CN105586270B

CN105586270B - 富硒灵芝菌丝原料的生产方法

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Publication number: CN105586270B
Application number: CN201510996120.6A
Authority: CN
Inventors: 刘伟民; 李婷婷; 王冲之; 任晓峰; 朱文静; 王雪梅; 伍娟; 程宇
Original assignee: Jiangsu University
Current assignee: Jiangsu University
Priority date: 2015-12-25
Filing date: 2015-12-25
Publication date: 2018-10-09
Anticipated expiration: 2035-12-25
Also published as: CN105586270A

Abstract

本发明公开了富硒灵芝菌丝原料的生产方法，涉及食品微生物应用技术领域。通过紫外诱变获得的灵芝新菌株发酵液态的加硒的及加半胱氨酸盐酸盐和叶绿素铜钠盐的米糠麸皮全料新培养基，高效转化米糠麸皮为富硒的灵芝菌丝原料和更多的胞外硒粗多糖，降低生产成本，扩大产量，制造出品质较好的富硒灵芝菌丝原料。胞外硒粗多糖则留作为进一步深加工处理的原料。本发明将低值的米糠麸皮转化成具有多种保健功能的富硒灵芝菌丝体原料，对降低生产成本、低端资源高效合理利用、保护大众健康，都具有有益的社会和经济效果，因而具有实用性。

Description

富硒灵芝菌丝原料的生产方法

技术领域

本发明涉及食品微生物应用技术领域，尤其涉及一种用诱变获得的灵芝新菌株生产富硒灵芝菌丝原料的方法，在该方法中新菌株在添加了半胱氨酸盐酸盐、叶绿素铜钠盐和亚硒酸钠的液态的米糠麸皮全料新培养基中进行发酵得到富硒灵芝菌丝原料。

背景技术

药食两用真菌在中国有着悠久的使用历史和广泛的使用人群。现代科学揭示，现在常用的药食两用真菌如灵芝、猴头菌、冬虫夏草、灰树花等的菌丝体、子实体或孢子中能产生诸如氨基酸、蛋白质、维生素、多糖、核苷类、黄酮类及抗生素等多种活性成分或富集多种微量元素如硒、锌等，具有提高人体免疫力、抗肿瘤、增强肝脏功能、抗氧化等多种功效。正因为如此，国际国内研究和开发药食两用真菌的热情方兴未艾，在医药领域、食品领域、中医保健领域、农业和工业生产领域都有许多研究者和开发者，获得众多的研究成果或产品。就珍稀食用菌用于食品而言，国内市场已有食用菌保健食品如灵芝胶囊、灰树花胶囊及灵芝胶囊等在热销，它们的经济价值很高。饼干中添加猴头菇则制成了猴头菇饼干，已经成为普通食品在国内超市进行销售。国际上新西兰、日本、美国、韩国等均产有类似的食用菌保健食品产品。

就灵芝而言，针对其的研究表明：灵芝具有诸如保护肝脏、治疗糖尿病、治疗心血管、抗肿瘤、增强免疫等功效（参考文献：沈洁．发酵灵芝多糖对肝癌细胞的抑制及其与血清蛋白的分子对接模拟[D]．无锡：江南大学，2014; 李英波．从灵芝菌丝体中高效分离制备抗肿瘤灵芝酸单体的研究[D]．上海：华东理工大学，2013；梁重阳．灵芝免疫调节蛋白（rLZ-8）亚细胞作用位点和抗肿瘤功能结构域的研究[D]．长春：吉林大学，2009；Gao，Yihuai ．Selected papers on natural medicine and Its bioactive components[M] ．Newzealand： Newzealand institute of natural Medicine research，2004；⑤ ZhouShufeng， Dai Xihu， Gao Yihuai， et al．Effects of water-soluble Ganodermalucidum polysaccharides on the immune funtions of patients with advanced lungcancer [J]．Journal of Medicinal Food，2005，8(2)： 159-168．）。

灵芝主要分布于亚洲、澳洲、非洲和美洲的热带及亚热带地区，少数也分布于温带地区。中国地跨热带至寒温带，灵芝科种类多而分布广，是世界灵芝属真菌物种多样性最丰富的国家之一。现在灵芝的获取方式主要是人工栽培，以子实体或孢子粉入药，但人工栽培灵芝周期长、生产效率不高、劳动强度大，受季节、环境等限制，易遭病虫害，质量与产量不稳定。食用菌液体深层发酵技术, 可克服传统的子实体栽培的不足，采用液态或固态发酵的方法生产灵芝菌丝体并加以深加工应用符合创新驱动的发展思路，具有良好的前景。对灵芝菌丝体的研究和开发取得的进步都将进一步推动灵芝的应用，带来实际的社会和经济效益。正因为如此，才有必要研究新的灵芝菌丝体及其深加工产品的生产方法，例如考虑将一些低端农产品加工副产品原料如米糠、麸皮高效转化为高价值的灵芝菌丝原料，可望降低灵芝菌粉原料的生产成本从而降低终产品灵芝类保健食品的价格，让普通人都能消费得起，促进大众健康，这也是本发明专利关注点之一。

