CN102835245B

CN102835245B - 一种蝉花的仿生培养方法

Info

Publication number: CN102835245B
Application number: CN201110174054.6A
Authority: CN
Inventors: 陈祝安; 谭悠久; 曾奕婷; 吕雯婷; 盖悦; 王玉芹; 孙长胜
Original assignee: Zhejiang Faya Biological Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Pan Asia Biopharmaceutical Co ltd
Priority date: 2011-06-24
Filing date: 2011-06-24
Publication date: 2014-03-26
Anticipated expiration: 2031-06-24
Also published as: CN102835245A

Abstract

本发明公布了一种蝉花的仿生培养方法，包括菌种分离、筛选、孢子培养、浸染感染体、介质培养、采收等步骤及其培养条件。该方法能够模拟野生生态环境，克服野生蝉花生长周期以及季节的限制，易于规模化培养，培养出来的仿生蝉花腺苷含量高于野生蝉花，品质高，极具市场推广价值。

Description

一种蝉花的仿生培养方法

技术领域

本发明属于生物领域，具体涉及以一种利用真菌蝉拟青霉(Paecilomyces cicadae(Miquel)Samson)、昆虫体和介质进行蝉花仿生培育的方法。

背景技术

蝉花，是我国名贵中药材。关于蝉花的药用历史，早在南北朝雷斅的《雷公炮炙论》就有加工蝉花的记载。《经史证类备急本草》则记载“蝉花味甘寒，无毒，主小儿天吊、惊痫、瘛疯、夜啼、心悸”。因其有性阶段跟冬虫夏草同属，民间常用其为冬虫夏草的替代品。

蝉花含有丰富的营养素和生物活性物质，研究证实蝉花含有丰富的蛋白质、氨基酸、微量元素、脂肪酸、维生素以及糖类等营养物质；此外还含有多糖、虫草酸、腺苷、麦角甾醇、透明质酸、多球壳菌素等生理活性成分。蝉花中含有多种不同类型的化合物，正是这些物质使得蝉花具有广泛而神奇的药理学功效。蝉花主要有如下药理作用：(1)免疫调节作用，蝉花有显著促进正常小鼠体液免疫功能和提高巨噬细胞吞噬功能的作用。(2)抗肿瘤作用，研究表明，蝉花粗提物对癌细胞的生长有明显的抑制作用，且存在剂量关系，抑瘤作用与细胞周期有相关性。(3)造血功能，通过蝉花对造血功能的影响的实验研究，发现蝉花对小鼠失血性贫血和抗盐酸笨肼贫血有明显的改善和治疗作用，提示蝉花有促进造血系统功能。(4)降血糖作用，蝉花水煎液对四氧嘧啶造成的糖尿病小鼠有显著的降低血糖的作用，而且呈现明显的量效关系。(5)抗应激、抗疲劳的作用，蝉花水煎剂能明显延长实验小鼠的游泳时间，明显提高常压缺氧状态下的存活时间及在高温下的存活时间，表明蝉花水煎剂有抗应激、抗疲劳的作用。(6)调节脂类物质代谢，蝉拟青霉有利于大鼠体内脂类物质的运输、转化代谢。用500mg/kg的蝉拟青霉大鼠皮下注射12d后，与生理盐水对照组比较，发现大鼠血液中碱性磷酸酶、尿素氮、胆固醇下降，其中胆固醇下降明显。(7)抗衰老作用，蝉花水煎剂高剂量组对雄性果蝇能显著地延长寿命，表明其有一定的抗衰老作用。(8)清除自由基，蝉拟青霉总多糖是一种良好的自由基清除剂或自由基反应抑制剂。(9)抗慢性肾衰竭，以蝉花进行临床研究，发现其具有降低血、尿肌酐，提高内生肌酐清除率，改善血清蛋白含量、减少尿蛋白的排出等功能。(10)抗病毒作用，蝉花水煎剂对单纯疱疹病毒具有强烈的抑制效果，在处理非洲绿猴肾细胞研究中，预防效果明显优于治疗效果。

蝉花分布在我国南方安徽、云南、福建、浙江、江西、广东、四川、陕西以及亚洲的热带、亚热带地区。蝉花盛发季节在6月下旬到7月中旬，8～9月份仅有零散分布。蝉花因其药用价值已经被老百姓所广泛认可，但野生蝉花资源的稀缺性和产生的季节性，其产量远不能满足市场需求。

