CN1219879C - 淡紫灰链霉菌海南变种及由该菌种制备农用抗生素的方法 - Google Patents

淡紫灰链霉菌海南变种及由该菌种制备农用抗生素的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN1219879C
CN1219879C CN 200310103250 CN200310103250A CN1219879C CN 1219879 C CN1219879 C CN 1219879C CN 200310103250 CN200310103250 CN 200310103250 CN 200310103250 A CN200310103250 A CN 200310103250A CN 1219879 C CN1219879 C CN 1219879C
Authority
CN
China
Prior art keywords
variety
hainan
cgmcc
rhzomorph
lilac grey
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Lifetime
Application number
CN 200310103250
Other languages
English (en)
Other versions
CN1539957A (zh
Inventor
朱昌雄
蒋细良
谢德龄
倪楚芳
许鸿章
孙东园
姬军红
赵立平
田云龙
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Fujian Kaili Bio Product Co ltd
Institute of Environment and Sustainable Development in Agriculturem of CAAS
Original Assignee
Suzhou Kaili Biological Products Co ltd
INST OF BIOLOG CONTROL CHINESE
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Suzhou Kaili Biological Products Co ltd, INST OF BIOLOG CONTROL CHINESE filed Critical Suzhou Kaili Biological Products Co ltd
Priority to CN 200310103250 priority Critical patent/CN1219879C/zh
Publication of CN1539957A publication Critical patent/CN1539957A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN1219879C publication Critical patent/CN1219879C/zh
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Landscapes

  • Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)

Abstract

本发明公开了淡紫灰链霉菌海南变种CGMCC No.1026。由CGMCC No.1026发酵后得到一类化合物，如式I所示，其中n为1-6的正整数。以CGMCCNo.1026经发酵后的发酵液，即中生菌素，含有式I类化合物中的一种或几种纯化合物，可以防治农作物病害，特别是防治农作物细菌性病害，且具有高效、低毒、低残留的优点。