中国是水稻和小麦的生产大国，米糠和麸皮资源丰富。米糠和麸皮作为稻谷或小麦加工的副产物，营养成分丰富，价格低廉。米糠中含有丰富优质的蛋白质、活性多糖、脂肪和生育三烯酚、生育酚等生理功能显著的活性物质，麸皮富含脂肪、蛋白质、矿物质、维生素和纤维素等营养成分，其中纤维素的含量可达麸皮总量的18%以上，所以，米糠和麸皮能为灵芝生长提供充足的碳源、氮源、维生素和矿物质。在灵芝纤维素酶及其它酶系的作用下，灵芝可将米糠和麸皮转化成所需营养物质进行生长代谢，合成灵芝菌丝体和腺苷类功能性物质。因此，运用农副产品米糠、麸皮作为全部的碳源和氮源，进行灵芝液体发酵生长灵芝类保健食品原料，具有技术可行性，并可带来较好的社会和经济效益。

多数食用菌粉液态发酵生产方法采用葡萄糖、粮食类原料如淀粉、马铃薯或黄豆粉等作为培养基，即使用到农副产品如米糠、麸皮等，也是将其作为辅助成分加入。原始食用菌冬虫夏草、灵芝、灰树花等菌株在不添加葡萄糖或其他粮食类原料的米糠麸皮全料液态培养基上生长状况并非为最好，加之米糠、麸皮原料中可能含有一些有害物质如铅、砷、黄曲霉毒素等可能会转移到菌丝体中，为阻止这种转移，故需要对此类菌的发酵米糠麸皮液态全料方法进行创新研究。

硒是人体必需的微量元素，硒在人体内起着平衡氧化还原氛围的作用，具有重要的生理作用。硒的保健功能已经被人们所认识，中国市场上已经出现诸如北大富硒康、硒维康、硒营养素补充剂等保健类食品和富硒鸡蛋、富硒稻米等食物原料。调查研究表明，我国2/3地区人群的硒摄入量低于最低推荐值，而食用菌是富集微量元素硒的良好载体，可以考虑利用珍稀食用菌如灵芝、冬虫夏草、灰树花等富集硒，提高食用菌原料的营养和功效价值。食用菌富集硒可将无机硒转化为毒性较低、功能更强的有机硒化合物，使得富硒食用菌原料更适合用作为保健食品的原料。由于考虑作为保健食品原料，需要注意成人每人每日摄取的硒的最高耐受量为400μg，推荐摄入量为50μg，所以，在食用菌富集硒时需要对硒的添加量作出合理的选择。如何将硒有效富集到灵芝菌丝原料中，并保证使用新的诱变菌株在液态米糠麸皮全料新培养基中进行发酵时能够高产，也是本发明需要解决的难点问题之一。

本专利第一发明人刘伟民的研究小组十多年来对灰树花、灵芝、冬虫夏草的液态发酵进行了大量的研究，先后形成硕士论文和发明专利等多个成果。刘伟民指导的硕士论文有：（1）杨锁华，灰树花发酵米糠制备多糖（2006年）；（2）顾慧敏，灰树花在米糠培养基中液态培养产多糖和富集有机硒的研究（2009年）；（3）张建，物理法诱变灰树花液体发酵米糠麸皮产多糖的研究（2010年）；（4）郭春梅，灰树花的菌种诱变、液体发酵米糠麸皮产多糖及富硒研究（2011年）；（5）李亚楠，灰树花菌种诱变及发酵和性能研究（2013年）；（6）刘丽丽，高值转化米糠麸皮的灵芝液体发酵及菌种诱变（2012年）；（7）郭天龙，灵芝菌种诱变及液态发酵高值化转化全米糠麸皮研究（2013年）；（8）陈静，冬虫夏草液体发酵高值化利用米糠麸皮产多糖的研究（2014年）；（9）张笑飞，灵芝菌株（Ganoderma lucidum CFCC6043）液体发酵全米糠麸皮及多糖活性的研究（2014年），等。刘伟民作为第一发明人的发明专利有：（1）使用米糠麸皮复合原料和灰树花诱变菌株生产多糖的方法，20101010579048.4；（2）用于米糠和麸皮复合原料生产多糖的灰树花菌株，201010579078.5；（3）用于发酵米糠和麸皮提取液生产灰树花多糖的菌株，201110150888.3；（4）用于米糠和麸皮全料液态发酵生产灰树花多糖的菌株，201310274913.8；（5）一种灵芝诱变株液态发酵米糠麸皮全料生产多糖的方法， 201310275061.4；（6）一种液态发酵米糠麸皮全料生产冬虫夏草多糖的方法，201310274914.2；（7）一种灰树花诱变株液态发酵米糠麸皮全料生产多糖的方法，201310274911.9；（8）用于米糠和麸皮全料液态发酵生产灵芝多糖的菌株，201310274915.7，（9）一种灰树花多糖硒复合物的生产方法，201110150889.8，等。由以上描述可知，本专利第一发明人刘伟民一直围绕利用米糠和麸皮高效高值化生产珍稀食用菌菌丝及其功效成分这一专题进行研究，实现发明创造的设想，所以能提出用诱变的灵芝菌株进行添加硒的米糠麸皮全料液态发酵，高效高值化转化米糠麸皮生产富硒灵芝菌丝原料，并可将此菌丝原料用于进一步深加工成保健食品。