发明内容

本发明的目的在于提供一种蝉花的仿生培养方法，该方法能够模拟野生生态环境，克服野生蝉花生长周期限制，使生产不受季节限制，而且易于规模化培养和采收，培养出来的蝉花腺苷含量高于野生蝉花。

蝉花仿生培养方法步骤如下：

1.菌株分离：从天然禅花上收集蝉拟青霉Paecilomyces cicadae(Miquel)Samson分生孢子，并对其进行分离纯化；

2.菌株筛选：将步骤(1)分离纯化获得的菌株转接到产子实体培养基上，筛选生长快，子实体产生丰富、粗壮的菌株；

3.孢子培养：将步骤(2)筛选获得的菌株转接到产孢子培养基上，培养并收集分生孢子，将收集到的孢子配制成孢子液；

4.浸染虫体：用步骤(3)制备的孢子液处理感染体；

5.介质培养：将步骤(4)处理得到的感染体埋至介质中培养；

6.收获蝉花。

进一步的，蝉花仿生培养步骤(1)中所述菌株分离包括以下两步：

a)从天然蝉花上收集蝉拟青霉分生孢子；

b)通过平板培养基，对步骤a)中收集得到的蝉拟青霉分生孢子进行菌株纯化，挑菌落生长旺盛，孢子致密，无角变的菌株作为单孢子株系。

较优的，所述平板培养基为马铃薯-蔗糖-琼脂培养基或者马铃薯-葡萄糖-琼脂培养基。

较优的，蝉花仿生培养步骤(2)中所述子实体培养基为谷类培养基；进一步的，该谷类培养基中包括下列重量份的原料组分：

谷类 30～40

水 60～70。

较优的，谷类培养基中的谷类为大米、小米、玉米、小麦、大麦、高粱或其混合物。

较优的，蝉花仿生培养步骤(3)中产孢子培养基为麸皮-蚕蛹粉培养基；进一步的，该麸皮-蚕蛹粉培养基中包括下列重量份的原料组分：

麸皮 40～50

蚕蛹粉 5～10

水 45～50。

进一步的，蝉花仿生培养步骤(3)中，孢子的培养条件为24～26℃，培养10～15天。

进一步的，蝉花仿生培养步骤(3)中，采用体积百分比0.01～0.05％的吐温80配制孢子液。

进一步的，蝉花仿生培养步骤(3)中，制备的孢子液的浓度范围为1×10⁶～1×10⁷个/ml。

进一步的，蝉花仿生培养步骤(4)中所述孢子液处理感染体，是将感染体浸泡到孢子液中1～3分钟后捞起，将处理后的感染体置于灭菌容器中，保持温度24～26℃、湿度80～90％，培养7～10天。

进一步的，蝉花仿生培养步骤(4)中，感染体为家蚕蛹、柞蚕蛹或蚱蝉若虫。

进一步的，蝉花仿生培养步骤(5)中，所述介质为砂子、蛭石、珍珠岩、沸石、植金石、木屑或其混合物。

进一步的，蝉花仿生培养步骤(5)中，感染体在介质中的培养条件为：温度20～22℃、湿度80～90％，光强50～100Lux的全光谱光源，培养15～20天。

进一步的，蝉花仿生培养步骤(6)中所述的收获蝉花，是将培养的蝉花从介质中挖出，去除表面附着的介质后，在-50～-40℃真空冷冻干燥脱水。

本发明与现有技术相比，所用的菌株从是从天然蝉花上收集蝉拟青霉分生孢子，再通过单孢子分离纯化，经产子实体培养基培养筛选获得的生长快，产子实体丰富、粗壮的菌株。产孢子培养基是麸皮-蚕蛹粉培养基，菌株在该培养基上产孢丰富。感染昆虫选用家蚕蛹、柞蚕蛹或蚱蝉若虫，是因为上述昆虫来源广泛，民间有食用习惯，其安全性可以保证。培养介质为砂子、蛭石、珍珠岩、沸石、植金石、木屑或其混合物。培养介质砂子、蛭石、珍珠岩、沸石、植金石、木屑或其混合物因其多孔隙，有良好的透气性、吸水性、持水力，可以很好的替代野生环境的土壤介质，且便于采收。所用的介质均经过筛网过筛、清洗、灭菌处理，经检测重金属含量低。侵染虫体阶段控制环境因素，保持温度24～26℃、湿度80～90％，利于菌丝生长。介质培养阶段控制环境因素，保持温度20～22℃、湿度80～90％，光强50～100Lux的全光谱光源，利于子实体生长。通过介质培养，控制环境中的温度、水分、光照，完全具有仿生效果。

