CN110922499B - 一种富硒化绣球菌多糖及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种富硒化绣球菌多糖及其制备方法，包括以下步骤：绣球菌多糖的提取、绣球菌多糖的精制、绣球菌多糖的富硒化；绣球菌多糖的富硒化按以下过程进行：向精制后的绣球菌多糖中加入硝酸、硒化试剂、催化剂，调pH 7~8后，反应在超声条件下进行；之后进行透析、醇沉、冷冻干燥。本发明还公开了一种富硒化绣球菌多糖在抗氧化活性上的应用。本发明的一种富硒化绣球菌多糖结合了绣球菌多糖及有机硒的双重优点，具备更好的生物活性；本发明的一种富硒化绣球菌多糖的制备方法简单、条件可控，制备的富硒化绣球菌多糖具有优异的抗氧化活性。
Description
技术领域
本发明涉及食品技术领域，
尤其是，本发明涉及一种富硒化绣球菌多糖及其制备方法和应用。
背景技术
绣球菌，又名荷仙菇、花瓣茸，其子实体呈白色或奶黄色，饱满如绣球，玲珑似花瓣，晶莹剔透，洁白细嫩。由于其自然野生资源蕴藏量稀少，人工栽培难度大，有“万菇之王”之称，是世界上最名贵的食药用菌之一。因其具有超高的激活免疫能力，在日本有“梦幻神奇菇”之称。普通蘑菇生长在阴面，而绣球菇每天需要10h以上的照射，是世界上唯一的“阳光蘑菇”。
绣球菌的最大特点是含有大量β葡聚糖。根据日本食品分析中心的分析，每100 g绣球菌含有β-葡聚糖高达43.6g，比灵芝和姬松茸高出3~4倍。可以说，绣球菌所含的β-葡聚糖为菇类之最。葡聚糖是由葡萄糖单体聚合而成的多糖，分为α型和β型，α型葡聚糖如淀粉等，是机体能量的主要来源，不具备生物活性。β型葡聚糖是一种生物活性物质，经医学研究证实，具有免疫调节、抗肿瘤、抗炎、抗病毒、抗氧化、抗辐射、降血糖、降血脂、保肝等多种功能。
富硒化多糖是在多糖结构中的羟基的上氢原子被硒原子所取代从而形成硒化多糖。硒是人体必需的微量元素，现代医学研究证明，适量补硒有延缓衰老、清除体内自由基、增强机体免疫力、维持正常神经功能、抗癌防癌的奇特功效，硒被誉为自由基的“清道夫”、“抗癌之王”，若将绣球菌多糖富硒化，不仅可以保留绣球菌多糖的化学活性，还同时具有有机硒的活性。
目前，尚没有关于绣球菌多糖富硒化方面的研究。
发明内容
为了克服上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种富硒化绣球菌多糖及其制备方法和应用。
为解决上述问题，本发明采用如下技术方案：
一种富硒化绣球菌多糖的制备方法，包括以下步骤：
绣球菌多糖的提取、绣球菌多糖的精制、绣球菌多糖的富硒化；
所述绣球菌多糖的富硒化按以下过程进行：
向所述精制后的绣球菌多糖中加入硝酸、硒化试剂、催化剂，调pH 7~8后，反应在超声条件下进行；之后进行透析、醇沉、冷冻干燥。
优选地，所述绣球菌多糖的提取包括以下步骤：
将新鲜绣球菌通过物理挤压的方式进行脱水处理；
将经过所述脱水处理后的绣球菌进行粉碎处理；
取粉碎的绣球菌，加入纤维素酶、纯水得混合液，加入有机溶剂保护剂、pH调节剂调pH 4.5~5.5后进行超声处理，得绣球菌粗多糖提取液；
将所述绣球菌粗多糖提取液经过灭酶、浓缩、醇沉、干燥后即制得绣球菌粗多糖。
