CN105586269B

CN105586269B - 利用诱变灰树花菌株生产灰树花菌丝体原料的方法

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Publication number: CN105586269B
Application number: CN201510996119.3A
Authority: CN
Inventors: 朱文静; 王冲之; 刘伟民; 任晓锋; 伍娟; 程宇; 李婷婷; 王雪梅
Original assignee: Jiangsu University
Current assignee: Jiangsu University
Priority date: 2015-12-25
Filing date: 2015-12-25
Publication date: 2018-11-06
Anticipated expiration: 2035-12-25
Also published as: CN105586269A

Abstract

本发明利用诱变灰树花菌株生产灰树花菌丝体原料的方法，涉及食品微生物应用技术领域。通过紫外诱变获得的灰树花新菌株发酵液态的添加了半胱氨酸盐酸盐和叶绿素铜钠盐的米糠麸皮全料新培养基，高效转化米糠麸皮为灰树花菌丝体原料和更多的胞外粗多糖，降低生产成本，扩大产量，制造出品质较好的灰树花菌丝体原料，胞外粗多糖则留作为进一步深加工处理的原料。本发明将低值的米糠麸皮转化成具有多种保健功能的灰树花菌丝体原料，对降低生产成本、低端资源高效合理利用、保护大众健康，都具有有益的社会和经济效果，因而具有实用性。

Description

利用诱变灰树花菌株生产灰树花菌丝体原料的方法

技术领域

本发明涉及食品微生物应用技术领域，尤其涉及一种使用诱变获得的灰树花新菌株生产灰树花菌丝体原料的方法，在该方法中新菌株在添加了半胱氨酸盐酸盐、叶绿素铜钠盐的液态的米糠麸皮全料新培养基中进行发酵得到菌丝体。

背景技术

药食两用真菌在中国有着悠久的使用历史和广泛的使用人群。现代科学揭示，现在常用的药食两用真菌如灵芝、猴头菌、冬虫夏草、灰树花等的菌丝体、子实体或孢子中能产生诸如氨基酸、蛋白质、维生素、多糖、核苷类、黄酮类及抗生素等多种活性成分或富集多种微量元素如硒、锌等，具有提高人体免疫力、抗肿瘤、增强肝脏功能、抗氧化等多种功效。正因为如此，国际国内研究和开发药食两用真菌的热情方兴未艾，在医药领域、食品领域、中医保健领域、农业和工业生产领域都有许多研究者和开发者，获得众多的研究成果或产品。就珍稀食用菌用于食品而言，国内市场已有食用菌保健食品如灵芝胶囊、灰树花胶囊及灵芝胶囊等在热销，它们的经济价值很高。饼干中添加猴头菇则制成了猴头菇饼干，已经成为普通食品在国内超市进行销售。国际上新西兰、日本、美国、韩国等均产有类似的食用菌保健食品产品。

就灰树花而言，针对其的研究表明：灰树花具有较好的调节免疫力、辅助抗肿瘤治疗、治疗肝炎、降血脂、抗艾滋病毒、延缓衰老功能等功效（参考文献：①陈石良，药用真菌灰树花深层发酵技术及其抗肿瘤多糖的研究[D]，江南大学，2000；②崔凤杰，灰树花深层发酵条件优化及其菌丝体抗肿瘤糖肽的研究[D]，江南大学，2006；③李小定，灰树花多糖的结构及其生物活性[D]，华中农业大学，2002；④雷萍，灰树花提取物对脾虚小鼠免疫功能的影响及作用机制研究[D]，辽宁中医药大学，2011；⑤Nanba H.，Maitake mushroom immunetherapy to prevent from cancergrowth and metastasis [J]，Explore 1995，6(1)：74-78；⑥Kubo K.， Nanba H.， Anti-hyperliposis effect of Maitake fruit body(Grifola frondosa) [J]，Biological & Pharmaceutical Bulletin， 1997， 20(7)：781-785．）。

灰树花是一种珍稀食用菌，在中国的浙江、河北、福建、四川等地有栽培，日本也有栽培。其子实体香气浓、营养丰富。灰树花含蛋白、氨基酸、脂肪、粗纤维、碳水化合物、微量元素等，具有多种生理活性功能。现在灰树花的获取方式主要是人工栽培，以子实体或孢子粉入药，但人工栽培灰树花周期长、生产效率不高、劳动强度大，受季节、环境等限制，易遭病虫害，质量与产量不稳定。食用菌液体深层发酵技术, 可克服传统的子实体栽培的不足，采用液态或固态发酵的方法生产灰树花菌丝体并加以深加工应用符合创新驱动的发展思路，具有良好的前景。对灰树花菌丝体的研究和开发取得的进步都将进一步推动灰树花的应用，带来实际的社会和经济效益。正因为如此，才有必要研究新的灰树花菌丝体及其深加工产品的生产方法，例如考虑将一些低端农产品加工副产品原料如米糠、麸皮高效转化为高价值的灰树花菌丝原料，可望降低灰树花菌粉原料的生产成本从而降低终产品灰树花类保健食品的价格，让普通人都能消费得起，促进大众健康，这也是本发明专利关注点之一。

