐孔菌发酵工艺，在加入真菌激发子阶段，每瓶加入浓度为10mg/mL的黑曲霉细胞碎片溶液0.9mL，使得发酵液中激发子的浓度为90mg/L。其他条件同实施例1。
白桦脂酸浓度的检测方法同实施例1。
按照本实施例的方法，发酵12天后检测到实验组湿菌体中白桦脂酸的含量为2.8679μg/g，对照组中白桦脂酸的含量为0.1004μg/g。
实验组在发酵中期时加入油酸，对照组未进行任何处理。测定结果表明，对照组发酵液中白桦脂酸的浓度为0.1180μg/mL，添加激发子的实验组发酵液中白桦脂酸的浓度为0.0230μg/mL。
从实施例1-2的结果表明，添加45mg/L的真菌激发子发酵的桦褐孔菌菌体或发酵液中白桦脂酸的含量均高于自然发酵的对照；而添加90mg/L的真菌激发子发酵的桦褐孔菌，仅菌体中白桦脂酸的含量高于自然发酵的对照。说明加入合适浓度的真菌激发子后，菌体和发酵液中白桦脂酸的含量均会有明显的提高。
实施例3
参照实施例1的桦褐孔菌的发酵工艺，将样品分成五组，其中四组为在发酵的不同阶段，第4、5、6、7天分别加入真菌激发子，每次每瓶发酵液均加入10mg/mL的激发子溶液0.45mL，使得发酵液中真菌激发子的浓度为45mg/L，另外一组为空白对照。其他条件同实施例1。
白桦脂酸浓度的检测方法同实施例1。
本实施例除了测发酵液和菌体中白桦脂酸外，又测了各个处理组的生物量。生物量的测量则按照以下的方法进行：当菌体和发酵液分离后，将菌体放入50mL的离心管中，离心管要事先称重，并编好标号，先于-80℃的冰箱中预冻一天，然后在真空冷冻干燥机上冻干48小时将其水分全部除去，之后称取其质量。减去离心管的质量，即可得到菌体的干重。
按照本实施例的方法，发酵12天后测得的不同真菌激发子添加时间的实验结果见表1。
从表中数据可以看出，不同的真菌激发子添加时间对桦褐孔菌生物量的影响不大，但对白桦脂酸的含量影响较大。第4天添加真菌激发子时发酵液中白桦脂酸的浓度最高，为0.1259μg/mL；第7天添加真菌激发子时，菌体中白桦脂酸的含量最高，为3.2299μg/g；而白桦脂酸总含量最高的为第4天添加真菌激发子时。综合考虑以上实验结果，可知添加真菌激发子的最佳时间为第4天。
表1不同真菌激发子添加时间对发酵结果的影响
实施例4
本实施例采用发酵罐进行发酵。培养基的制备和菌种的活化均同实施例1。
与之前的实施例相比，本实施例的以下步骤有所不同：
1、种子液的制备
接种1cm2活化的菌种于装有100mL培养基的500mL的锥形瓶中，在25℃、180rmp的条件下于摇床中培养48h后得到种子液。
2、发酵液的前处理
按实施例1的方法，配好4L的培养基，并灭菌。并且灭适量的大豆油作为消泡剂。将酸碱电极校准之后，将发酵罐接入，平衡4～6个小时以上，使培养基达到预设好的温度25℃。
3、接种
在接种口周围点上酒精，然后迅速将种子液加入发酵罐中，种子液按10％(以发酵罐中培养基的体积计)的比例加入，即400mL。接种后将发酵罐的温度设置为25℃，并接上消泡剂——大豆油。发酵9天。
4、发酵液和菌体的分离提取
发酵液和菌体的分离步骤同实施例1，但提取步骤与实施例1有些差异。为了找到一种更为合适的提取方式，因此将菌体破碎液分成不同的处理方式进行萃取。分别为：25℃下超声1h；60℃下超声1h；25℃下不超声，直接萃取；液氮研磨，不超声。本实施例还有一部分菌体做了冻干处理，冻干过程参照实施例3，菌体破碎液的提取方式为25℃下超声提取1h。
蒸发浓缩步骤和白桦脂酸的检测方法也同实施例1。
不同的萃取处理方式的结果见表2。
表2不同处理方式对湿菌体中白桦脂酸提取量的影响
结果表明，提取的温度，以及是否超声都会对结果有影响。将前两组数据对比可知，25℃的提取效果比60℃的效果好。将第一组和第三组数据对比可知，同样的温度下，超声提取的效果会更好一些。将最后两组数据对比可知，液氮研磨的效果并不是太好。综合以上四种方法，可知25℃下超声提取1h这种方法最好。
以上的结果均为湿重，另外一组干重菌体检测到的白桦脂酸的含量为612.56μg/g。
对于发酵液，本实施例仅用了25℃下超声提取1h这一种方法进行提取，测得的白桦脂酸的含量为3.8742μg/mL。
本实施例表明，用发酵罐发酵的菌体和发酵液中白桦脂酸的量均比用摇瓶发酵的高很多，意味着用发酵罐的扩大培养效果更好。

Claims (10)

1.一种利用真菌激发子诱导从桦褐孔菌中提取白桦脂酸的方法，包括：
(1)将可产孢子的丝状真菌进行液体培养，培养后离心、洗涤得到菌丝体，破碎细胞，离心取沉淀，然后用蒸馏水配制成浓度为8-12mg/mL的细胞碎片溶液，灭菌，得到真菌激发子；
(2)将活化的桦褐孔菌(Inonotus obliquus)CFCC 83414接入液体培养基，于24-26℃发酵培养8-14天，在发酵第4-8天加入真菌激发子，发酵完成后，分离菌体和发酵液，通过后处理从菌体和发酵液中分离纯化得到白桦脂酸；
其中，所述可产孢子的丝状真菌为刺盘孢菌、黑曲霉、米曲霉和尖孢镰刀菌中的至少一种。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述液体培养基为马铃薯葡萄糖合成培养基和麸皮水浸提液的混合物。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述发酵采用发酵罐发酵，发酵时间为8-10天。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述发酵采用三角瓶发酵，发酵时间为11-14天；培养时，前2-3天转速设为0rpm/min，然后再以90-110rpm/min的转速培养2-3天，之后再以150-180r/min的转速培养。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述可产孢子的丝状真菌为黑曲霉。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述真菌激发子的加入时间为发酵第4-5天。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，以每升发酵液计，所述真菌激发子的添加量为10-90mg。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，以每升发酵液计，所述真菌激发子的添加量为30-60mg。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述后处理包括将菌体破碎后用乙酸乙酯萃取，同时将发酵液用乙酸乙酯萃取，之后合并萃取液，浓缩，得到白桦脂酸。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，萃取方法为：置于23-27℃下超声提取0.8-1.2h。
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