Description

淡紫灰链霉菌海南变种及由该菌种制备农用抗生素的方法
技术领域
本发明涉及链霉菌属的新菌种及由它制备农用抗生素的方法。
背景技术
农药是重要的农业生产资料，在保证农作物的高产、稳产中发挥着十分重要的作用。目前，我国每年使用农药制剂高达100多万吨，合原药30多万吨(折纯)，农药品种200多种。面对着巨大的农药需求和大量的投入，我国农药工业不得不走仿制国外已过专利保护期的一些农药品种，这导致了我国农药创制的落后和品种结构的不合理。突出地表现在3个70％现象：杀虫剂占农药的70％，剧毒和高毒农药占杀虫剂的70％，其中有机磷有机氯农药占高毒剧毒农药的70％。
微生物农药通常指用微生物及其代谢产物制造的农药。由于我国幅员辽阔，气候条件、土壤类型、植物种类等多种多样，这就为开发新型微生物农药提供了良好的条件。
发明内容
本发明的目的是提供一种链霉菌属的新菌种，它能够产生一类新的N-糖甙类抗生素。该抗生素对农作物细菌性和真菌性病害具有防治作用。
本发明的另一目的是提供由该新菌种制备该类抗生素的方法。
为实现上述目的，本发明采取以下方案：
将淡紫灰链霉菌海南变种，通过发酵罐液体深层发酵，发酵液内含有一类糖甙类化合物，这类化合物称为中生素菌。中生菌素对农作物病害，特别是农作物细菌性病害有明显的防治作用。
本发明所述的淡紫灰链霉菌海南变种(Streptomyces lavendulae var.hainanensis)已于2003年10月29日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为CGMCC No.1026。
CGMCC No.1026是由自然分离的野生链霉菌，经菌种选育后得到。
CGMCC No.1026具有以下微生物特性：
1.形态学特性
该菌种在多种分类培养基上，都能形成发育良好的气生菌丝体及基内菌丝体，菌丝单杈分枝，在气生菌丝体顶端形成卷曲的螺旋形孢子丝1-4圈。常形成10个以上的分生孢子链，孢子圆形或椭圆形(0.6-0.8×1-1.2μm)，孢子表面光滑。
2.培养学特性
该菌种在通常的分类培养基及国际链霉菌规划拟定的培养基(简称ISP培养基)上，形成粉末状气生菌丝体，灰白或微粉的灰色、淡紫灰至暗紫灰，基内菌丝体乳脂色或浅黄色至芥黄色，无可溶性色素。可参见表1。
               表1淡紫灰链霉菌海南变种的培养特征
培养基   气生菌丝体   基内菌丝体  可溶性色素
酵母膏麦芽汁琼脂ISP2   粉末状，淡粉-淡紫灰   无-豆汁黄     无
燕麦琼脂ISP3   薄粉状，粉白-淡玫瑰紫   浅黄-象牙黄     无
无机盐淀粉ISP4   粉术状，粉白-淡紫灰   浅黄-淡茧黄     无
甘油天门冬琼脂ISP5   少，灰白   浅蜜黄     无
蛋白胨-铁琼脂ISP6   光秃   褐     褐-黑褐
酪氨酸琼脂ISP7   粉末状、白-灰白   浅黄-炒米黄     无
高氏合成一号琼脂   粉末状、粉白-淡紫灰   浅黄-象牙黄     无
克氏合成一号琼脂   极薄、微灰白   无-淡茧黄     无
察氏蔗糖琼脂   光秃   乳白     无
Bennett’s琼脂   粉末状、白-微粉   淡褐     无-浅褐
Emerson’s琼脂   极薄、微灰白   淡褐     无-浅褐
马铃薯块   光秃   淡褐-褐     浅褐-褐
3.生理特性
a.类黑色素的形成：在蛋白胨-酵母膏-铁琼脂(ISP6)上，形成褐色色素，但在酪氨酸琼脂(ISP7)上，无可溶性色素。
b.明胶液化：阳性。
c.牛奶培养：牛奶凝固并胨化。
d.淀粉水解：阳性。
e.硝酸还原：阳性。
f.纤维素分解：不分解。
淡紫灰链霉菌海南变种能很好地利用葡萄糖、甘露糖、木糖、鼠李糖、阿拉伯糖。其次是果糖、肌醇、菊糖、乳糖、半乳糖。不利用酒石酸钠、甘露醇、棉子糖、醋酸钠、柠檬酸钠。对蔗糖的利用可疑。
中生素菌有6个有效成分，各成分之间依次递增一个β-赖氨酸，其结构见式I。这6个有效成分是一个同系化合物，纸层析结果表明它属于典型的碱性水溶性抗生素类群，混合物的紫外吸收光谱仅显示末端吸收，各组分有类似的红外光谱，在3400，1720，1600，1560，1340和1050cm-1有特征吸收峰，皆为左旋化合物。
                                                            式I
其中n为1-6的正整数。
CGMCC No.1026经发酵得到中生菌素水剂的步骤如下：
将CGMCC No.1026置于摇瓶中进行种子培养，通常条件是温度28～30℃，摇床转速为180～200rpm，培养20～25小时；在种子罐内培养24小时；再转接大罐中发酵60～65小时后，将发酵液进行板框或离心过滤；将滤液调节PH值至4.0-4.5，最后真空浓缩后制得中生菌素水剂成品。