中国是水稻和小麦的生产大国，米糠和麸皮资源丰富。米糠和麸皮作为稻谷或小麦加工的副产物，营养成分丰富，价格低廉。米糠中含有丰富优质的蛋白质、活性多糖、脂肪和生育三烯酚、生育酚等生理功能显著的活性物质，麸皮富含脂肪、蛋白质、矿物质、维生素和纤维素等营养成分，其中纤维素的含量可达麸皮总量的18%以上，所以，米糠和麸皮能为灰树花生长提供充足的碳源、氮源、维生素和矿物质。在灰树花纤维素酶及其它酶系的作用下，灰树花可将米糠和麸皮转化成所需营养物质进行生长代谢，合成灰树花菌丝体和腺苷类功能性物质。因此，运用农副产品米糠、麸皮作为全部的碳源和氮源，进行灰树花液体发酵生长灰树花类保健食品原料，具有技术可行性，并可带来较好的社会和经济效益。

多数食用菌粉液态发酵生产方法采用葡萄糖、粮食类原料如淀粉、马铃薯或黄豆粉等作为培养基，即使用到农副产品如米糠、麸皮等，也是将其作为辅助成分加入。原始食用菌冬虫夏草、灵芝、灰树花等菌株在不添加葡萄糖或其他粮食类原料的米糠麸皮全料液态培养基上生长状况并非为最好，加之米糠、麸皮原料中可能含有一些有害物质如铅、砷、黄曲霉毒素等可能会转移到菌丝体中，为阻止这种转移，故需要对此类菌的发酵米糠麸皮液态全料方法进行创新研究。

本专利发明人刘伟民的研究小组十多年来对灰树花、灵芝、冬虫夏草的液态发酵进行了大量的研究，先后形成硕士论文和发明专利等多个成果。刘伟民指导的硕士论文有：（1）杨锁华，灰树花发酵米糠制备多糖（2006年）；（2）顾慧敏，灰树花在米糠培养基中液态培养产多糖和富集有机硒的研究（2009年）；（3）张建，物理法诱变灰树花液体发酵米糠麸皮产多糖的研究（2010年）；（4）郭春梅，灰树花的菌种诱变、液体发酵米糠麸皮产多糖及富硒研究（2011年）；（5）李亚楠，灰树花菌种诱变及发酵和性能研究（2013年）；（6）刘丽丽，高值转化米糠麸皮的灵芝液体发酵及菌种诱变（2012年）；（7）郭天龙，灵芝菌种诱变及液态发酵高值化转化全米糠麸皮研究（2013年）；（8）陈静，冬虫夏草液体发酵高值化利用米糠麸皮产多糖的研究（2014年）；（9）张笑飞，灵芝菌株（Ganoderma lucidum CFCC6043）液体发酵全米糠麸皮及多糖活性的研究（2014年），等。刘伟民作为第一发明人的发明专利有：（1）使用米糠麸皮复合原料和灰树花诱变菌株生产多糖的方法，20101010579048.4；（2）用于米糠和麸皮复合原料生产多糖的灰树花菌株，201010579078.5；（3）用于发酵米糠和麸皮提取液生产灰树花多糖的菌株，201110150888.3；（4）用于米糠和麸皮全料液态发酵生产灰树花多糖的菌株，201310274913.8；（5）一种灵芝诱变株液态发酵米糠麸皮全料生产多糖的方法，201310275061.4；（6）一种液态发酵米糠麸皮全料生产冬虫夏草多糖的方法，201310274914.2；（7）一种灰树花诱变株液态发酵米糠麸皮全料生产多糖的方法，201310274911.9；（8）用于米糠和麸皮全料液态发酵生产灵芝多糖的菌株，201310274915.7，等。由以上描述可知，本专利发明人刘伟民一直围绕利用米糠和麸皮高效高值化生产珍稀食用菌菌丝及其功效成分这一专题进行研究，实现发明创造的设想，所以能提出用诱变的灰树花菌株进行米糠麸皮全料液体发酵，高效高值化转化米糠麸皮生产污染物含量合格的灰树花菌丝体原料，并将此菌丝体原料用于进一步深加工成保健食品。

正是由于在该领域深入的研究，以及后续的新研究所揭示的问题，我们发现还需要对灰树花发酵液态米糠麸皮全料进行革新。之前我们的研究已经达到的灰树花发酵米糠和麸皮全料培养基的最大发酵浓度为米糠8.0 g/100 mL，麸皮8.0 g/100 mL，两者之和为16.0 g/100 mL，灰树花菌丝的干重浓度可达为6.4g/100mL培养基。我们的进一步研究显示出再次经过诱变选择的新灰树花菌株发酵米糠和麸皮全料培养基的最大发酵浓度也可为米糠8.0 g/100 mL，麸皮8.0 g/100 mL，两者之和也可达到16.0 g/100 mL，所得到的纯菌丝的干重浓度可达到7.9g/100mL培养基，同时还可得到较高浓度的发酵液中的胞外粗多糖产物。这说明通过诱变选择得到更高的菌丝产量和更多的胞外粗多糖的新灰树花菌株，值得深入研究，是本发明专利需要解决的主要问题之一。