正是由于在该领域深入的研究，以及后续的新研究所揭示的问题，我们发现还需要对灵芝发酵液态米糠麸皮全料进行革新。之前我们的研究已经达到的灵芝发酵米糠和麸皮全料培养基的最大发酵浓度为米糠8.0 g/100 mL，麸皮8.0 g/100 mL，两者之和为16.0g/100 mL，灵芝CCTCC M 2013287上罐发酵时菌丝的干重浓度为7.4g/100mL培养基。我们的进一步研究显示出再次经过诱变选择的新灵芝菌株发酵米糠和麸皮全料培养基的最大发酵浓度也可为米糠8.0 g/100 mL，麸皮8.0 g/100 mL，两者之和也可达到16.0 g/100 mL，所得到的纯菌丝的干重浓度可达到8.4g/100mL培养基，同时还可得到较高浓度的发酵液中的胞外粗多糖产物。这说明通过诱变选择得到更高的菌丝产量和更多的胞外粗多糖的新灵芝菌株，值得深入研究。经过诱变试验研究，已经得到所希望的灵芝新菌株，研究成果与本专利同时申报了国家发明专利。研究所得的灵芝新菌株在添加硒发酵时的发酵性能、富硒菌丝产量及对米糠麸皮全料的转化能力，以及得到一种富硒的、含有灵芝多糖的冬虫夏草菌丝原料，为本专利的创新内容之一。

本发明专利第一发明人刘伟民在多年的研究中逐渐认识到米糠和麸皮全料作为发酵培养基还需要加以改造，以尽可能阻止原米糠和麸皮中的铅、砷、汞、镉等有害物质转移至菌丝中，这一问题在本发明之前还未研究过。中国不同地区土地铅、砷、汞的污染状况不同，所产水稻和小麦所含的铅、砷、汞量也不相同，为防止这些有害元素通过米糠和麸皮转移到菌丝中，对所用米糠和麸皮应进行初步的检验和处理，铅、砷、汞限量在一定控制范围之内的米糠和麸皮才可以被用作发酵培养基。由于食用菌在发酵过程中可能富集一些有害元素，因此在设计培养基时应考虑引入竞争性抑制富集有害元素的食品添加剂，如半胱氨酸盐酸盐等，通过其巯基与铅、砷、汞等元素的竞争性结合降低有害元素进入菌丝的机会，从而得到合格的菌丝，但这种抑制作用对硒的富集将会产生反作用，因此控制有害元素铅、砷、汞等的转移和实现硒的富集的方法是本发明专利需要解决的重点问题之一。

由于水稻和小麦在收割环节和贮藏环节有可能会发生霉变以及所加工的米糠和麸皮贮藏不当，产生黄曲霉毒素，所以在使用米糠和麸皮时也应进行检验和处理，黄曲霉限量在一定控制范围内的米糠和麸皮才可以被用作发酵培养基。由于食用菌在发酵过程中可能将黄曲霉毒素转移到菌丝中，因此在设计培养基时同样应考虑引入抑制黄曲霉毒素转移的食品添加剂，如叶绿素铜钠盐等，以得到合格的菌丝。叶绿素铜钠盐对平面芳香致癌物有络合作用，可抑制致癌物的活性，可降解致癌物质，具有清除自由基和抗氧化作用。水稻和小麦在种植过程中会被使用农药，米糠和麸皮中的残留农药同样需要通过原料检验和处理加以控制，食用菌在发酵过程中利用自身的酶系也可以降解一些有害物质，同时所加入的叶绿素铜钠盐等对防止农药残留的转移也具有有益作用，此三点可防止农药残留转移到发酵菌丝体中。因此，对有害物质黄曲霉毒素和农药残留的控制为本发明专利需要解决的问题之二。

在通过诱变获得灵芝新菌株后，根据上述高效转化利用米糠和麸皮原料的设想和实现富硒及控制污染物的方法思路，需要研究新菌株在添加了硒、半胱氨酸盐酸盐、叶绿素铜钠盐的液态的米糠麸皮全料新培养基中进行发酵得到所希望菌丝体的方法，而且新方法所得到的转化米糠麸皮的能力应高于已有的研究成果，灵芝菌丝因含有灵芝多糖、有机硒等功能成分，而且污染物含量小于限量值，其品质应得到提高。本专利即提供所希望的方法。

综上所述，本发明要解决的关键问题为给出已经获得的一种未见报道的灵芝新菌株在新设计的添加了硒的米糠麸皮全料液态新培养基上有效生长并高效转化米糠麸皮全料为灵芝菌丝体的方法，该新方法必须给出新设计的添加了硒、半胱氨酸盐酸盐和叶绿素铜钠盐的培养基的构成和发酵方法。因此本发明专利在设计时对授予发明专利所必须的独特性、取得突出的实质性特点和显著进步的创新性和实用性给予了充分的考虑。

本发明利用通过诱变获得的一株灵芝新菌株，发酵新设计的添加了硒的米糠麸皮全料液态培养基制造品质较好的富硒灵芝菌丝原料，该菌丝原料可以用于进一步深加工成为保健食品。该方法发酵液中的硒多糖可留作进一步处理和深加工的原料。

特别说明：本发明所述加硒米糠麸皮全料液态发酵培养基特指“将经检验处理达到要求的米糠和麸皮作为培养基中唯一的碳源、氮源，不添加其他碳源、氮源，并且米糠、麸皮加水成液态状，不过滤，即全料加以利用，在发酵的适当阶段加入灭菌后的所需量的亚硒酸钠溶液”。新培养基指“添加了半胱氨酸盐酸盐、叶绿素铜钠盐以阻止原料中可能的有害物质转入菌丝的加硒米糠麸皮全料液态培养基”。

本发明所利用的发酵加硒米糠麸皮全料液态新培养基的新灵芝菌株为通过紫外诱变首次发明获得。

本发明给出上述灵芝新菌株发酵液态的米糠麸皮全料新培养基制造富硒灵芝菌丝原料的有效方法，包括培养基的具体组成、发酵条件、富硒菌丝产量和富硒菌丝品质指标的测定值。所获得的富硒灵芝菌丝原料经检验，铅、砷、汞含量均低于GB16740-2014限量指标值，黄曲霉毒素含量低于GB2761-2011稻谷类及其制品的限量指标值。

