CN109867730A

CN109867730A - 海鲜菇多糖螯合硒的制备方法

Info

Publication number: CN109867730A
Application number: CN201910216262.4A
Authority: CN
Inventors: 陈义勇; 薛依婷; 徐紫依; 张泽; 张子轶; 丁霄; 吴欣怡; 蒋晗
Original assignee: Changshu Institute of Technology
Current assignee: Changshu Institute of Technology
Priority date: 2019-03-21
Filing date: 2019-03-21
Publication date: 2019-06-11

Abstract

本发明公开了海鲜菇多糖螯合硒的制备方法，称取亚硒酸钠加入蒸馏水中，完全溶解，配制成初始质量浓度为6～7mg/ml的亚硒酸钠溶液，按海鲜菇多糖与亚硒酸钠的质量比为5.5～6:1加入海鲜菇多糖，调节pH为4.5～6，于室温下螯合5.5～7h，再加入3倍体积的无水乙醇溶液，静置沉淀，再将其离心取沉淀，最后进行干燥得到海鲜菇多糖螯合硒；本发明方法螯合率高(达到10.07％)；同海鲜菇多糖相比，海鲜菇多糖‑硒螯合物对DPPH自由基和羟基自由基的清除能力增强。

Description

海鲜菇多糖螯合硒的制备方法

技术领域

本发明涉及螯合物的制备方法，具体是海鲜菇多糖螯合硒的制备方法，属于螯合技术领域。

背景技术

海鲜菇(Hypsizygus marmoreus)又被称作真姬菇，蟹味菇，斑玉蕈，是一种珍稀食用菌，隶属于白蘑科中的玉蕈属，其子实体大小有中等至较大，是一种低温型草生菌，生长温度可为5—30℃。海鲜菇的营养价值和药用价值都非常高。海鲜菇中是一种高碳水化合物、蛋白质、纤维素，低脂肪含量的食物，且海鲜菇蛋白质中的氨基酸包含了8种人体所需的必需氨基酸。

海鲜菇含有数种多糖体，目前对于海鲜菇多糖的研究方向主要为提取纯化工艺、结构鉴定、生物活性分析、开发功能性食品等方面。海鲜菇多糖的提取方法主要有：超声波提取法、微波提取法、热水浸提法、酶提取法。在海鲜菇多糖的组分分析方面，聂莹等人、周浩分别采用气相质谱和薄层层析对海鲜菇多糖组分进行了分析，发现海鲜菇多糖组分为：半乳糖、葡萄糖、甘露糖、半乳糖醛酸和木糖。Yuuichi Ukawa等采用凝胶渗透层析和离子交换色谱等分离方法，从海鲜菇子实体的热水提取物中分离出了11种多糖组分。在海鲜菇多糖的生物活性方面，已有研究发现，海鲜菇多糖具有增强免疫的作用。王金梅等人通过不同剂量的海鲜菇多糖给小鼠灌胃，再检测小鼠的不同指标，最后结果表明：海鲜菇多糖可以增强小鼠的免疫功能。海鲜菇多糖具有抑菌活性。王耕采用纸片琼脂法，测定海鲜菇多糖的抑菌强度，以枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌等为供试菌,结果表明,海鲜菇多糖对上述三种菌均有一定的抑制作用。

多糖-硒螯合物的研究进展：多糖-硒螯合物(硒多糖)是一种多糖有机硒化合物，它由通过一定工艺将多糖和硒结合而得，使产物兼具硒和多糖两者的活性，如此一来就将无机硒转化为有机硒，这样就降低了硒的原有毒性。研究证明，硒多糖的生物以及药理活性都普遍高于多糖和硒两者单独作用时的效果，且更容易被机体吸收和利用。硒多糖的生理活性主要有：抗氧化、抗病毒、抗肿瘤等，且这些活性已被用于相关产品的研发。目前已上市的产品有：有复方硒多糖胶囊、香菇硒多糖胶囊等。

目前硒多糖的来源主要有三种：①天然植物硒多糖。多指在富硒的环境下，植物在生长过程中吸收土壤中的无机硒合成有机硒。②微生物富集硒多糖。无机硒被添加到相应的培养基中，并且硒根据微生物的生长和代谢发生富集和转化。③人工合成硒多糖。多糖含有醛基、游离羟基、或酮基等多种基团,正是这些集团使得多糖能够与其它化合物发生特定的反应,为多糖的硒化或合成等提供可能性。

海鲜菇由于其味道鲜美，肉质厚嫩，所以多被作为食材直接食用，但是从食用菌中提取多糖等活性成分，并开发出具有高附加值的保健食品、药品等也是对珍惜食用菌资源进行开发与利用的高效途径。