本发明专利发明人刘伟民在多年的研究中逐渐认识到米糠和麸皮全料作为发酵培养基还需要加以改造，以尽可能阻止原米糠和麸皮中的铅、砷、汞、镉等有害物质转移至菌丝中，这一问题在本发明之前还未研究过。中国不同地区土地铅、砷、汞的污染状况不同，所产水稻和小麦所含的铅、砷、汞量也不相同，为防止这些有害元素通过米糠和麸皮转移到菌丝中，对所用米糠和麸皮应进行初步的检验和处理，铅、砷、汞限量在一定控制范围之内的米糠和麸皮才可以被用作发酵培养基。由于食用菌在发酵过程中可能富集一些有害元素，因此在设计培养基时应考虑引入竞争性抑制富集有害元素的食品添加剂，如半胱氨酸盐酸盐等，通过其巯基与铅、砷、汞等元素的竞争性结合降低有害元素进入菌丝的机会，从而得到合格的菌丝。对有害元素铅、砷、汞等的转移控制为本发明专利需要解决的问题之二。

由于水稻和小麦在收割环节和贮藏环节有可能会发生霉变以及所加工的米糠和麸皮贮藏不当，产生黄曲霉毒素，所以在使用米糠和麸皮时也应进行检验和处理，黄曲霉限量在一定控制范围内的米糠和麸皮才可以被用作发酵培养基。由于食用菌在发酵过程中可能将黄曲霉毒素转移到菌丝中，因此在设计培养基时同样应考虑引入抑制黄曲霉毒素转移的食品添加剂，如叶绿素铜钠盐等，以得到合格的菌丝。叶绿素铜钠盐对平面芳香致癌物有络合作用，可抑制致癌物的活性，可降解致癌物质，具有清除自由基和抗氧化作用。水稻和小麦在种植过程中会被使用农药，米糠和麸皮中的残留农药同样需要通过原料检验和处理加以控制，食用菌在发酵过程中利用自身的酶系也可以降解一些有害物质，同时所加入的叶绿素铜钠盐等对防止农药残留的转移也具有有益作用，此三点可防止农药残留转移到发酵菌丝体中。因此，对有害物质黄曲霉毒素和农药残留的控制为本发明专利需要解决的问题之三。

综上所述，本发明要解决的关键问题为必须获得一种未见报道的灰树花新菌株，使其在新设计的米糠麸皮全料液态新培养基上有效生长并高效转化米糠麸皮全料为合格灰树花菌丝和更多的胞外粗多糖，该新设计的培养基中添加了半胱氨酸盐酸盐和叶绿素铜钠盐。因此本发明专利在设计时对授予发明专利所必须的独特性、取得突出的实质性特点和显著进步的创新性和实用性给予了充分的考虑。

本发明将利用通过诱变得到的一株灰树花新菌株，该新菌株发酵米糠麸皮全料液态新培养基后可以得到品质较好的灰树花菌丝原料和更多的胞外粗多糖，该菌丝原料可以用于进一步深加工成为保健食品，胞外多糖也可以经过深加工加以开发利用。特别说明：本发明所述米糠麸皮全料液态发酵培养基特指“将经检验处理达到要求的米糠和麸皮作为培养基中唯一的碳源、氮源，不添加其他碳源、氮源，并且米糠、麸皮加水成液态状，不过滤，即全料加以利用”。新培养基指“添加了半胱氨酸盐酸盐、叶绿素铜钠盐以阻止原料中可能的有害物质转入菌丝的米糠麸皮全料液态培养基”。

本发明所利用的发酵米糠麸皮全料液态新培养基的新灰树花菌株为通过紫外诱变首次发明获得。

本发明给出上述灰树花新菌株发酵液态米糠麸皮新培养基制造灰树花菌丝体原料的有效方法，包括培养基的具体组成、发酵条件、菌丝产量和菌丝品质指标的测定值。所获得的灰树花菌丝体原料经检验，铅、砷、汞含量均低于GB16740-2014限量指标值，黄曲霉毒素含量低于GB2761-2011稻谷类及其制品的限量指标值。

发明内容

本发明用一种通过紫外诱变获得的灰树花新菌株发酵液态米糠麸皮全料新培养基，高效高值化转化米糠麸皮为灰树花菌丝体原料和更多的胞外粗多糖，降低生产成本，扩大产量，制造出品质较好的灰树花菌丝体原料，胞外粗多糖则留作为进一步深加工处理的原料。