发明内容

本发明用一种通过紫外诱变获得的灵芝新菌株发酵液态的加硒的米糠麸皮全料新培养基，高效高值化转化米糠麸皮为富硒的灵芝菌丝原料和更多的胞外硒粗多糖，降低生产成本，扩大产量，制造出品质较好的富硒灵芝菌丝原料。胞外硒粗多糖则留作为进一步深加工处理的原料。

本发明所采取的技术方案如下：利用一种紫外诱变得到的灵芝新菌株，在液态的加硒的米糠麸皮全料新培养基中发酵，生产富硒的灵芝菌丝体原料。

富硒灵芝菌丝原料的生产方法，按照下述步骤进行：

（1）将米糠和麸皮加所需量的水121℃灭菌30min；

（2）将米糠和麸皮全料作为碳源、氮源直接用于灵芝菌株Ganoderma lucidumCCTCC M 2015066发酵培养基，米糠浓度为5-8g/100mL，麸皮浓度为5-8g/100mL，米糠和麸皮的总浓度为10.0-16.0 g/100mL，添加磷酸二氢钾0.015-0.36g/100mL，七水硫酸镁0.015-0.36g/100mL ，半胱氨酸盐酸盐20-50mg/100mL，叶绿素铜钠盐5-10mg/100mL，pH自然，250mL摇瓶装料100mL，发酵罐装料率70-75%，接种量8-10%，培养温度24-28℃，摇床转速150-180r/min或发酵搅拌浆转速50-150r/min，发酵2d后加入0.45-2.68mg/100mL的灭菌的亚硒酸钠溶液，总发酵时间为5-12d；

（3）将液体培养所得的含少量的米糠麸皮的菌丝体经20目金属丝网在水中筛分分离出菌丝，并用水洗涤两次；

（4）将所得湿菌丝体进行冷冻干燥，得到菌丝粉成品；

（5）所得发酵液经过滤除渣后取清液真空浓缩、喷雾干燥，得到发酵液中的干物质，可作为深度开发的原料使用；

（6）所得菌丝粉研磨后用90℃热水浸提4h，过滤取清液，经脱蛋白、醇沉、离心分离后，采用苯酚硫酸法测定菌丝多糖；

（7）所得发酵液经静置、脱蛋白、醇沉后取一定量的清液，采用苯酚硫酸法测定胞外粗多糖；

（8）所得菌丝粉取一定量的样品用微波消解后，采用电感耦合等离子体质谱仪测定硒的含量；

（9）参照GB/T5009.12、GB/T5009.11、GB/T5009.17铅、砷、汞的测定方法和GB/T18979黄曲霉毒素的测定方法，测定灵芝冻干菌丝体粉中污染物铅、砷、汞和黄曲霉毒素的含量。

本发明步骤（2）中使用的灵芝新菌株为菌株灵芝JSU1401（Ganoderma lucidumJSU 1401），是灵芝菌株Ganoderma lucidum CCTCC M 2013287经紫外诱变筛选所得，已经于2015年1月23日保藏在中国武汉的武汉大学内的中国典型培养物保藏中心（CCTCC），菌株保藏编号为CCTCC M 2015066，名称为灵芝CCTCC M 2015066（拉丁名称：Ganoderma lucidum CCTCC M 2015066）。

本发明步骤（2）中摇瓶时的装料量为摇瓶容积的40%，接种量为装料体积的8-10%，转速150-180r/min，培养时间为5-12d。

本发明步骤（2）中上罐发酵时装样量为发酵罐容积的70-75%，上罐时通风量为装罐液体体积1：0.8v/v/mim ，培养温度24-28℃，搅拌速率50-150r/min，上罐发酵5-12d。

本发明步骤（4）的冷冻干燥的操作压强为5Pa，加热板的温度为30℃，冻干时间为48-72h。

本发明的有益效果

利用所述菌株灵芝CCTCC M 2015066在加硒的米糠麸皮全料液态新培养基中发酵生产灵芝菌丝体保健食品原料，当米糠麸皮全料液态新培养基中米糠和麸皮的总浓度达16.0 g/100mL，KH₂PO₄为0.36g/100mL，MgSO_{4 ‘}7H₂O为0.36 g/100mL，半胱氨酸盐酸盐为50mg/100mL，叶绿素铜钠盐为10mg/100mL，亚硒酸钠为2.68 mg/100mL时，菌丝干重、菌丝多糖、胞外多糖、菌丝中硒浓度摇瓶发酵时分别达到5.2g/100mL、256.8mg/100mL 、573.9mg/100mL和58.76 μg/g干菌丝，而上罐发酵时则可达到4.9g/100mL、249.8mg/100mL、588.1mg/100mL和55.32 μg/g干菌丝的水平。经检验摇瓶发酵所得的灵芝发酵产物菌丝体中铅、砷、汞的含量为1.63mg/kg、0.61mg/kg、0.07mg/kg，均低于GB16740-2014限量指标值，黄曲霉毒素含量为17.5μg/kg，低于GB2761-2011稻谷类及其制品的限量指标值。上罐发酵的灵芝发酵产物菌丝体中铅、砷、汞的含量为1.68mg/kg、0.72mg/kg、0.04mg/kg，均低于GB16740-2014限量指标值，黄曲霉毒素含量为10.6μg/kg，低于GB2761-2011稻谷类及其制品的限量指标值。

