CN112159789A

CN112159789A - 土元粉在促进桦褐孔菌生长并诱导多酚积累上的应用

Info

Publication number: CN112159789A
Application number: CN202011113144.XA
Authority: CN
Inventors: 赵艳霞; 郑维发; 袁雯雯; 孙梦妮
Original assignee: Jiangsu Normal University
Current assignee: Jiangsu Normal University
Priority date: 2020-10-17
Filing date: 2020-10-17
Publication date: 2021-01-01
Anticipated expiration: 2040-10-17
Also published as: CN112159789B

Abstract

本发明涉及真菌发酵应用领域，公开了土元粉在促进桦褐孔菌生长并诱导多酚积累上的应用。具体为固体或液体发酵培养条件下，在培养基中添加土元粉促进桦褐孔菌生长并诱导多酚类化合物积累的应用。针对野生桦褐孔菌生长在寒冷地区，自然条件下生长极为缓慢，人工培养桦褐孔多酚类化合物积累甚微，均无法满足生产的需求等问题，本发明采取固体或液体发酵方法，模拟生态环境开展昆虫激发子对桦褐孔菌生长发育、多酚积累和抗氧化活性的调控研究，为解决桦褐孔菌菌丝体和多酚类化合物的原料来源奠定基础。

Description

土元粉在促进桦褐孔菌生长并诱导多酚积累上的应用

技术领域

本发明涉及真菌发酵应用领域，具体涉及土元粉在促进桦褐孔菌生长并诱导多酚积累上的应用。

背景技术

桦褐孔菌（Inonotus obliquus）是一种主要寄生于白桦树干的药用真菌(黄年来,2002)。长期实践证明，桦褐孔菌对严重危害人类健康的多种疾病有确切的疗效且没有明显毒副作用(Mizuno et al., 1999)。桦褐孔菌能产生多种类型的次级代谢产物，主要包括黑色素(Kukulianskaia et al., 2002)、萜类(Shin et al., 2002)和多酚类(Lee et al.,2007)等。多酚类化合物具有抗氧化活性，对多种肿瘤细胞和病毒的增殖具有显著抑制作用(Singh et al., 2003)，对氧化胁迫诱导的癌症、高血压、糖尿病和老年痴呆症等具有潜在的预防和治疗作用(Zheng et al., 2009;Zjawiony 2004)。然而野生桦褐孔菌主要分布在俄罗斯的西伯利亚、北欧及我国长白山等寒冷地区，自然条件下生长极为缓慢，一般要经过10-15年的生长才能有明显的药理功效。因此，野生桦褐孔菌无法作为这类化合物的可靠来源。

为了提高人工培养桦褐孔菌的生长速度和多酚的积累量，国内外学者在培养基的组成、pH值、温度以及通气量等方面做了大量的研究，取得了一定的进展，积累的生物量和多酚的含量仍然很低(Zheng et al., 2010)。

申请人曾以霉菌水提物为诱导剂，试图提高培养菌丝体中酚类化合物的含量，但结果仅从中获得几种黄酮苷类化合物(Zheng et al., 2007)，以双氧水对桦褐孔菌培养体系进行调控，获得了大量的不溶性黑色素及少量黄酮苷元，多酚仅以微量成分存在(Zhenget al., 2009)。野生桦褐孔菌大量积累多酚类化合物是多种环境因子综合作用的结果。在实验室条件下真菌合成抗生素、毒素和色素等次级代谢产物的基因处于沉默或低表达状态。如何经济、有效地提高发酵桦褐孔菌的生长速度和菌丝体中多酚的积累是药用真菌生产面临的主要问题。

自然生长条件下，次级代谢产物的合成是真菌适应生态环境的结果(Keller2019)。野生桦褐孔菌生长在高海拔的寒冷地区，昼夜温差大。冬季遭受高强紫外线照射，夏季易受病原微生物和昆虫的入侵。研究表明病原菌感染、紫外辐射以及昆虫吞噬压力诱导酚类化合物合成代谢关键酶基因的启动，表达如查耳酮合成酶、苯丙氨酸裂解酶、肉桂酸羟化酶和4-香豆酸-CoA连接酶等，从而在菌体内积累大量的酚类化合物（如黄酮类、黑色素等植物防御素）以平衡生存的环境压力(Singh, et al., 2016)。多酚类化合物的大量积累是野生型桦褐孔菌在特定的环境压力下的产物。由于人工培养环境缺少病原菌或昆虫等侵袭压力，导致桦褐孔菌酚类化合物积累甚微，并且人工培养的桦褐孔菌药理学活性较低，这是桦褐孔菌人工培养面临的难题。