以下发明内容部分是中生菌素的积极效果：
A.中生素菌对一些常见农作物病原菌的抑菌效果见第7页的表2。MIC为最小抑制浓度(Minimal Inhibition Concentration)。中生菌素防治农作物病害的施用方法及效果还可参见第8页的表3。
B.中生素菌对动物的毒性
(1)急性毒性：大白鼠口服，工业品LD50为10000mg/kg，纯品LD50雄性为316mg/kg，雌性为237mg/kg。大白鼠经皮，工业品LD50＞10000mg/kg。
(2)皮肤和眼睛的刺激性：大白兔皮肤试验未见红斑形成，无水肿形成。大白兔眼睛用药后1～24h结膜轻度充血水肿，无分泌物，角膜正常，48h恢复正常。
(3)蓄积毒性：按蓄积系数等于死亡半数时总摄样品量除半数致死量，中生菌素蓄积系数为5.8。
(4)致畸性：大鼠妊娠第6天至第15天连续灌胃10天，剂量为0.766～15.32mg/kg，各剂量每次灌0.5mg/100g体重，对胚胎无影响。经卡平方检验，各剂量级吸收胎数和死胎数、胎鼠骨骼畸形与对照组比较无显著差异，胎鼠内脏未见畸形。
(5)微核试验：没有致染色体损伤的作用，没有致生殖细胞畸变的作用。
(6)致突变性：用Ames标准平板掺入法测定，各剂量级均无致突变作用。
C.中生素菌在植物体、土壤中的残留量
(1)样品制备：选择生长健康的莲白菜地，设对照区与30ppm喷药区，喷药后每天取对照土样、对照菜样、喷药土样、喷药菜样，连续取样10天。菜样放组织捣碎皿中捣碎，加水浸泡24h，用纱布滤去菜渣。滤液用滤纸过滤两次，再用布氏漏斗真空抽滤。滤液于50℃水浴蒸发至少量体积，冷冻干燥。土样加水打散，浸泡24h后，用纱布过滤，再用滤纸、布氏漏斗过滤，滤液浓缩冻干。
(2)样品测定：由于中生菌素属于N-糖甙类抗生素，紫外光谱为末端吸收，一般紫外范围无法检测，只有采用柱前将样品与邻苯二甲醛在适当条件下进行衍生化反应，生成具有荧光的产物，再以反相离子对色谱进行分离后，用荧光检测器检出。本方法灵敏度极高，最小检出量为6.9×10-2ppb，重复性好，相对标准偏差cv值为0.2372％，回收率为97.09％。
(3)测定结果：用药后第1天植物体中检出量为0.185μg/ml，第7天检出量为0.001μg/ml，第8天未检出，这说明中生菌素在自然界中残存量极微，而且时间仅有7天，因此，对环境没有污染，对人畜没有毒害。
从以上结果可知，中生菌素是一种使用安全，易于分解的生物农药。
D.中生素菌的农田示范效果：
a.1991-1996年在河南和北京两地用中生菌素(15-30ppm)防治水稻白叶枯病做了系统的试验和示范，包括不用药剂的对比试验，不同发病程度和防治次数试验，秧田施药保护对大田发病期和发病程度的作用，试验示范面积达2万亩。结果表明，中生菌素防水防治水稻白叶枯病的最佳时期是浸种、再加秧田三叶期和移栽前5天喷雾。如遇严重发病年份，与大田发病初期再喷1-2次，能控制了病情的扩展蔓延，防治效果高达86.3-90.1％，优于化学药剂叶枯净和稻禾壮。
b.1992-2000年在河南汝州、郑州、濮阳，山东的沂源、烟台等地的果园中以中生菌素取代退菌特等常用化学杀菌剂，防治苹果轮纹病(烂果病)和叶斑病，采用15-30ppm中生菌素药液与波多液交替使用，生长期共喷3次中生菌素，烂果率一般可控制在0.47-5％，相当或优于常用化学药剂，使用中生菌素防治的果园，果实大、色泽好、果锈少亦是突出特点之一。
c.1992-2000年在郑州、濮阳、沂源等地果园用中生菌素防治苹果叶病，叶斑病病叶率控制在22％左右，病情指数在8％以下，显著优于退菌特、多菌灵等化学药剂。
本发明的优点：中生菌素可以防治农作物病害，特别是防治农作物细菌性病害，应用范围广，且具有高效、低毒、低残留的优点。
具体实施方式
实施例1：CGMCC No.1026的选育
将自然分离的淡紫灰链霉菌海南变种野生菌株，通过自然选育得到一株菌落大而饱满的菌株，颜色为淡紫色。以此菌株为出发菌株，其效价近400μg/ml，经溶菌酶酶解获得该菌原生质体，再用紫外诱变15-50秒，取得了较好的诱变效果，得到一株CGMCC No.1026，其效价高达6000～7000μg/ml，是出发菌株的17倍。
实施例2：中生菌素水剂的制备
将CGMCC No.1026置于摇瓶中进行种子培养，条件是温度28℃，摇床转速为200rpm，培养24小时。然后在种子罐培养24小时，种子罐中采用LM培养基。种子罐转接发酵罐中发酵60小时后，将发酵液进行板框或离心过滤。将滤液调节PH值至4.0，最后真空浓缩(真空度0.080MPa)后制得中生菌素水剂成品，有效成份含量为10000μg/ml。
培养种子所用的摇瓶培养基为(wt％)：葡萄糖1.0、可溶性淀粉1.5、玉米粉1.0、黄豆饼粉2.0、NH4Cl 0.3、CaCO3 0.3及通用的微量元素。摇瓶装量为500ml瓶装100ml。