本发明首次实现所述灵芝菌株转化加硒的液态米糠麸皮全料新培养基为富硒灵芝菌丝体原料的方法。所采用的菌株Ganoderma lucidum CCTCC M 2015066是发明人自己诱变得到的一株灵芝新菌株，该菌株可在加硒的液态米糠麸皮全料新培养基有效生长，并高效转化米糠麸皮为灵芝菌丝体，该菌株具有独特性，因而本发明也具有独特性。

本发明也取得了实质性特点和显著进步的创新性，原因主要有二：一是因为新菌株在液态米糠麸皮全料新培养基中高效生长时有害物转移到菌丝体的程度得到降低，此点在已有的公开文献中并未出现过；二是Ganoderma lucidum CCTCC M 2015066的米糠麸皮全料液态新培养基中米糠和麸皮的总浓度可达16.0 g/100mL，在加一定量的硒发酵时，纯菌丝的干重浓度、菌丝多糖浓度、发酵液中的粗多糖浓度分别达到5.2g/100mL、256.8mg/100mL 、573.9mg/100mL，灵芝发酵加硒的米糠麸皮原料的这一成果的水平为首次取得，在公开文献中未见报道，而菌丝中硒的含量为58.76 μg/g干菌丝，比较合适用于制造保健食品，因为成人每天摄入的硒推荐不超过50 μg，最高不超过200μg，故此菌丝适合用于配制保健食品，在保证菌丝多糖量的前提下，又可兼顾硒的每日摄入量。

本发明将低值的米糠麸皮转化成高值的具有多种保健功能的富硒灵芝菌丝体原料，对降低生产成本、低端资源高效合理高值化利用、保护大众健康，都具有有益的社会和经济效果，因而具有实用性。

综上所述，本发明已经具备了授予发明专利所必须的独特性、取得了实质性特点和显著进步的创新性和实用性，产生了发明专利应该具有的技术、经济和社会的有益效果。

附图说明

图1为菌株灵芝CCTCC M 2015066在发酵罐中液态发酵米糠麸皮全料新培养基所得的菌丝样品。

图2为菌株灵芝CCTCC M 2015066在液态发酵米糠麸皮全料新培养基所得的胞外干燥产物。

具体实施方式

本发明提供了通过紫外诱变，选育在米糠麸皮全料液态培养基上生长速度更快、多糖产量更高的诱变菌株Ganoderma lucidum CCTCC M 2015066的方法，所述方法包括下列步骤：

取实验室保藏的Ganoderma lucidum CCTCC M 2013287为出发菌株；

将所取出发菌株接种于PDA培养基上进行活化培养；

菌体培养后用无菌生理盐水洗脱制得孢子悬液；

将孢子悬液稀释所需倍数，在紫外灯下照射进行诱变后，接至米糠麸皮筛选培养基上避光培养，初筛选出生长速率较快、比较稳定的菌株；将初筛的菌株进行遗传稳定性试验，复筛选出生长速率较快、比较稳定的菌株；

用米糠麸皮全料液态培养基进行摇瓶发酵，三筛选出生长速率高和多糖产量高的菌株；进行拮抗试验；

在一个实施方案中，所用的PDA培养基为马铃薯200g/L，葡萄糖20g/L，蛋白胨5g/L，磷酸二氢钾1.5g/L，硫酸镁0.75g/L，琼脂20g/L，pH自然。

在一个实施方案中，所述恒温为28℃。

在一个实施方案中，所述紫外诱变采用红光暗操作，在距离功率为30W的紫外灯20cm下分别照射40s。

在一个实施方案中，所述避光培养为在28℃下避光培养5天。

在一个实施方案中，所述避光培养所用培养基为米糠、麸皮固体平板培养基：米糠30g/L，麸皮30g/L，磷酸二氢钾1.5g/L，硫酸镁0.75g/L，琼脂20g/L，pH自然，米糠、麸皮全料使用）。

在一个实施方案中，所述筛选方法为平板直径测定法。

在一个实施方案中，所述初筛步骤为：从紫外诱变避光培养的平板上挑取生长良好的单菌落分别接种至新的米糠麸皮固体平板培养基中，从紫外诱变中挑选出10株生长速度快且浓密的诱变株，对其进行3代传代培养，从中选出相对于出发菌株生长快、形状好、稳定性高的菌株。

在一个实施方案中，所述复筛步骤为：将粗筛选出的较优菌株分别进行5代平板传代培养，挑取生长良好的单菌落分别接种至新的米糠麸皮固体平板培养基中，挑选出生长速度快、健壮、纯正的变异株。

在一个实施方案中，所述三筛步骤为：以复筛确定的高生长速率变异株作为三筛的对象，与出发菌株一起进行摇瓶发酵筛选从而确定变异株优良性状稳定表达的菌株。将复筛选出的菌株和出发菌株Ganoderma lucidum CCTCC M 2013287进行摇瓶发酵试验，连续发酵5代，按指标确定目的诱变株。

在一个实施方案中，所述Ganoderma lucidum CCTCC M 2015066在复筛第五代平板上的生长速率为1.0mm/h，明显快于出发菌株的生长速率。

在一个实施方案中，所述摇瓶为250mL锥形瓶。

在一个实施方案中，所述米糠、麸皮液体发酵培养基为：米糠8.0g/100mL，麸皮8.0g/100mL，磷酸二氢钾0.36g/100mL，硫酸镁0.36g/100mL，半胱氨酸盐酸盐50mg/100mL，叶绿素铜钠盐10mg/100mL，pH自然。