硒(Se)是人体生命活动中必需的微量元素之一，虽然微量元素在人体内的含量以及需求量不多，但它与人的生命是息息相关的，且对个体的生命起至关重要的作用。硒在人体中具有抗氧化、提高免疫力等多种生物功能。

目前对于多糖与铁、锌、钙离子的螯合的研究与报道较多，但是多糖与硒螯合的研究相对来说较少，尤其是海鲜菇多糖—硒螯合物的研究鲜见报道。但鉴于硒多糖突出的生理活性，所以近来逐步成为研究的焦点。

发明内容

本发明的目的是提供海鲜菇多糖螯合硒的制备方法，该方法螯合率高，获得的螯合物对DPPH自由基的清除能力高。

为了达到上述技术目的，本发明的技术方案是：

海鲜菇多糖制备：

(1)对海鲜菇进行除杂、干燥、粉碎处理，过60目筛，得到海鲜菇干粉。

(2)称取海鲜菇干粉于烧杯中，采用热水浸提法：按料液比1:20加入去离子水，放入90℃水浴锅中提取2h，不断搅拌，反复3次上述过程。

(3)将得到的海鲜菇多糖滤液离心，优选离心15min，离心速度为4000r/min。

(4)再将溶液于70℃下浓缩3h，采用sevage法(正丁醇：氯仿＝4:1)去除多糖浓缩液中的蛋白(sevage试剂：多糖溶液＝1:4)，离心后收集上清液。

(5)最后向溶液中缓慢加入3倍体积的85％乙醇沉淀12h使多糖逐渐析出，将溶液离心(优选离心20min，离心速度为4000r/min)后，合并离心管中的沉淀，干燥后得到海鲜菇多糖。

海鲜菇多糖螯合硒的制备方法：

称取亚硒酸钠加入蒸馏水中，完全溶解，配制成初始质量浓度为6～7mg/ml的亚硒酸钠溶液，按海鲜菇多糖与亚硒酸钠的质量比为5.5～6:1加入海鲜菇多糖，调节pH为4.5～6，于室温下螯合5.5～7h，再加入3倍体积的无水乙醇溶液，静置沉淀，再将其离心取沉淀，最后进行干燥得到海鲜菇多糖螯合硒。

亚硒酸钠溶液初始质量浓度、海鲜菇多糖与亚硒酸钠的质量比、螯合时间和pH对海鲜菇多糖螯合硒的螯合反应(螯合率)的影响较大。

硒离子初始浓度过低就会造成螯合不完全，而浓度过高(超过7mg/mL)时反应液已经饱和，再添加亚硒酸钠反而阻碍多糖与硒离子的螯合反应。

亚硒酸钠溶液初始质量浓度对螯合反应(螯合率)影响的验证：

称取0.15，0.20，0.25，0.30，0.35，0.40g亚硒酸钠，加入50ml蒸馏水，完全溶解，配制成初始质量浓度分别为3，4，5，6，7，8mg/ml的亚硒酸钠溶液，按海鲜菇多糖与亚硒酸钠的质量比(mg/mg)为4:1加入海鲜菇多糖，于室温下螯合6h，计算螯合率。

亚硒酸钠初始质量浓度对螯合率的影响见图1。分析图1，海鲜菇多糖与硒的螯合率先随亚硒酸钠质量浓度的升高而升高，当亚硒酸钠的质量浓度为7mg/mL时，螯合率达到最大，随后螯合率便开始降低，验证了最佳亚硒酸钠初始质量浓度为7mg/mL。

为螯合完全，减少亚硒酸钠阻碍多糖与硒离子的螯合反应，选择初始质量浓度为6～7mg/ml。

螯合时间的延长，促使海鲜菇多糖与硒有了更为紧密的接触反应，使得螯合率不断升高。但是随着螯合时间(超过6h)的不断延长，在一定程度上破坏了体系的稳定性，使其副反应的发生率增高，多糖有一定程度的降解，造成螯合率的显著降低。

螯合时间对螯合反应(螯合率)影响的验证：

移取浓度为4mg/mL的亚硒酸钠溶液，按海鲜菇多糖与亚硒酸钠的质量比(mg/mg)为4:1加入海鲜菇多糖，于室温下分别螯合4，5，6，7，8，9h，计算螯合率。

不同螯合时间对螯合率的影响见图2。分析图2，当螯合时间由4h延长到9h，当螯合时间为6h时达到最大，螯合率呈现出先上升而后缓慢下降的趋势，后面基本趋于平稳状态。因此，验证了最佳螯合时间为6h。

在促使海鲜菇多糖与硒紧密的接触反应的基础上，确保体系的稳定性，减少副反应的发生率，减少多糖的降解，选择螯合时间为5.5～7h。

多糖与亚硒酸钠之间的反应存在着相互依存的关系，随着多糖与亚硒酸钠的质量比的提高，多糖能充分的与亚硒酸钠螯合，进而使得螯合率增加。当多糖与亚硒酸钠的质量比超过一定值(6:1)时，多糖过多会造成溶解困难，同时导致反应底物亚硒酸钠不足，影响螯合反应的进行，导致螯合率下降。