种子罐培养基为(wt％)：葡萄糖1.5、玉米粉1.0、黄豆饼粉2.0、NH4Cl0.4、CaCO3 0.3、氯化钠0.5及通用的微量元素。
发酵培养基为(wt％)：葡萄糖2.5、玉米粉1.0、黄豆饼粉2.0、NH4Cl 0.4、CaCO3 0.3、氯化钠0.5及通用的微量元素。
实施例3
将CGMCC No.1026置于摇瓶中进行种子培养，条件是温度30℃，摇床转速为180rpm，培养20小时。然后在种子罐发酵24小时，种子罐中采用与实施例2相同的LM培养基。种子罐转接发酵罐中发酵65小时后，将发酵液进行板框或离心过滤。将滤液调节PH值至4.5，最后真空浓缩(真空度0.080MPa)后制得中生菌素水剂成品，有效成份含量为9900μg/ml。
               表2中生菌素不同组分的抗菌谱(MIC，单位μg/ml)
试验菌                                            n值     发酵液(水剂)
    1     2     3     4     5     6
白菜软腐病菌     50     0.09～0.1     1～2     0.78     0.39     0.78     1.56
西瓜枯萎病菌     25     1.56     0.78     3～4     0.78     0.39     0.78
稻瘟病菌     12.5     3～4     0.39     0.39     0.1～0.2     0.1～0.2     3～4
黑曲霉     50     50     0.78     3～4     1～2     3～4     12.5
白色假丝酵母     12.5     100     3～4     0.78     0.39     0.39     1～2
清酒酵母     25     3～4     0.78     0.1～0.2     3～4     0.04     1～2
变形杆菌     50     6～7     3～4     1～2     1～2     3～4     6～7
大肠杆菌     100     50     12.5     6～7     6～7     12.5     3～4
金黄色葡萄球菌     3～4     1～2     0.1～0.2     0.97     0.09～0.1     0.1～0.2     0.39
八叠球菌     6～7     25     0.39     0.97     0.09～0.1     0.1～0.2     0.39
枯草杆菌     6～7     0.39     0.09     0.1～0.2     0.04     0.09～0.1     0.1～0.2
结核分枝杆菌     6～7     1～2     0.78     0.39     0.78     1～2     0.78
草分枝杆菌     3～4     0.1～0.2     0.39     0.9～1     1～2     0.39     12.5
小麦赤霉菌     12.5     0.097     0.1～0.2     0.39     0.39     0.39     -
油菜黑腐病菌     50     0.97     3～4     1～2     1～2     1～2     -
人参锈病菌     6～7     0.097     1～2     0.1～0.2     0.1～0.2     0.1～0.2     -
               表3中生菌素防治农作物病害及效果
    作物     防治对象 施用方法     防治效果(％)
    水稻     白叶枯病 100μg/ml浸种，15-20μg/ml喷雾2-3次     85-90
    大白菜     软腐病 50μg/ml浸种，20-30μg/ml喷雾2-3次     70-85
    柑桔     溃疡病 20-30μg/ml喷雾4-5次     70-85
    番茄     青枯病 20-30μg/ml灌根2-3次     65-75
    黄瓜     细菌性角斑病 20-30μg/ml喷雾1-2次     80-90
    姜     姜瘟病 50μg/ml浸种，20-30μg/ml灌根2-3次     70-80
    芦苇     茎枯病 20-30μg/ml喷雾2-3次     70-80
    青椒     疮痂病 20-30μg/ml喷雾2-3次     70-80
    苹果树     轮纹病 20-30μg/ml喷雾3-4次     70-80
    西瓜     枯萎病 20-30μg/ml灌根2-3次     60-75