优选地，所述硒化试剂为亚硒酸钠，所述催化剂为氯化钡；所述超声条件为：超声频率30~35 KHZ，超声功率85~90 W，超声时间4~6 h。
优选地，所述绣球菌多糖的精制包括sevage法脱蛋白、活性炭脱色、DEAE-52纤维素柱洗脱分离。
优选地，所述混合液中绣球菌与纯水的质量比为1：20~40，纤维素酶占所述混合液总重量的1~3%，所述有机溶剂保护剂占所述混合液体积的1~5%。
优选地，所述超声处理频率为20KHZ，功率为40~80W，温度为40~50℃，时间为30~60min。
优选地，所述有机溶剂保护剂为环己烷或四氯化碳；所述pH调节剂为柠檬酸。
本发明还提供一种按上述的一种富硒化绣球菌多糖的制备方法制备的富硒化绣球菌多糖及其在抗氧化活性上的应用。
与现有技术相比，本发明的技术效果体现在：
本发明的一种富硒化绣球菌多糖结合了绣球菌多糖及有机硒的双重优点，具备更好的生物活性；本发明的一种富硒化绣球菌多糖的制备方法简单、条件可控，制备的富硒化绣球菌多糖具有优异的抗氧化活性。
附图说明
图1为本发明实施例提供的不同制备方法制备的富硒化绣球菌多糖对超氧阴离子自由基的清除率对比图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图和实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明实施例提供一种富硒化绣球菌多糖及其制备方法，包括以下步骤：
（1）绣球菌多糖的提取；
（2）绣球菌多糖的精制；
（3）绣球菌多糖的富硒化；富硒化按以下过程进行：向精制后的绣球菌多糖中加入硝酸、硒化试剂、催化剂，调pH 7~8后，反应在超声条件下进行；之后进行透析、醇沉、冷冻干燥。
目前，关于绣球菌中多糖成分的提取也有不少研究，通常做法是将新鲜绣球菌通过热风或冷冻干燥后磨成菌粉，再通过热水或碱液提取，提取的多糖得率有限，且干燥过程能耗较高。此外，热风干燥由于干燥温度较高，一方面能耗耗费大，另一方面热风干燥温度较高，高温可能会破坏绣球菌中的活性物质，且会影响绣球菌中多糖的提取率。冷冻干燥虽然条件温和，可以较好的保留绣球菌中的活性物质，但干燥效率低、成本高，不适合大规模生产应用。
优选地，本发明的步骤（1）中绣球菌多糖的提取按以下过程进行：
（11）将新鲜绣球菌通过物理挤压的方式进行脱水处理；
（12）将经过脱水处理后的绣球菌进行粉碎处理；
（13）取粉碎的绣球菌，加入纤维素酶、纯水得混合液，加入有机溶剂保护剂、pH调节剂调pH 4.5~5.5后进行超声处理，得绣球菌粗多糖提取液；
（14）将绣球菌粗多糖提取液经过灭酶、浓缩、醇沉、干燥后即制得绣球菌粗多糖。
其中，在进行脱水处理之前，还可以对新鲜绣球菌进行清洗、沥干处，以除去新鲜绣球菌上的泥土等杂物。新鲜绣球菌的含水率在90%以上，经过步骤（1）的脱水处理可以脱除新鲜绣球菌70~85%的水份。步骤（12）中经过粉碎处理后通过10mm~20mm的网筛，绣球菌粒径在10~20mm之间。步骤（13）中混合液中绣球菌与纯水的质量比为1：20~40，纤维素酶占混合液总重量的1~3%，有机溶剂保护剂占所述混合液体积的1~5%。超声处理频率为20KHZ，功率为40~80W，温度为40~50℃，时间为30~60min。有机溶剂保护剂为环己烷或四氯化碳这类低极性的有机溶剂，有机溶剂的存在可以提高纤维素酶对超声失活的抗性； pH调节剂为柠檬酸。步骤（14）中的绣球菌粗多糖提取液经过灭酶、离心、减压浓缩后，采用75%的乙醇醇沉、离心干燥后即制得绣球菌粗多糖。灭酶处理在100℃的热水中快速灭酶5min。