海鲜菇多糖与亚硒酸钠的质量比对螯合反应(螯合率)影响的验证：

移取浓度为4mg/mL的亚硒酸钠溶液，按海鲜菇多糖与亚硒酸钠的质量比(mg/mg)为3:1，4:1，5:1，6:1，7:1，8:1加入海鲜菇多糖，于室温下螯合6h，计算螯合率。

海鲜菇多糖与亚硒酸钠的质量比对螯合率的影响见图3。分析图3，质量比对于螯合率的影响的总体趋势为：随着多糖与亚硒酸钠的质量比(mg/mg)的增大而先升高后降低，螯合率达到最高的点对应的质量比为6:1，而后开始呈现下降趋势。因此，验证了最佳螯合质量比为6:1。

为了多糖充分与亚硒酸钠螯合，避免多糖过多造成溶解困难，避免导致反应底物亚硒酸钠不足，影响螯合反应的进行，选择海鲜菇多糖与亚硒酸钠的质量比为5.5～6:1。

pH对螯合率的影响较大，pH值太大，溶液中的阴离子会与海鲜菇多糖的活性基团产生竞争，进而阻碍螯合物的形成；pH值太小，反应液中产生的氢离子增多，这将导致原本应该螯合上的硒离子螯合不完全，也会使得螯合率降低。

pH对螯合反应(螯合率)影响的验证：

移取浓度为4mg/mL的亚硒酸钠溶液，按海鲜菇多糖与亚硒酸钠的质量比(mg/mg)为4:1加入海鲜菇多糖，调节pH为3，4，5，6，7，8，室温下螯合6h，计算螯合率。

不同pH对螯合率的影响见图4。分析图4，反应液的PH值对硒离子的强度有一定的影响。图4中可见，海鲜菇多糖与亚硒酸钠的螯合率随着pH的升高呈现出先升高后下降的结果，当pH从3升高至5时，螯合率达到最大。因此，验证了海鲜菇多糖与硒螯合的最佳pH为5。

为了避免溶液中的阴离子会与海鲜菇多糖的活性基团产生竞争(阻碍螯合物的形成)，同时避免反应液中产生较多的氢离子(导致螯合不完全)，pH选择为4.5～6。

作为优选，所述亚硒酸钠溶液初始质量浓度为6.5mg/mL，海鲜菇多糖与亚硒酸钠的质量比为6:1，螯合时间为7h，pH为5.5。可见，上述的工艺条件并非上述各个因素的最佳参数。这是因为：影响螯合率的因素亚硒酸钠溶液初始质量浓度、海鲜菇多糖与亚硒酸钠的质量比、螯合时间及pH之间存在交互作用，其中亚硒酸钠初始质量浓度与pH的交互作用对螯合率的影响最为显著，初始质量浓度和螯合时间的交互作用对螯合率的影响次之，质量比和螯合时间的交互作用对螯合率的影响最不显著，正是基于影响螯合率的因素之间的交互作用，确定了最佳螯合工艺参数。

本发明方法螯合率高(达到10.07％)；同海鲜菇多糖相比，海鲜菇多糖-硒螯合物对DPPH自由基和羟基自由基的清除能力增强。

附图说明

图1为亚硒酸钠初始质量浓度对螯合率的影响图。

图2为不同螯合时间对螯合率的影响图。

图3为质量比对螯合率的影响图。

图4为不同pH对螯合率的影响图。

图5为海鲜菇多糖螯合前后对DPPH自由基的清除效果图。

图6为海鲜菇多糖螯合前后对羟基自由基的清除效果图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。

实施例1

对海鲜菇进行除杂、干燥、粉碎处理，过60目筛，得到海鲜菇干粉；称取海鲜菇干粉于烧杯中，采用热水浸提法：按料液比1:20加入去离子水，放入90℃水浴锅中提取2h，不断搅拌，反复3次上述过程；将得到的海鲜菇多糖滤液离心，离心15min，离心速度为4000r/min。再将溶液于70℃下浓缩3h，采用sevage法去除多糖浓缩液中的蛋白，离心后收集上清液；最后向溶液中缓慢加入3倍体积的85％乙醇沉淀12h使多糖逐渐析出，将溶液离心(离心20min，离心速度为4000r/min)后，合并离心管中的沉淀，干燥后得到海鲜菇多糖。

称取亚硒酸钠加入蒸馏水中，完全溶解，配制成初始质量浓度为6mg/ml的亚硒酸钠溶液，按海鲜菇多糖与亚硒酸钠的质量比为5.5:1加入海鲜菇多糖，调节pH为4.5，于室温下螯合6h，再加入3倍体积的无水乙醇溶液，静置沉淀，再将其离心取沉淀，最后进行干燥得到海鲜菇多糖螯合硒。