本发明所采取的技术方案如下：利用一种紫外诱变得到的灰树花新菌株，在液态的米糠麸皮全料新培养基中发酵，生产灰树花菌丝体原料。

利用诱变灰树花菌株生产灰树花菌丝体原料的方法，按照下述步骤进行：

（1）将米糠和麸皮加所需量的水121℃灭菌30min；

（2）将米糠和麸皮全料作为碳源、氮源直接用于灰树花菌株Grifola frondosaCCTCC M 2015065发酵培养基，米糠浓度为5-8g/100mL，麸皮浓度为5-8g/100mL，米糠和麸皮的总浓度为10.0-16.0 g/100mL，添加磷酸二氢钾0.015-0.36g/100mL，七水硫酸镁0.015-0.36g/100mL ，半胱氨酸盐酸盐20-50mg/100mL，叶绿素铜钠盐5-10mg/100mL，pH自然，250mL摇瓶装料100mL，发酵罐装料率70-75%，接种量8-10%，培养温度24-28℃，摇床转速150-180r/min或发酵搅拌浆转速50-150r/min，发酵时间5-12d；

（3）将液体培养所得的含少量的米糠麸皮的菌丝体经20目金属丝网在水中筛分分离出菌丝，并用水洗涤两次；

（4）将所得湿菌丝体进行冷冻干燥，得到菌丝粉成品；

（5）所得发酵液经过滤除渣后取清液真空浓缩、喷雾干燥，得到发酵液中的干物质，可作为深度开发的原料使用；

（6）所得菌丝粉研磨后用90℃热水浸提4h，过滤取清液，经脱蛋白、醇沉、离心分离后，采用苯酚硫酸法测定菌丝多糖；

（7）所得发酵液经静置、脱蛋白、醇沉后取一定量的清液，采用苯酚硫酸法测定胞外多糖；

（8）参照GB/T5009.12、GB/T5009.11、GB/T5009.17铅、砷、汞的测定方法和GB/T18979黄曲霉毒素的测定方法，测定灰树花冻干菌丝体粉中污染物铅、砷、汞和黄曲霉毒素的含量。

本发明步骤（2）中使用的灰树花新菌株 Grifola frondosa CCTCC M 2015065，是灰树花菌株Grifola frondosa CCTCC M 2013286经紫外诱变筛选所得，已经于2015年1月23日保藏在位于中国武汉的武汉大学的中国典型培养物保藏中心（CCTCC），菌株保藏编号为CCTCC M 2015065，名称为灰树花CCTCC M 2015065（拉丁名称：Grifola frondosa CCTCCM 2015065）。

本发明步骤（2）中摇瓶时的装料量为摇瓶容积的40%，接种量为装料体积的8-10%，转速150-180r/min，培养时间为5-12d。

本发明步骤（2）中上罐发酵时装样量为发酵罐容积的70-75%，上罐时通风量为装罐液体体积1：0.8v/v/mim ，培养温度24-28℃，搅拌速率50-150r/min，上罐发酵5-12d。

本发明步骤（4）的冷冻干燥的操作压强为5Pa，加热板的温度为30℃，冻干时间为48-72h。

本发明的有益效果

利用所述菌株灰树花CCTCC M 2015065在米糠麸皮全料液态新培养基中发酵生产灰树花菌丝体保健食品原料，当米糠麸皮全料液态新培养基中米糠和麸皮的总浓度达16.0g/100mL，KH₂PO₄为0.36g/100mL，MgSO_{4 ‘}7H₂O为0.36 g/100mL，半胱氨酸盐酸盐为50mg/100mL，叶绿素铜钠盐为10mg/100mL时，菌丝干重、菌丝多糖、胞外多糖浓度摇瓶发酵时分别达到7.9g/100mL、524.6mg/100mL和763.2mg/100mL，而上罐发酵时则可达到7.3g/100mL、510.8mg/100mL、742.8mg/100mL的水平。经检验摇瓶发酵所得的灰树花发酵产物菌丝体中铅、砷、汞的含量为1.72mg/kg、0.71mg/kg、0.07mg/kg，均低于GB16740-2014限量指标值，黄曲霉毒素含量为15.5μg/kg，低于GB2761-2011稻谷类及其制品的限量指标值。上罐发酵的灰树花发酵产物菌丝体中铅、砷、汞的含量为1.81mg/kg、0.75mg/kg、0.05mg/kg，均低于GB16740-2014限量指标值，黄曲霉毒素含量为11.7μg/kg，低于GB2761-2011稻谷类及其制品的限量指标值。

本发明首次实现所述灰树花菌株转化液态米糠麸皮全料新培养基为灰树花菌丝体原料的方法。所采用的菌株Grifola frondosa CCTCC M 2015065是发明人自己诱变得到的一株灰树花新菌株，该菌株可在液态米糠麸皮全料新培养基有效生长，并高效转化米糠麸皮为灰树花菌丝体，该菌株具有独特性，因而本发明也具有独特性。