附图说明

图1：本发明的仿生蝉花在介质砂子中的生长情况

图2：本发明采收后的仿生蝉花

图3：本发明的仿生蝉花在介质植金石中的生长情况

图4：本发明仿生蝉花成分的HPLC图谱

具体实施方式

以下为本发明的具体实施案例，所列实例旨在举例说明而不是限制本发明。

实施例1

从天然蝉花上收集蝉拟青霉分生孢子，通过稀释法将孢子稀释，涂布马铃薯-蔗糖-琼脂平板，25℃倒置培养7天后，获得单菌落。挑菌落生长旺盛，孢子致密，无角变的菌株作为单孢子株系。

将单孢子株系蝉拟青霉接种到子实体形成培养基上(大米、水，比例40∶60)，22℃培养30天。挑生长快，子实体产生丰富、粗壮的菌株。

将筛选获得的菌株转接到产孢子培养基(麸皮、蚕蛹粉、水，比例40∶10∶50)上，25℃培养15天，收集分生孢子，采用0.05％吐温80水将分生孢子配制成1×10⁶个/ml浓度的孢子液。

用孢子液浸泡柞蚕蛹3分钟后，捞起，放入灭菌容器中，保持温度25℃、湿度80％，10天，待分生孢子萌发产生的菌丝完全侵入虫体后。将虫体埋入经过筛网过筛、清洗、灭菌处理的砂子中，保持温度20℃、湿度90％，保持光强100Lux的全光谱光源，培养18天。蝉花在介质砂子中的生长情况如图1所示。

将蝉花从介质中挖出，去除表面附着的介质后，-50℃真空冷冻干燥脱水后，获得蝉花如图2所示。

实施例2

从天然蝉花上收集蝉拟青霉分生孢子，通过稀释法将孢子稀释，涂布马铃薯-葡萄糖-琼脂培养基平板，25℃倒置培养7天后，获得单孢子菌落。挑菌落生长旺盛，孢子致密，无角变的菌株接种到子实体形成培养基上(小米、水，比例35∶65)，22℃培养30天。将生长快，子实体产生丰富、粗壮的菌株。

将筛选获得的菌株转接到产孢子培养基(麸皮、蚕蛹粉、水，比例45∶8∶47)上，26℃培养14天，收集分生孢子，采用0.04％吐温80水将分生孢子配制成3×10⁶/ml浓度的孢子液。

用孢子液浸泡家蚕蛹2.5分钟后，捞起，放入灭菌容器中，24℃保温、湿度90％，9天，待分生孢子萌发产生的菌丝完全侵入虫体后。将虫体埋入经过筛网过筛、清洗、灭菌处理的蛭石中，保持温度21℃、湿度85％，保持光强90Lux的全光谱光源，培养17天。

将获得的蝉花从介质中挖出，去除表面附着的介质后，-40℃真空冷冻干燥脱水。

实施例3

从天然蝉花上收集蝉拟青霉分生孢子，通过稀释法将孢子稀释，涂布马铃薯-蔗糖-琼脂平板，25℃倒置培养7天后，获得单孢子菌株。挑菌落生长旺盛，孢子致密，无角变的菌株接种到子实体形成培养基上(大麦、水，比例40∶60)，22℃培养30天。将生长快，子实体产生丰富、粗壮的菌株，接种到表面消毒的蚱蝉若虫虫体上，保持对昆虫的致病能力。

将筛选获得的菌株转接到产孢子培养基(麸皮、蚕蛹粉、水，比例50∶5∶45)上，24℃培养13天，收集分生孢子，采用0.03％吐温80水将分生孢子配制成1×10⁷个/ml浓度的孢子液。

用孢子液浸泡蚱蝉若虫2分钟后，捞起，放入灭菌容器中，保持温度26℃、湿度85％，8天，待分生孢子萌发产生的菌丝完全侵入虫体后。将虫体埋入经过筛网过筛、清洗、灭菌处理的珍珠岩中，保持温度20℃、湿度80％，保持光强80Lux的全光谱光源，培养20天。