经测定，上述海鲜菇多糖螯合硒的螯合率为9.89％。

实施例2

称取亚硒酸钠加入蒸馏水中，完全溶解，配制成初始质量浓度为6.5mg/ml的亚硒酸钠溶液，按海鲜菇多糖与亚硒酸钠的质量比为6:1加入海鲜菇多糖，调节pH为5.5，于室温下螯合7h，再加入3倍体积的无水乙醇溶液，静置沉淀，再将其离心取沉淀，最后进行干燥得到海鲜菇多糖螯合硒。

经测定，上述海鲜菇多糖螯合硒的螯合率为10.07％。

实施例3

称取亚硒酸钠加入蒸馏水中，完全溶解，配制成初始质量浓度为7mg/ml的亚硒酸钠溶液，按海鲜菇多糖与亚硒酸钠的质量比为6:1加入海鲜菇多糖，调节pH为6，于室温下螯合5.5h，再加入3倍体积的无水乙醇溶液，静置沉淀，再将其离心取沉淀，最后进行干燥得到海鲜菇多糖螯合硒。

经测定，上述海鲜菇多糖螯合硒的螯合率为9.85％。

分别对海鲜菇多糖在螯合前后(上述实施例获得)DPPH自由基清除能力进行测定，结果如图5所示，对图5进行分析可知：海鲜菇多糖在螯合前后对DPPH自由基都有一定的清除能力，且作用结果与多糖浓度呈一定的线性关系，随着多糖浓度的增加，对于自由基的清除率逐步上升并趋于稳定状态，上下变化幅度细微。在多糖浓度相同的情况下，海鲜菇多糖对DPPH的清除率最高达到了73.71％，海鲜菇多糖-硒螯合物对DPPH自由基的清除率最高达89.73％，由此可知，海鲜菇多糖-硒螯合物对DPPH自由基的清除能力高于螯合前的多糖。

分别对海鲜菇多糖在螯合前后(上述实施例获得)对羟基自由基的清除效果进行测定，结果如图6所示，对图6进行分析可知：海鲜菇多糖在螯合前后对羟基自由基都有一定的清除能力，且作用结果与多糖浓度呈一定的线性关系，总体来说，随着多糖浓度的提高，对·OH的清除能力也随之增强。同时可以从图中看出，海鲜菇多糖螯合前的清除率都要低于螯合后的清除率。由此可知，海鲜菇多糖-硒螯合物对羟自由基(·OH)的清除能力高于螯合前的多糖。

上述实施例不以任何方式限制本发明，凡是采用等同替换或等效变换的方式获得的技术方案均落在本发明的保护范围内。

Claims

1.海鲜菇多糖螯合硒的制备方法，其特征在于：称取亚硒酸钠加入蒸馏水中，完全溶解，配制成初始质量浓度为6～7mg/ml的亚硒酸钠溶液，按海鲜菇多糖与亚硒酸钠的质量比为5.5～6:1加入海鲜菇多糖，调节pH为4.5～6，于室温下螯合5.5～7h，再加入3倍体积的无水乙醇溶液，静置沉淀，再将其离心取沉淀，最后进行干燥得到海鲜菇多糖螯合硒。

2.根据权利要求1所述的海鲜菇多糖螯合硒的制备方法，其特征在于：所述亚硒酸钠溶液初始质量浓度为6.5mg/mL，海鲜菇多糖与亚硒酸钠的质量比为6:1，螯合时间为7h，pH为5.5。

3.根据权利要求1所述的海鲜菇多糖螯合硒的制备方法，其特征在于所述海鲜菇多糖通过以下方法制备：

(1)对海鲜菇进行除杂、干燥、粉碎处理，过60目筛，得到海鲜菇干粉；

(2)称取海鲜菇干粉于烧杯中，采用热水浸提法：按料液比1:20加入去离子水，放入90℃水浴锅中提取2h，不断搅拌，反复3次上述过程；

(3)将得到的海鲜菇多糖滤液离心；

(4)再将溶液于70℃下浓缩3h，采用sevage法去除多糖浓缩液中的蛋白，离心后收集上清液；

(5)最后向溶液中缓慢加入3倍体积的85％乙醇沉淀12h使多糖逐渐析出，将溶液离心后，合并离心管中的沉淀，干燥后得到海鲜菇多糖。

4.根据权利要求3所述的海鲜菇多糖螯合硒的制备方法，其特征在于在所述步骤(3)中，离心15min，离心速度为4000r/min。

5.根据权利要求1所述的海鲜菇多糖螯合硒的制备方法，其特征在于在所述步骤(5)中，离心20min，离心速度为4000r/min。