Claims (1)

1.一种淡紫灰链霉菌海南变种(Streptomyces lavendulae var.hainanensis)，其特征在于，所述菌株的保藏号为CGMCC No.1026。
CN 200310103250 2003-11-04 2003-11-04 淡紫灰链霉菌海南变种及由该菌种制备农用抗生素的方法 Expired - Lifetime CN1219879C (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN 200310103250 CN1219879C (zh) 2003-11-04 2003-11-04 淡紫灰链霉菌海南变种及由该菌种制备农用抗生素的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN 200310103250 CN1219879C (zh) 2003-11-04 2003-11-04 淡紫灰链霉菌海南变种及由该菌种制备农用抗生素的方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN1539957A CN1539957A (zh) 2004-10-27
CN1219879C true CN1219879C (zh) 2005-09-21

Family

ID=34333256

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN 200310103250 Expired - Lifetime CN1219879C (zh) 2003-11-04 2003-11-04 淡紫灰链霉菌海南变种及由该菌种制备农用抗生素的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN1219879C (zh)

Families Citing this family (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101180963B (zh) * 2007-12-17 2012-04-18 东莞市瑞德丰生物科技有限公司 含有中生菌素和甲基硫菌灵的具有增效作用的组合物
CN101176452B (zh) * 2007-12-19 2012-04-18 深圳诺普信农化股份有限公司 含有中生菌素和苯醚甲环唑的具有增效作用的组合物
CN102388887B (zh) * 2011-08-02 2013-07-17 南宁市德丰富化工有限责任公司 一种含中生菌素的杀菌组合物
CN103004802B (zh) * 2013-01-15 2014-12-24 福建凯立生物制品有限公司 生物杀菌剂组合物及其应用
CN103039470B (zh) * 2013-01-15 2014-10-15 福建凯立生物制品有限公司 一种杀菌剂组合物及其应用
CN103053552B (zh) * 2013-01-15 2014-11-12 福建凯立生物制品有限公司 农用杀菌剂及其应用
CN103087126A (zh) * 2013-01-30 2013-05-08 杨宏勃 一种中生菌素原药的制备方法
CN103602607B (zh) * 2013-07-31 2015-02-25 江西农业大学 一株淡紫灰链霉菌x33及其应用
CN103444741B (zh) * 2013-09-09 2015-03-04 崔淑华 一种含戊菌唑和中生菌素的杀菌组合物及应用
CN105543124B (zh) * 2015-12-15 2019-04-26 湖北省烟草公司恩施州公司 链霉菌lc-7菌株及其产生的抗生素在防治烟草青枯病中的应用
CN112322611A (zh) * 2020-11-27 2021-02-05 陕西麦可罗生物科技有限公司 一种筛选中生菌素高产菌株的方法
CN114196580B (zh) * 2021-12-14 2023-03-28 福建凯立生物制品有限公司 一种淡紫灰链霉菌海南变种菌株及利用其制备中生菌素制品的方法
CN114317670A (zh) * 2021-12-14 2022-04-12 福建凯立生物制品有限公司 一种筛选培养基及其制备方法和应用
CN114292774A (zh) * 2021-12-14 2022-04-08 福建凯立生物制品有限公司 一种菌丝体或菌体及其应用、及利用其选育菌株的方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN1539957A (zh) 2004-10-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN1219879C (zh) 淡紫灰链霉菌海南变种及由该菌种制备农用抗生素的方法
CN103952362A (zh) 一株对多种植物病原菌具抑菌活性的柑橘内生放线菌
CN106929443B (zh) 一种弧菌lx6-2及其在制备生物海藻肥中的用途
CN108300681A (zh) 一株娄彻氏链霉菌及其应用
EP2735607A1 (en) Strain of Trichoderma harzianum and controlled release composition which contains said strain
CN101280320A (zh) 植物内生真菌球毛壳菌nd35产生抗生物质的制备方法
CN115044487A (zh) 一株具有防治烟草花叶病毒效果的海洋真菌菌株
CN101223879B (zh) 一种防治蔬菜真菌病害的微生物农药的制备方法
CN117511753B (zh) 一株海洋木霉属菌株及其在防治烟草花叶病毒中的应用
CN101011069A (zh) 一种微生物杀线虫剂及其应用
CN101182483B (zh) 链霉菌s1-5及其应用
CN109182216B (zh) 一株对多肉植物茎腐病具有抑制作用的海洋链霉菌scfj-05
CN106906171A (zh) 一种苹果树腐烂病生防菌剂的制备方法
CN1685835A (zh) 一种微生物植物生长调节剂及其制备方法
CN1846505A (zh) 一种微生物抗烟草赤星病剂及其制备方法和应用
CN109400444B (zh) 抑制植物病源真菌的倍半萜类化合物及其制备方法
CN114250176B (zh) 一种微生物防治三七根腐病剂的制备方法及其应用
CN100422310C (zh) 一种杀真菌农用抗生素及其制备工艺
CN1759685A (zh) 防治水葫芦的微生物除草剂及其制备方法
CN110014037B (zh) 一种铜污染土壤的联合修复方法
CN101283684A (zh) 一种化合物在防治黄瓜枯萎病和番茄灰霉病中的应用
CN103333852A (zh) 一种米根霉菌剂的生产方法及其用途及其使用方法
CN117625409B (zh) 一株用于防治烟草根黑腐病的海洋球毛壳菌菌株
CN114806905B (zh) 一种胶红酵母菌菌株及其应用
CN101300980B (zh) 一种抗生素生物农药及其制备方法