将获得的蝉花从介质中挖出，去除表面附着的介质后，-45℃真空冷冻干燥脱水。

实施例4

从天然蝉花上收集蝉拟青霉分生孢子，通过稀释法将孢子稀释，涂布马铃薯-葡萄糖-琼脂平板，25℃倒置培养7天后，获得单孢子菌株。挑菌落生长旺盛，孢子致密，无角变的菌株接种到固体发酵培养基上(小麦、水，比例30∶70)，22℃培养30天。将生长快，子实体产生丰富、粗壮的菌株。

将筛选获得的菌株转接到产孢子培养基(麸皮、蚕蛹粉、水，比例50∶5∶45)上，25℃培养12天，收集分生孢子，采用0.02％吐温80水将分生孢子配制成7×10⁶个/ml浓度的孢子液。

用孢子液浸泡家蚕蛹1.5分钟后，捞起，放入灭菌容器中，保持温度25℃、湿度85％，7天，待分生孢子萌发产生的菌丝完全侵入虫体后。将虫体埋入经过筛网过筛、清洗、灭菌处理的沸石中，保持温度21℃、湿度85％，保持光强70Lux的全光谱光源，培养15天。

将获得的蝉花从介质中挖出，去除表面附着的介质后，-50℃真空冷冻干燥脱水。

实施例5

从天然蝉花上收集蝉拟青霉分生孢子，通过稀释法将孢子稀释，涂布马铃薯-蔗糖-琼脂培养基平板，25℃倒置培养7天后，获得单孢子菌株。挑菌落生长旺盛，孢子致密，无角变的菌株接种到固体发酵培养基上(玉米、水，比例30∶70)，22℃培养30天。将生长快，子实体产生丰富、粗壮的菌株。

将筛选获得的菌株转接到产孢子培养基(麸皮、蚕蛹粉、水，比例45∶8∶47)上，24℃培养10天，收集分生孢子，采用0.01％吐温80水将分生孢子配制成9×10⁶个/ml浓度的孢子液。

用孢子液浸泡柞蚕蛹1分钟后，捞起，放入灭菌容器中，保持温度25℃、湿度90％，7天，待分生孢子萌发产生的菌丝完全侵入虫体后。将虫体埋入经过筛网过筛、清洗、灭菌处理的植金石中，保持温度22℃、湿度90％，保持光强60Lux的全光谱光源，培养16天，仿生蝉花在介质植金石中的生长情况如图3所示。

实施例6

从天然蝉花上收集蝉拟青霉分生孢子，通过稀释法将孢子稀释，涂布马铃薯-葡萄糖-琼脂培养基平板，25℃倒置培养7天后，获得单孢子菌株。挑菌落生长旺盛，孢子致密，无角变的菌株接种到固体发酵培养基上(高粱、水，比例30∶70)，22℃培养30天。将生长快，子实体产生丰富、粗壮的菌株，接种到表面消毒的蚱蝉若虫虫体上，保持对昆虫的致病能力。

将筛选获得的菌株转接到产孢子培养基(麸皮、蚕蛹粉、水，比例45∶8∶47)上，25℃培养11天，收集分生孢子，采用0.05％吐温80水将分生孢子配制成6×10⁶个/ml浓度的孢子液。

用孢子液浸泡蚱蝉蛹1分钟后，捞起，放入灭菌容器中，保持温度26℃、湿度90％，7天，待分生孢子萌发产生的菌丝完全侵入虫体后。将虫体埋入经过筛网过筛、清洗、灭菌处理的木屑中，保持温度21℃、湿度90％，保持光强50Lux的全光谱光源，培养19天。

实施例7

采用高效液相色谱法，对仿生蝉花腺苷含量测定。

精密称取50mg腺苷对照品，置50mL容量瓶中，加超纯水溶解并稀释至刻度制成1mg/mL溶液。精密移取适量1mg/mL腺苷对照品溶液，分别配制成100μg/mL、50μg/mL、30μg/mL、10μg/mL、5μg/mL和1μg/mL腺苷对照品溶液，备用。

精密称取1.0118g来自实施例1获得仿生蝉花粉末，于100mL具塞锥形瓶中，加10mL石油醚(60-90℃)，超声30min。过滤，挥发干石油醚，连同滤纸一并放入瓶中。在瓶中加入20mL超纯水，称总重(包括锥形瓶重量)，超声30min。快速冷却后称重，以超纯水补至总重，混匀后离心，取上清液，过针筒式滤器得样品提取液。