在一个实施方案中，所述指标为100mL发酵体积的纯菌丝干重、菌丝多糖重量、发酵液胞外粗多糖重量和菌丝中硒的含量。

在一个实施方案中，所述筛选得到的灵芝新菌株Ganoderma lucidum CCTCC M2015066利用发酵新培养基获得的发酵结果为：纯菌丝的干重浓度、菌丝多糖浓度和发酵液中的粗多糖浓度分别达到8.4g/100mL、562.3mg/100mL和788.6mg/100mL。

在一个实施方案中，新菌株的菌丝干重浓度增加13.5%，菌丝多糖浓度增加了24.7%，发酵液中的胞外粗多糖也增加了47.1%，说明诱变所得新菌株具有更强的发酵米糠和麸皮的能力，菌株的发酵性能发生了显著的积极的变化。

在一个实施方案中，以拮抗性试验表征遗传性状，Ganoderma lucidum CCTCC M2015066的生长性能强于出发菌株的性能，遗传性状发生了变化。

在一个实施方案中，所述筛选得到的灵芝新菌株Ganoderma lucidum CCTCC M2015066发酵加硒的新培养基加水至所需的体积，121℃灭菌30min，作为培养基用于发酵。

在一个实施方案中，摇瓶装样量为40%，接种量为10%。

在一个实施方案中，培养温度28^oC，转速180r/min。

在一个实施方案中，发酵2d后加入2.68mg/100mL的灭菌的亚硒酸钠溶液，总发酵时间为7d。

在一个实施方案中，所述筛选得到的灵芝新菌株Ganoderma lucidum CCTCC M2015066发酵加硒的新培养基后的操作步骤为前述发明内容所描述技术方案中的步骤（3）～（9）。

在一个实施方案中，所述筛选得到的灵芝新菌株Ganoderma lucidum CCTCC M2015066发酵加硒的新培养基后的结果为：菌丝干重5.2 g/100mL培养基，菌丝多糖为256.8mg/100 mL 培养基，胞外多糖为573.9mg/100mL培养基，菌丝中硒的含量为58.76 μg/g干菌丝，铅的含量1.63mg/kg，砷的含量0.61mg/kg，汞的含量0.07mg/kg，均低于GB16740-2014限量指标值。黄曲霉毒素的含量17.5μg/kg，低于GB2761-2011稻谷类及其制品的限量指标值。图1为菌株灵芝CCTCC M 2015066在发酵罐中液态发酵米糠麸皮全料新培养基所得的菌丝样品。图2为菌株灵芝CCTCC M 2015066在液态发酵米糠麸皮全料新培养基所得的胞外干燥产物。

本发明利用灵芝CCTCC M 2015066在液态米糠麸皮全料新培养基中发酵生产灵芝菌丝体原料，所述灵芝新菌株为菌株灵芝JSU1401（Ganoderma lucidum JSU 1401），是灵芝菌株Ganoderma lucidum CCTCC M 2013287经紫外诱变筛选所得，已经于2015年1月23日保藏在中国武汉的武汉大学内的中国典型培养物保藏中心（CCTCC ），保藏菌株编号为 CCTCCM 2015066，名称为灵芝CCTCC M 2015066（拉丁名称为Ganoderma lucidum CCTCC M2015066）。本发明提供了一种采用灵芝CCTCC M 2015066在液态的加硒和半胱氨酸盐酸盐及叶绿素铜钠盐的米糠麸皮全料新培养基上生产富硒灵芝菌丝体保健食品原料的生产方法。

在具体实施方式中，将米糠和麸皮加水121℃灭菌30min，作为培养基用于发酵。

实施例一

灵芝菌株采用灵芝CCTCC M 2015066。米糠使用量为8.0g/100mL培养基，麸皮的使用量为8.0g/100mL培养基，添加KH₂PO₄0.36g/100mL，MgSO_{4 ‘}7H₂O 0.36g/100mL，半胱氨酸盐酸盐50mg/100mL，叶绿素铜钠盐10mg/100mL，pH自然，加水至所需的体积，121℃灭菌30min，作为培养基用于发酵，摇瓶装样量为40%，接种量为10%，培养温度28^oC，转速180r/min，发酵2d后加入2.68mg/100mL的灭菌的亚硒酸钠溶液，总发酵时间为7d。以下按前述发明内容所描述技术方案中的步骤（3）～（9）实施。结果为：菌丝干重5.2 g/100mL培养基，菌丝多糖为256.8mg/100 mL 培养基，胞外多糖为573.9mg/100mL培养基，菌丝中硒的含量为58.76 μg/g干菌丝，铅的含量1.63mg/kg，砷的含量0.61mg/kg，汞的含量0.07mg/kg，均低于GB16740-2014限量指标值。黄曲霉毒素的含量17.5μg/kg，低于GB2761-2011稻谷类及其制品的限量指标值。

实施例二

灵芝菌株采用灵芝CCTCC M 2015066。米糠使用量为5.0g/100mL培养基，麸皮的使用量为5.0g/100mL培养基，添加KH₂PO₄0.015g/100mL，MgSO_{4 ‘}7H₂O 0.015g/100mL，半胱氨酸盐酸盐20mg/100mL，叶绿素铜钠盐5mg/100mL，pH自然，加水至所需的体积，121℃灭菌30min，作为培养基用于发酵，摇瓶装样量为40%，接种量为8%，培养温度24^oC，转速150r/min，发酵2d后加入0.45mg/100mL的灭菌的亚硒酸钠溶液，总发酵时间为5d。以下按前述发明内容所描述技术方案中的步骤（3）～（9）实施。结果为：菌丝干重3.3 g/100mL培养基，菌丝多糖为157.5mg/100 mL 培养基，胞外多糖为340.8mg/100mL培养基，菌丝中硒的含量为22.57 μg/g干菌丝，铅的含量0.95mg/kg，砷的含量0.38mg/kg，汞的含量0.04mg/kg，均低于GB16740-2014限量指标值。黄曲霉毒素的含量11.6μg/kg，低于GB2761-2011稻谷类及其制品的限量指标值。