本发明也取得了实质性特点和显著进步的创新性，原因主要有二：一是因为新菌株在液态米糠麸皮全料新培养基中高效生长时有害物转移到菌丝体的程度得到降低，此点在已有的公开文献中并未出现过；二是摇瓶发酵时，Grifola frondosa CCTCC M 2015065的米糠麸皮全料液态新培养基中米糠和麸皮的总浓度可达16.0 g/100mL，纯菌丝的干重浓度、菌丝多糖浓度和发酵液中的粗多糖浓度分别达到7.9g/100mL、524.6mg/100mL和763.2mg/100mL，而原始菌株Grifola frondosa CCTCC M 2013286的米糠麸皮全料液态新培养基中米糠和麸皮的总浓度为16.0 g/100mL时，菌丝的干重浓度、菌丝多糖浓度分别为6.4g/100mL、452.7mg/100mL。新菌株的菌丝干重浓度增加23.4%，菌丝多糖浓度增加了15.9%，发酵液中的胞外粗多糖也具有较高的量。因为保健食品制造目前要求使用发酵菌丝粉，所以菌丝干重浓度和菌丝多糖浓度数值说明诱变所得新菌株具有更强的发酵米糠和麸皮的能力，菌株的发酵性能发生了显著的积极的变化。发酵液中的粗多糖则留作进一步深加工的原料使用。说明诱变所得新菌株具有更强的发酵米糠和麸皮的能力，菌株的发酵性能发生了显著的积极的变化。

本发明将低值的米糠麸皮转化成高值的具有多种保健功能的灰树花菌丝体原料，对降低生产成本、低端资源高效合理高值化利用、保护大众健康，都具有有益的社会和经济效果，因而具有实用性。

综上所述，本发明已经具备了授予发明专利所必须的独特性、取得了实质性特点和显著进步的创新性和实用性，产生了发明专利应该具有的技术、经济和社会的有益效果。

附图说明

图1为菌株灰树花CCTCC M 2015065摇瓶发酵时液态发酵米糠麸皮全料新培养基分离所得的菌丝。

图2为菌株灰树花CCTCC M 2015065在液态发酵米糠麸皮全料新培养基所得的发酵液干燥产物。

具体实施方式

本发明提供了通过紫外诱变，选育在米糠麸皮全料液态培养基上生长速度更快、多糖产量更高的诱变菌株Grifola frondosa CCTCC M 2015065的方法，所述方法包括下列步骤：

取实验室保藏的Grifola frondosa CCTCC M 2013286为出发菌株；

将所取出发菌株接种于PDA培养基上进行活化培养；

菌体培养后用无菌生理盐水洗脱制得孢子悬液；

将孢子悬液稀释所需倍数，在紫外灯下照射进行诱变后，接至米糠麸皮筛选培养基上避光培养，初筛选出生长速率较快、比较稳定的菌株；将初筛的菌株进行遗传稳定性试验，复筛选出生长速率较快、比较稳定的菌株；

用米糠麸皮全料液态培养基进行摇瓶发酵，三筛选出生长速率高和多糖产量高的菌株；进行拮抗试验；

在一个实施方案中，所用的PDA培养基为马铃薯200g/L，葡萄糖20g/L，蛋白胨5g/L，磷酸二氢钾1.5g/L，硫酸镁0.75g/L，琼脂20g/L，pH自然。

在一个实施方案中，所述恒温为28℃。

在一个实施方案中，所述紫外诱变采用红光暗操作，在距离功率为30W的紫外灯20cm下分别照射40s。

在一个实施方案中，所述避光培养为在28℃下避光培养5天。

在一个实施方案中，所述避光培养所用培养基为米糠、麸皮固体平板培养基：米糠30g/L，麸皮30g/L，磷酸二氢钾1.5g/L，硫酸镁0.75g/L，琼脂20g/L，pH自然，米糠、麸皮全料使用）。

在一个实施方案中，所述筛选方法为平板直径测定法。

在一个实施方案中，所述初筛步骤为：从紫外诱变避光培养的平板上挑取生长良好的单菌落分别接种至新的米糠麸皮固体平板培养基中，从紫外诱变中挑选出10株生长速度快且浓密的诱变株，对其进行3代传代培养，从中选出相对于出发菌株生长快、形状好、稳定性高的菌株。

在一个实施方案中，所述复筛步骤为：将粗筛选出的较优菌株分别进行5代平板传代培养，挑取生长良好的单菌落分别接种至新的米糠麸皮固体平板培养基中，挑选出生长速度快、健壮、纯正的变异株。

在一个实施方案中，所述三筛步骤为：以复筛确定的高生长速率变异株作为三筛的对象，与出发菌株一起进行摇瓶发酵筛选从而确定变异株优良性状稳定表达的菌株。将复筛选出的菌株和出发菌株Grifola frondosa CCTCC M 2013286进行摇瓶发酵试验，连续发酵5代，按指标确定目的诱变株。