在生态系统中，真菌与昆虫之间存在复杂而密切的关系。在昆虫和真菌的共进化过程中，真菌形成了特殊的代谢与防御系统，产生的次级代谢产物更加丰富。药用昆虫土元主要生存在腐殖质多的林地下或阴湿的松土中，具有破血逐瘀，续筋接骨的功效，其主要的活性成分包括多种蛋白（酶）、氨基酸、不饱和脂肪酸、微量元素等(王凤霞和吉爱国 2009;Ge et al., 2012)。

发明内容

针对野生桦褐孔菌生长在寒冷地区，自然条件下生长极为缓慢，人工培养桦褐孔菌多酚类化合物积累甚微，均无法满足生产的需求等问题，本发明的目的在于提供土元粉在促进桦褐孔菌生长并诱导多酚积累上的应用。本发明采取固体或液体发酵方法，模拟生态环境开展昆虫激发子对桦褐孔菌生长和多酚积累的调控研究，为解决桦褐孔菌的原料来源奠定基础。

土元粉在促进桦褐孔菌生长并诱导多酚积累上的应用。

作为改进的是，应用的具体步骤如下：取培养基，并向培养基中加入土元粉，接种桦褐孔菌，培养，得驯化后的桦褐孔菌。

进一步改进的是，所述培养基为固体培养基或液体培养基。

进一步改进的是，所述液体培养基的配方为按质量分数计包括葡萄糖2%，蛋白胨0.35%，酵母膏提取物2%，KH₂PO₄ 0.01%，MgSO₄×7H₂O 0.05%，余量为去离子水，pH值5.5。

作为改进的是，当所述培养基为固体培养基时，所述土元粉的添加量为2 g/L。

作为改进的是，当所述培养基为液体培养基时，所述土元粉的添加量为1 g/L。

本专利采取固体或液体发酵方法，以土元虫体的粉末（即土元粉）为刺激因子，激发药用真菌桦褐孔菌的生长和多酚类化合物的积累。在培养基中添加不同浓度的土元虫体粉末，可极显著的增加桦褐孔菌的生长速度，增加生物量和多酚类化合物的积累；作为激发子的土元来源广泛、价格便宜。

有益效果：

与现有技术相比，本发明土元粉在促进桦褐孔菌生长并诱导多酚积累上的应用，具有如下优势：

1、以土元粉为昆虫激发子，可以显著性的提高桦褐孔菌生物量的积累；

2、以土元粉为昆虫激发子，可以显著性的促进桦褐孔菌菌丝体中多酚类化合物的合成。

3、药用昆虫土元的主要活性成分包括多种蛋白（酶）、氨基酸、不饱和脂肪酸、微量元素等，具有破血逐瘀，续筋接骨的功效，以土元粉末为激发子具有安全性，且土元来源广泛、价格便宜。

附图说明

图1为土元粉对固体培养桦褐孔菌生长发育的影响，（A）桦褐孔菌在含有不同浓度土元粉培养基中生长的图片，（B）土元粉对桦褐孔菌菌落直径的影响；

图2为土元粉对固体培养桦褐孔菌菌丝体内多酚类化合物积累的影响；

图3为土元粉对液体发酵桦褐孔菌生物量积累的影响；

图4为土元粉对液体发酵桦褐孔菌菌丝体内多酚类化合物积累的影响。

具体实施方式

本发明所用的桦褐孔菌（Inonotus obliquus ATCC22881）购自美国典型培养物保藏中心。

桦褐孔菌液体培养基包括按质量分数计的组分为：葡萄糖(2%)，蛋白胨(0.35%)，酵母膏提取物(2%)，KH₂PO₄ (0.01%)，MgSO₄.7H₂O (0.05%)，余量为去离子水，pH值5.5。

桦褐孔菌固体培养基是在液体培养基中加入质量分数为1.5%的琼脂粉。

土元粉购自广济堂大药房。

实施例1 固体培养条件下，土元粉对桦褐孔菌的生长和多酚积累的影响

昆虫激发子（土元粉）对桦褐孔菌生物量的影响

在桦褐孔菌固体培养基中添加不同量的土元粉，使培养基中土元粉的浓度分别为：1、2、3、4、6 g/L，以不加土元粉的培养基为对照，接种桦褐孔菌菌种（9厘米的培养皿接种直径为0.5厘米的菌柄）后置于26±1℃ 培养箱中静置，在培养的第7 d和第14 d拍照，并测定菌落直径。土元粉的添加可以显著的促进桦褐孔菌的生长发育，随着土元粉浓度的增加，桦褐孔菌的生长速度逐渐增加，结果如图1。