将对照品1μg/mL、5μg/mL、10μg/mL、30μg/mL、50μg/mL、100μg/mL溶液进样，以样品浓度(μg/mL)为横坐标，峰面积(微伏·秒)为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程。

制备的供试样品溶液与超纯水以1∶1的比例混匀，制成待测液。取待测液按色谱条件：色谱柱XBridge C18色谱柱(Waters，4.6mm×250mm，5μm)；流动相：乙腈-0.04mol/L磷酸二氢钾(5∶95)；流速：1.0mL/min；检测波长：260nm；柱温：35℃；进样量：20μL。由回归方程计算得到待测液腺苷浓度，根据下列公式得到供试品腺苷含量(mg/g)。计算公式如下：

其中x为待测液腺苷浓度，v代表待测样品体积，m为待测样品质量。

对采集的三种天然禅花以及本发明的仿生蝉花中腺苷浓度进行HPLC分析并计算其腺苷含量，实验结果见表1，本发明仿生蝉花成分的HPLC分析见图4。

表1天然蝉花与仿生蝉花腺苷含量比较

由表1可见本发明培养出来的仿生蝉花中的腺苷含量高于野生蝉花。

Claims

1.一种蝉花的仿生培养方法，其步骤如下：

（1）菌株分离：从天然蝉花上收集蝉拟青霉Paecilomyces cicadae(Miquel)Samson分生孢子，并对其进行分离纯化；

（2）菌株筛选：将步骤（1）分离纯化获得的菌株转接到产子实体培养基上，筛选生长快，子实体产生丰富、粗壮的菌株；

（3）孢子培养；将步骤（2）筛选获得的菌株转接到产孢子培养基上，培养并收集分生孢子，而后将收集到的孢子配制成孢子液，所述产孢子培养基为麸皮-蚕蛹粉培养基，包括下列重量份的原料组分：麸皮40～50，蚕蛹粉5～10，水45～50；

（4）浸染感染体：用步骤（3）制备的孢子液处理感染体，所述的感染体为家蚕蛹、柞蚕蛹或蚱蝉若虫；

（5）介质培养：将步骤（4）处理得到的感染体埋至介质中培养，所述的介质为砂子、蛭石、珍珠岩、沸石、植金石、木屑或其混合物；

（6）收获蝉花。

2.如权利要求1所述的蝉花的仿生培养方法，其特征在于，步骤（1）中菌株的分离纯化包括以下两步：

a)从天然蝉花上收集蝉拟青霉分生孢子；

3.如权利要求2所述的蝉花的仿生培养方法，其特征在于，步骤a)中所述的平板培养基为马铃薯-蔗糖-琼脂培养基或者马铃薯-葡萄糖-琼脂培养基。

4.如权利要求1所述的蝉花的仿生培养方法，其特征在于，步骤（2）中所述的子实体培养基为谷类培养基。

5.如权利要求4所述的蝉花的仿生培养方法，其特征在于，所述的谷类培养基中包括下列重量份的原料组分：

谷类 30～40

水 60～70。

6.如权利要求5所述的蝉花的仿生培养方法，其特征在于，所述谷类为大米、小米、玉米、小麦、大麦、高粱或其混合物。

7.如权利要求1所述的蝉花的仿生培养方法，其特征在于，步骤（3）中孢子的培养条件为24～26℃，培养10～15天。

8.如权利要求1所述的蝉花的仿生培养方法，其特征在于，步骤（3）中采用体积百分比0.01～0.05%的吐温80配制孢子液。

9.如权利要求1所述的蝉花的仿生培养方法，其特征在于，步骤（3）制备的孢子液的浓度范围为1×10⁶～1×10⁷个/ml。

10.如权利要求1所述的蝉花的仿生培养方法，其特征在于，步骤（4）中所述孢子液处理感染体，是将感染体浸泡到孢子液中1～3分钟后捞起，将处理后的感染体置于灭菌容器中，保持温度24～26℃、湿度80～90%，培养7～10天。

11.如权利要求1所述的蝉花的仿生培养方法，其特征在于，步骤（5）中所述的感染体在介质中的培养条件为：温度20～22℃、湿度80～90%，光强50～100Lux的全光谱光源，培养15～20天。

12.如权利要求1所述的蝉花的仿生培养方法，其特征在于，步骤（6）中所述的收获蝉花，是将培养的蝉花从介质中挖出，去除表面附着的介质后，在-50℃～-40℃真空冷冻干燥脱水。