实施例三

灵芝菌株采用灵芝CCTCC M 2015066。米糠使用量为6.5g/100mL培养基，麸皮的使用量为6.5g/100mL培养基，添加KH₂PO₄0.18g/100mL，MgSO_{4 ‘}7H₂O 0.18g/100mL，半胱氨酸盐酸盐35mg/100mL，叶绿素铜钠盐7.5mg/100mL，pH自然，加水至所需的体积，121℃灭菌30min，作为培养基用于发酵，摇瓶装样量为40%，接种量为9%，培养温度26^oC，转速165r/min，发酵2d后加入1.34mg/100mL的灭菌的亚硒酸钠溶液，总发酵时间为9d。以下按前述发明内容所描述技术方案中的步骤（3）～（9）实施。结果为：菌丝干重4.3 g/100mL培养基，菌丝多糖为209.6mg/100 mL 培养基，胞外多糖为462.7mg/100mL培养基，菌丝中硒的含量为35.87 μg/g干菌丝，铅的含量1.39mg/kg，砷的含量0.52mg/kg，汞的含量0.05mg/kg，均低于GB16740-2014限量指标值。黄曲霉毒素的含量12.6μg/kg，低于GB2761-2011稻谷类及其制品的限量指标值。

实施例四

灵芝菌株采用灵芝CCTCC M 2015066。米糠使用量为5.0g/100mL培养基，麸皮的使用量为7.0g/100mL培养基，添加KH₂PO₄0.15g/100mL，MgSO_{4 ‘}7H₂O 0.08g/100mL，半胱氨酸盐酸盐40mg/100mL，叶绿素铜钠盐8mg/100mL，pH自然，加水至所需的体积，121℃灭菌30min，作为培养基用于发酵，摇瓶装样量为40%，接种量为8%，培养温度28^oC，转速150r/min，发酵2d后加入0.82mg/100mL的灭菌的亚硒酸钠溶液，总发酵时间为8d。以下按前述发明内容所描述技术方案中的步骤（3）～（9）实施。结果为：菌丝干重3.8 g/100mL培养基，菌丝多糖为193.2mg/100 mL 培养基，胞外多糖为435.9mg/100mL培养基，菌丝中硒的含量为29.35 μg/g干菌丝，铅的含量1.21mg/kg，砷的含量0.43mg/kg，汞的含量0.05mg/kg，均低于GB16740-2014限量指标值。黄曲霉毒素的含量12.8μg/kg，低于GB2761-2011稻谷类及其制品的限量指标值。

实施例五

灵芝菌株采用灵芝CCTCC M 2015066。米糠使用量为7.0g/100mL培养基，麸皮的使用量为6.0g/100mL培养基，添加KH₂PO₄0.015g/100mL，MgSO_{4 ‘}7H₂O 0.31g/100mL，半胱氨酸盐酸盐35mg/100mL，叶绿素铜钠盐9.5mg/100mL，pH自然，加水至所需的体积，121℃灭菌30min，作为培养基用于发酵，摇瓶装样量为40%，接种量为10%，培养温度27^oC，转速170r/min，发酵2d后加入2.5mg/100mL的灭菌的亚硒酸钠溶液，总发酵时间为10d。以下按前述发明内容所描述技术方案中的步骤（3）～（9）实施。结果为：菌丝干重3.5 g/100mL培养基，菌丝多糖为175.2mg/100 mL 培养基，胞外多糖为415.9mg/100mL培养基，菌丝中硒的含量为42.35 μg/g干菌丝，铅的含量1.47mg/kg，砷的含量0.58mg/kg，汞的含量0.04mg/kg，均低于GB16740-2014限量指标值。黄曲霉毒素的含量10.7μg/kg，低于GB2761-2011稻谷类及其制品的限量指标值。

实施例六

灵芝菌株采用灵芝CCTCC M 2015066。米糠使用量为5.5g/100mL培养基，麸皮的使用量为5.5g/100mL培养基，添加KH₂PO₄0.085g/100mL，MgSO_{4 ‘}7H₂O 0.075g/100mL，半胱氨酸盐酸盐50mg/100mL，叶绿素铜钠盐9mg/100mL，pH自然，加水至所需的体积，121℃灭菌30min，作为培养基用于发酵，摇瓶装样量为40%，接种量为10%，培养温度28^oC，转速160r/min，发酵2d后加入1.0mg/100mL的灭菌的亚硒酸钠溶液，总发酵时间为8d。以下按前述发明内容所描述技术方案中的步骤（3）～（9）实施。结果为：菌丝干重3.6 g/100mL培养基，菌丝多糖为175.6mg/100 mL 培养基，胞外多糖为396.0mg/100mL培养基，菌丝中硒的含量为38.16 μg/g干菌丝，铅的含量1.11mg/kg，砷的含量0.42mg/kg，汞的含量0.05mg/kg，均低于GB16740-2014限量指标值。黄曲霉毒素的含量11.7μg/kg，低于GB2761-2011稻谷类及其制品的限量指标值。