在一个实施方案中，所述Grifola frondosa CCTCC M 2015065在复筛第五代平板上的生长速率为1.1mm/h，是生长速率较快的一株菌株。

在一个实施方案中，所述摇瓶为250mL锥形瓶。

在一个实施方案中，所述米糠、麸皮液体发酵培养基为：米糠8.0g/100mL，麸皮8.0g/100mL，磷酸二氢钾0.36g/100mL，硫酸镁0.36g/100mL，半胱氨酸盐酸盐50mg/100mL，叶绿素铜钠盐10mg/100mL，pH自然。

在一个实施方案中，所述指标为100mL发酵体积的纯菌丝干重、菌丝多糖重量和发酵液胞外粗多糖重量。

在一个实施方案中，以拮抗性试验表征遗传性状， Grifola frondosa CCTCC M2015065的生长浓密、厚实，可见其生长性能强于出发菌株的性能，遗传性状发生了有益的变化。

在一个实施方案中，所述筛选得到的灰树花新菌株Grifola frondosa CCTCC M2015065利用发酵新培养基获得的发酵结果为：纯菌丝的干重浓度、菌丝多糖浓度和发酵液中的粗多糖浓度分别达到7.9g/100mL、524.6mg/100mL和763.2mg/100mL。

在一个实施方案中，新菌株的菌丝干重浓度增加23.4%，菌丝多糖浓度增加了15.9%，说明诱变所得新菌株具有更强的发酵米糠和麸皮的能力，菌株的发酵性能发生了显著的积极的变化。

在一个实施方案中，经过检验，新菌株发酵所得的菌丝中，铅、砷、汞等元素含量分别为1.72mg/kg、0.71mg/kg、0.07mg/kg，均低于GB16740-2014限量指标值，黄曲霉毒素含量为15.5μg/kg，低于GB2761-2011稻谷类及其制品的限量指标值，所得菌丝符合保健食品原料要求。

本发明利用灰树花JSU1401 (Grifola frondosa JSU1401 ) ，在液态米糠麸皮全料新培养基中发酵生产灰树花菌丝体原料，所述菌株灰树花JSU1401 (Grifola frondosaJSU1401 )已经于2015年1月23日保藏在中国武汉的武汉大学内的中国典型培养物保藏中心（CCTCC ），保藏菌株编号为 CCTCC M 2015065，名称为灰树花CCTCC M 2015065（拉丁名称为Grifola frondosa CCTCC M 2015065）。本发明提供了一种采用灰树花CCTCC M2015065在液态的添加了半胱氨酸盐酸盐和叶绿素铜钠盐的米糠麸皮全料新培养基上生产品质较优的灰树花菌丝体保健食品原料的生产方法。

在具体实施方式中，将米糠和麸皮加水121℃灭菌30min，作为培养基用于发酵。

实施例一

灰树花菌株采用灰树花CCTCC M 2015065。米糠使用量为8.0g/100mL培养基，麸皮的使用量为8.0g/100mL培养基，添加KH₂PO₄0.36g/100mL，MgSO_{4 ‘}7H₂O 0.36g/100mL，半胱氨酸盐酸盐50mg/100mL，叶绿素铜钠盐10mg/100mL，pH自然，加水至所需的体积，121℃灭菌30min，作为培养基用于发酵，摇瓶装样量为40%，接种量为10%，培养温度28^oC，转速180r/min，培养时间7d。以下按前述发明内容所描述技术方案中的步骤（3）～（8）实施。结果为：菌丝干重7.9 g/100mL培养基，菌丝多糖为524.6mg/100 mL 培养基，胞外多糖为763.2mg/100mL培养基，铅的含量1.72mg/kg，砷的含量0.71mg/kg，汞的含量0.07mg/kg，均低于GB16740-2014限量指标值。黄曲霉毒素的含量15.5μg/kg，低于GB2761-2011稻谷类及其制品的限量指标值。

实施例二

灰树花菌株采用灰树花CCTCC M 2015065。米糠使用量为5.0g/100mL培养基，麸皮的使用量为5.0g/100mL培养基，添加KH₂PO₄0.015g/100mL，MgSO_{4 ‘}7H₂O 0.015g/100mL，半胱氨酸盐酸盐20mg/100mL，叶绿素铜钠盐5mg/100mL，pH自然，加水至所需的体积，121℃灭菌30min，作为培养基用于发酵，摇瓶装样量为40%，接种量为8%，培养温度24^oC，转速150r/min，培养时间5d。以下按前述发明内容所描述技术方案中的步骤（3）～（8）实施。结果为：菌丝干重4.7 g/100mL培养基，菌丝多糖为312.9mg/100 mL 培养基，胞外多糖为457.1mg/100mL培养基，铅的含量1.03mg/kg，砷的含量0.43mg/kg，汞的含量0.04mg/kg，均低于GB16740-2014限量指标值。黄曲霉毒素的含量9.2μg/kg，低于GB2761-2011稻谷类及其制品的限量指标值。