昆虫激发子（土元粉）对桦褐孔菌多酚积累的影响

用刮刀收集平板中的菌丝体，以乙酸乙酯为提取溶剂，利用闪式提取法提取桦褐孔菌菌丝体内酚类化合物。将菌丝体将入含有乙酸乙酯的离心管中，利用闪式机提取1 min (功率300～400 W)，4800 r/min离心10 min，取上清溶液，重新加入乙酸乙酯，进行闪式提取，重复提取三次，合并提取液。利用Folin-Ciocalteu法测定多酚的含量。结果如图2所示，不同浓度的土元粉均能提高桦褐孔菌多酚的积累量，当土元粉浓度为2 g/L时，所积累的多酚含量最多，约为4.98 mg/plate。

实施例2 液体培养条件下，土元粉对桦褐孔菌的生长和多酚积累的影响

（1）昆虫激发子（土元粉）对桦褐孔菌生物量的影响

接种桦褐孔菌菌种于液体培养基中，置于26±1℃、180 r/min条件下培养5 d至对数生长期。在无菌条件下，用FLUKO匀浆机于400 W匀浆菌丝体1 min，取匀浆液7.5 mL，接种于含150 mL培养液的500 mL培养瓶中，其中培养液中含有不同浓度的土元粉：0、1 、2、3、4、6 g/L，以不加土元粉的培养液为对照，接种桦褐孔菌菌种后置于摇床上进行培养，培养温度为26±1℃，摇床转速180 r/min。首先称量干燥后的滤纸片，取5 mL桦褐孔菌培养物培养物，过滤，用蒸馏水洗涤两次后，干燥、称重，并计算生物量。

土元粉的添加可以显著的促进桦褐孔菌的生长发育，随着土元粉浓度的增加，桦褐孔菌的生长速度逐渐增加。培养至16d，土元粉的浓度为3～6 g/L时，桦褐孔菌的生物量达最高，约为32 g/L（图3）。

（2）昆虫激发子（土元粉）对桦褐孔菌内多酚积累的影响

利用过滤法收集不同培养条件下的菌丝体，以乙酸乙酯为提取溶剂，利用闪式提取法提取桦褐孔菌菌丝体内酚类化合物。采用Folin-Ciocalteu法测定多酚的含量。土元粉的添加影响桦褐孔菌多酚类化合物的积累，当土元粉浓度为1 g/L时，多酚的积累量较对照有明显的提高，约为14 mg/L，随着土元粉浓度的增加，虽然桦褐孔菌的生物量积累有所增加，但是菌丝体内的多酚含量降低（图4）。因此，在以土元粉为激发子诱导液体发酵桦褐孔菌产多酚的生产中，土元粉的浓度选择1g/L。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，本发明的保护范围不限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可显而易见地得到的技术方案的简单变化或等效替换均落入本发明的保护范围内。

Claims

1.土元粉在促进桦褐孔菌生长并诱导多酚积累上的应用。

2.根据权利要求1所述的土元粉在促进桦褐孔菌生长并诱导多酚积累上的应用，其特征在于，取培养基，并向培养基中加入土元粉，接种桦褐孔菌，摇床培养，得驯化后的桦褐孔菌。

3.根据权利要求2所述的土元粉在促进桦褐孔菌生长并诱导多酚积累上的应用，其特征在于，所述培养基为固体培养基或液体培养基。

4.根据权利要求3所述的土元粉在促进桦褐孔菌生长并诱导多酚积累上的应用，其特征在于，所述液体培养基的配方为按质量分数计包括葡萄糖2%，蛋白胨0.35%，酵母膏提取物2%，KH₂PO₄ 0.01%，MgSO₄×7H₂O 0.05%，余量为去离子水，pH值5.5。

5.根据权利要求3所述的土元粉在促进桦褐孔菌生长并诱导多酚积累上的应用，其特征在于，当所述培养基为固体培养基时，所述土元粉的添加量为2 g/L。

6.根据权利要求3所述的土元粉在促进桦褐孔菌生长并诱导多酚积累上的应用，其特征在于，当所述培养基为液体培养基时，所述土元粉的添加量为1 g/L。