实施例七

灵芝菌株采用灵芝CCTCC M 2015066。发酵罐装样量为发酵罐容积的75%，发酵温度为28℃，通风量1：0.8v/v/mim，搅拌速度100r/min，罐表压0.05MPa，接种量8%，米糠为8.0g/100mL培养基，麸皮为8.0g/100mL培养基，添加KH₂PO₄0.36g/100mL，MgSO_{4 ‘}7H₂O0.36g/100mL，半胱氨酸盐酸盐50mg/100mL，叶绿素铜钠盐10mg/100mL，pH自然，加水至所需的体积，121℃灭菌30min，发酵2d后加入2.68mg/100mL的灭菌的亚硒酸钠溶液，总发酵时间为8d，以下按前述发明内容所描述技术方案中的步骤（3）～（9）实施。结果为：菌丝干重4.9 g/100mL培养基，菌丝多糖为249.8mg/100mL 培养基，胞外多糖为588.1mg/100mL培养基，菌丝中硒的含量为55.32 μg/g干菌丝，铅的含量1.68mg/kg，砷的含量0.72mg/kg，汞的含量0.04mg/kg，均低于GB16740-2014限量指标值。黄曲霉毒素的含量10.6μg/kg，低于GB2761-2011稻谷类及其制品的限量指标值。

实施例八

灵芝菌株采用灵芝CCTCC M 2015066。发酵罐装样量为发酵罐容积的70%，发酵温度为24℃，通风量1：0.8v/v/mim，搅拌速度50r/min，罐表压0.05MPa，接种量8%，米糠为5.0g/100mL培养基，麸皮为5.0g/100mL培养基，添加KH₂PO₄0.015g/100mL，MgSO_{4 ‘}7H₂O0.015g/100mL，半胱氨酸盐酸盐20mg/100mL，叶绿素铜钠盐5mg/100mL，pH自然，加水至所需的体积，121℃灭菌30min，发酵2d后加入0.45mg/100mL的灭菌的亚硒酸钠溶液，总发酵时间为5d，以下按前述发明内容所描述技术方案中的步骤（3）～（9）实施。结果为：菌丝干重3.1 g/100mL培养基，菌丝多糖为151.6mg/100mL 培养基，胞外多糖为356.9mg/100mL培养基，菌丝中硒的含量为27.12 μg/g干菌丝，铅的含量1.08mg/kg，砷的含量0.46mg/kg，汞的含量0.03mg/kg，均低于GB16740-2014限量指标值。黄曲霉毒素的含量9.2μg/kg，低于GB2761-2011稻谷类及其制品的限量指标值。

实施例九

灵芝菌株采用灵芝CCTCC M 2015066。发酵罐装样量为发酵罐容积的72%，发酵温度为26℃，通风量1：0.8v/v/mim，搅拌速度75r/min，罐表压0.05MPa，接种量9%，米糠为6.5g/100mL培养基，麸皮为6.5g/100mL培养基，添加KH₂PO₄0.18g/100mL，MgSO_{4 ‘}7H₂O0.18g/100mL，半胱氨酸盐酸盐35mg/100mL，叶绿素铜钠盐7.5mg/100mL，pH自然，加水至所需的体积，121℃灭菌30min，发酵2d后加入1.34mg/100mL的灭菌的亚硒酸钠溶液，总发酵时间为9d，以下按前述发明内容所描述技术方案中的步骤（3）～（9）实施。结果为：菌丝干重4.0 g/100mL培养基，菌丝多糖为215.3mg/100mL 培养基，胞外多糖为457.4mg/100mL培养基，菌丝中硒的含量为38.21 μg/g干菌丝，铅的含量1.26mg/kg，砷的含量0.55mg/kg，汞的含量0.02mg/kg，均低于GB16740-2014限量指标值。黄曲霉毒素的含量7.2μg/kg，低于GB2761-2011稻谷类及其制品的限量指标值。

Claims

1.富硒灵芝菌丝原料的生产方法，其特征在于按照下述步骤进行：

（1）将米糠和麸皮加所需量的水121℃灭菌30min；

（2）将米糠和麸皮全料作为碳源、氮源直接用于灵芝菌株（Ganoderma lucidum） CCTCCNO：M 2015066发酵培养基，米糠浓度为5-8g/100mL，麸皮浓度为5-8g/100mL，米糠和麸皮的总浓度为10.0-16.0 g/100mL，添加磷酸二氢钾0.015-0.36g/100mL，七水硫酸镁0.015-0.36g/100mL ，半胱氨酸盐酸盐20-50mg/100mL，叶绿素铜钠盐5-10mg/100mL，pH自然，250mL摇瓶装料100mL，发酵罐装料率70-75%，接种量8-10%，培养温度24-28℃，摇床转速150-180r/min或发酵搅拌浆转速50-150r/min，发酵2d后加入0.45-2.68mg/100mL的灭菌的亚硒酸钠溶液，总发酵时间为5-12d；

（4）将所得湿菌丝体进行冷冻干燥，得到菌丝粉成品；

2.根据权利要求1所述的富硒灵芝菌丝原料的生产方法，其特征在于步骤（2）中摇瓶时的装料量为摇瓶容积的40%，接种量为装料体积的8-10%，转速150-180r/min，培养时间为5-12d。

3.根据权利要求1所述的富硒灵芝菌丝原料的生产方法，其特征在于步骤（2）中上罐发酵时装样量为发酵罐容积的70-75%，上罐时通风量为装罐液体体积1：0.8v/v/mim ，培养温度24-28℃，搅拌速率50-150r/min，上罐发酵5-12d。

4.根据权利要求1所述的富硒灵芝菌丝原料的生产方法，其特征在于步骤（4）的冷冻干燥的操作压强为5Pa，加热板的温度为30℃，冻干时间为48-72h。