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
ASS Succession or assignment of patent right

Owner name: INSTITUTE OF ENVIRONMENT AND SUSTAINABLE DEVELOPME

Free format text: FORMER OWNER: CHINA AGRICULTURAL SCIENCES ACADEMY BIOLOGICAL CONTROL INSTITUTE

Effective date: 20090403

C41 Transfer of patent application or patent right or utility model
TR01 Transfer of patent right

Effective date of registration: 20090403

Address after: No. 12 South Street, Beijing, Haidian District, Zhongguancun: 100081

Co-patentee after: Suzhou Kaili Biological Products Co.,Ltd.

Patentee after: INSTITUTE OF ENVIRONMENT AND SUSTAINABLE DEVELOPMENT IN AGRICULTURE, CHINESE ACADEMY OF AGRICULTURAL SCIENCES

Address before: No. 12 South Street, Beijing, Haidian District, Zhongguancun: 100081

Co-patentee before: Suzhou Kaili Biological Products Co.,Ltd.

Patentee before: INST OF BIOLOG CONTROL CHINESE

C41 Transfer of patent application or patent right or utility model
TR01 Transfer of patent right

Effective date of registration: 20091113

Address after: No. 12 South Street, Beijing, Haidian District, Zhongguancun: 100081

Co-patentee after: FUJIAN KAILI BIO-PRODUCT Co.,Ltd.

Patentee after: INSTITUTE OF ENVIRONMENT AND SUSTAINABLE DEVELOPMENT IN AGRICULTURE, CHINESE ACADEMY OF AGRICULTURAL SCIENCES

Address before: No. 12 South Street, Beijing, Haidian District, Zhongguancun: 100081

Co-patentee before: Suzhou Kaili Biological Products Co.,Ltd.

Patentee before: INSTITUTE OF ENVIRONMENT AND SUSTAINABLE DEVELOPMENT IN AGRICULTURE, CHINESE ACADEMY OF AGRICULTURAL SCIENCES

CX01 Expiry of patent term

Granted publication date: 20050921

CX01 Expiry of patent term