实施例三

灰树花菌株采用灰树花CCTCC M 2015065。米糠使用量为6.5g/100mL培养基，麸皮的使用量为6.5g/100mL培养基，添加KH₂PO₄0.18g/100mL，MgSO_{4 ‘}7H₂O 0.18g/100mL，半胱氨酸盐酸盐35mg/100mL，叶绿素铜钠盐7.5mg/100mL，pH自然，加水至所需的体积，121℃灭菌30min，作为培养基用于发酵，摇瓶装样量为40%，接种量为9%，培养温度26^oC，转速165r/min，培养时间6.5d。以下按前述发明内容所描述技术方案中的步骤（3）～（8）实施。结果为：菌丝干重6.32 g/100mL培养基，菌丝多糖为421.8mg/100 mL 培养基，胞外多糖为610.5mg/100mL培养基，铅的含量1.38mg/kg，砷的含量0.55mg/kg，汞的含量0.05mg/kg，均低于GB16740-2014限量指标值。黄曲霉毒素的含量12.56μg/kg，低于GB2761-2011稻谷类及其制品的限量指标值。

实施例四

灰树花菌株采用灰树花CCTCC M 2015065。米糠使用量为5.2g/100mL培养基，麸皮的使用量为6.8g/100mL培养基，添加KH₂PO₄0.12g/100mL，MgSO_{4 ‘}7H₂O 0.03 g/100mL，半胱氨酸盐酸盐45mg/100mL，叶绿素铜钠盐8.5mg/100mL，pH自然，加水至所需的体积，121℃灭菌30min，作为培养基用于发酵，摇瓶装样量为40%，接种量为9%，培养温度28^oC，转速170r/min，培养时间6d。以下按前述发明内容所描述技术方案中的步骤（3）～（8）实施。结果为：菌丝干重5.8g/100mL培养基，菌丝多糖为392.6mg/100 mL 培养基，胞外多糖为553.9mg/100mL培养基，铅的含量1.21mg/kg，砷的含量0.53mg/kg，汞的含量0.05mg/kg，均低于GB16740-2014限量指标值。黄曲霉毒素的含量10.7μg/kg，低于GB2761-2011稻谷类及其制品的限量指标值。

实施例五

灰树花菌株采用灰树花CCTCC M 2015065。米糠使用量为6.2g/100mL培养基，麸皮的使用量为5.2g/100mL培养基，添加KH₂PO₄0.28g/100mL，MgSO_{4 ‘}7H₂O 0.14g/100mL，半胱氨酸盐酸盐40mg/100mL，叶绿素铜钠盐7mg/100mL，pH自然，加水至所需的体积，121℃灭菌30min，作为培养基用于发酵，摇瓶装样量为40%，接种量为10%，培养温度25^oC，转速150r/min，培养时间5d。以下按前述发明内容所描述技术方案中的步骤（3）～（8）实施。结果为：菌丝干重5.2g/100mL培养基，菌丝多糖为353.5mg/100mL培养基，胞外多糖为593.8mg/100mL培养基，铅的含量1.22mg/kg，砷的含量0.50mg/kg，汞的含量0.04mg/kg，低于GB16740-2014限量指标值。黄曲霉毒素的含量17.8μg/kg，低于GB2761-2011稻谷类及其制品的限量指标值。

实施例六

灰树花菌株采用灰树花CCTCC M 2015065。米糠使用量为5.8g/100mL培养基，麸皮的使用量为7.8g/100mL培养基，添加KH₂PO₄0.20g/100mL，MgSO_{4 ‘}7H₂O 0.20g/100mL，半胱氨酸盐酸盐48mg/100mL，叶绿素铜钠盐10mg/100mL，pH自然，加水至所需的体积，121℃灭菌30min，作为培养基用于发酵，摇瓶装样量为40%，接种量为8%，培养温度27^oC，转速160r/min，培养时间9d。以下按前述发明内容所描述技术方案中的步骤（3）～（8）实施。结果为：菌丝干重6.7g/100mL培养基，菌丝多糖为446.2mg/100mL培养基，胞外多糖为631.5mg/100mL培养基，铅的含量1.32mg/kg，砷的含量0.53mg/kg，汞的含量0.05mg/kg，低于GB16740-2014限量指标值。黄曲霉毒素的含量12.91μg/kg，低于GB2761-2011稻谷类及其制品的限量指标值。

实施例七

灰树花菌株采用灰树花CCTCC M 2015065。发酵罐装样量为发酵罐容积的75%，发酵温度为28℃，通风量1：0.8v/v/mim，搅拌速度100r/min，罐表压0.05MPa，接种量10%，培养时间8d，发酵培养基为米糠使用量8.0g/100mL培养基，麸皮的使用量8.0g/100mL培养基，KH₂PO₄0.36g/100mL，MgSO_{4 ‘}7H₂O 0.36g/100mL，半胱氨酸盐酸盐50mg/100mL，叶绿素铜钠盐10mg/100mL，pH自然，加水至所需的体积，121℃灭菌30min，以下按前述发明内容所描述技术方案中的步骤（3）～（8）实施。结果为：菌丝干重7.3g/100mL培养基，菌丝多糖为510.8mg/100mL培养基，胞外多糖为742.8mg/100 mL 培养基，铅的含量1.81mg/kg，砷的含量0.75mg/kg、0.05mg/kg，均低于GB16740-2014限量指标值，黄曲霉毒素含量为11.7μg/kg，低于GB2761-2011稻谷类及其制品的限量指标值。

实施例八

灰树花菌株采用灰树花CCTCC M 2015065。发酵罐装样量为发酵罐容积的70%，发酵温度为24℃，通风量1：0.8v/v/mim，搅拌速度50r/min，罐表压0.05MPa，接种量8%，培养时间10d，米糠使用量为5.0g/100mL培养基，麸皮的使用量为5.0g/100mL培养基，添加KH₂PO₄0.015g/100mL，MgSO_{4 ‘}7H₂O 0.015g/100mL，半胱氨酸盐酸盐20mg/100mL，叶绿素铜钠盐5mg/100mL，pH自然，加水至所需的体积，121℃灭菌30min，以下按前述发明内容所描述技术方案中的步骤（3）～（8）实施。结果为：菌丝干重4.4g/100mL培养基，菌丝多糖为301.8mg/100 mL 培养基，胞外多糖为449.1mg/100mL培养基，铅的含量1.13mg/kg，砷的含量0.55mg/kg，汞的含量0.03mg/kg，均低于GB16740-2014限量指标值。黄曲霉毒素的含量8.7μg/kg，低于GB2761-2011稻谷类及其制品的限量指标值。

实施例九

灰树花菌株采用灰树花CCTCC M 2015065。发酵罐装样量为发酵罐容积的72%，发酵温度为26℃，通风量1：0.8v/v/mim，搅拌速度125r/min，罐表压0.05MPa，接种量9%，培养时间9d。米糠使用量为6.5g/100mL培养基，麸皮的使用量为6.5g/100mL培养基，添加KH₂PO₄0.18g/100mL，MgSO_{4 ‘}7H₂O 0.18g/100mL，半胱氨酸盐酸盐35mg/100mL，叶绿素铜钠盐7.5mg/100mL，pH自然，加水至所需的体积，121℃灭菌30min，作为培养基用于发酵。以下按前述发明内容所描述技术方案中的步骤（3）～（8）实施。结果为：菌丝干重6.29 g/100mL培养基，菌丝多糖为410.1mg/100 mL 培养基，胞外多糖为580.7mg/100mL培养基，铅的含量1.48mg/kg，砷的含量0.62mg/kg，汞的含量0.02mg/kg，均低于GB16740-2014限量指标值。黄曲霉毒素的含量11.12μg/kg，低于GB2761-2011稻谷类及其制品的限量指标值。

Claims

1.利用诱变灰树花菌株生产灰树花菌丝体原料的方法，其特征在于按照下述步骤进行：

（1）将米糠和麸皮加所需量的水121℃灭菌30min；

（2）将米糠和麸皮全料作为碳源、氮源直接用于灰树花菌株（Grifola frondosa）CCTCC NO:M 2015065发酵培养基，米糠浓度为5-8g/100mL，麸皮浓度为5-8g/100mL，米糠和麸皮的总浓度为10.0-16.0 g/100mL，添加磷酸二氢钾0.015-0.36g/100mL，七水硫酸镁0.015-0.36g/100mL ，半胱氨酸盐酸盐20-50mg/100mL，叶绿素铜钠盐5-10mg/100mL，pH自然，250mL摇瓶装料100mL，发酵罐装料率70-75%，接种量8-10%，培养温度24-28℃，摇床转速150-180r/min或发酵搅拌浆转速50-150r/min，发酵时间5-12d；

（4）将所得湿菌丝体进行冷冻干燥，得到菌丝粉成品；

2.根据权利要求1所述的利用诱变灰树花菌株生产灰树花菌丝体原料的方法，其特征在于步骤（2）中摇瓶时的装料量为摇瓶容积的40%，接种量为装料体积的8-10%，转速150-180r/min，培养时间为5-12d。

3.根据权利要求1所述的利用诱变灰树花菌株生产灰树花菌丝体原料的方法，其特征在于步骤（2）中上罐发酵时装样量为发酵罐容积的70-75%，上罐时通风量为装罐液体体积1：0.8v/v/mim ，培养温度24-28℃，搅拌速率50-150r/min，上罐发酵5-12d。

4.根据权利要求1所述的利用诱变灰树花菌株生产灰树花菌丝体原料的方法，其特征在于步骤（4）的冷冻干燥的操作压强为5Pa，加热板的温度为30℃，冻干时间为48-72h。