本发明通过物理挤压的方式对新鲜绣球菌进行脱水处理，克服传统热风干燥或冷冻干燥脱水的缺陷，不仅可以最大限度保留新鲜绣球菌中的活性物质，而且操作简单，能耗低，可以批量规模化应用；且物理脱水程度可以满足后续处理要求。
本发明步骤（1）中绣球菌多糖的提取通过酶解配合超声处理工艺来提取多糖，可以克服单纯酶提取耗时长、效率低的缺点；同时在保证纤维素酶高活性的前提下，利用超声处理在较短的时间内获得较高的多糖提取率。
优选地，步骤（2）中绣球菌多糖的精制包括sevage法脱蛋白、活性炭脱色、DEAE-52纤维素柱洗脱分离。
sevage法脱蛋白：将步骤（1）中的绣球菌粗多糖用蒸馏水溶解，过滤掉不可溶解的杂质，配置成粗多糖溶液，加入多糖溶液体积的1/3 Sevage试剂(V氯仿：V正丁醇=4:1)，充分震荡后静置30 min，离心取上清液，弃去下层变性蛋白质，然后重复上述操作，至到两液分层处无白色浑浊出现，旋蒸除掉残留的Sevage试剂。
活性炭脱色：将活性炭用蒸馏水冲洗，祛除杂质后，放入烘箱烘干，冷却备用。把脱蛋白后的绣球菌多糖溶液放入烧杯中，添加质量分数为1.5%的活性炭，在60℃条件下，搅拌30min后，放凉抽滤，滤液离心，取上清液，得脱色后的绣球菌多糖溶液。
DEAE-52纤维素柱洗脱分离：将DEAE-52纤维素进行前处理，之后将经活性炭脱色后的绣球菌多糖装入柱中，用0.5mol/L的NaCl溶液洗脱后经分子量为8000 Da的透析袋透析72 h，浓缩，冷冻干燥即得精制绣球菌多糖。
优选地，步骤（3）中绣球菌多糖的富硒化按以下过程进行：向步骤（2）中的精制绣球菌多糖中加入0.5%硝酸、硒化试剂亚硒酸钠、催化剂氯化钡，调pH 7~8后，反应在超声条件下进行；之后进行透析、无水乙醇醇沉、冷冻干燥即得富硒化绣球菌多糖。优选地，超声条件为：超声频率30~35 KHZ，超声功率85~90 W，超声时间4~6 h。采用分光光度法检测富硒化绣球菌多糖的取代度，在微酸性条件下硒元素与3,3’-二氨基联苯胺络合生成黄色物质，此黄色络合物在420 nm处有强吸收，被甲苯等有机溶剂萃取后用分光光度法进行检测。富硒化绣球菌多糖的硒化取代度为0.18~0.21。
下面结合具体实施例做进一步说明。
实施例1
本发明实施例1提供一种富硒化绣球菌多糖及其制备方法，包括以下步骤：
（1）绣球菌多糖的提取：
1）取新鲜绣球菌，用清水清洗并沥干；
2）将新鲜绣球菌通过螺旋挤压脱水机进行脱水处理，脱除新鲜绣球菌中80%的水份；
3）将经过脱水处理后的绣球菌进行粉碎处理，粉碎至粒径10~20mm；
4）取粉碎的绣球菌50 g，加入纤维素酶、纯水得混合液，加入环己烷、柠檬酸调pH4.8后进行超声处理得绣球菌粗多糖提取液，混合液中绣球菌与纯水的质量比为1：30，纤维素酶占混合液总重量的1.5%，环己烷体积占混合液体积的2%，超声处理频率为20KHZ，功率为40W，温度为40℃，时间40min；
5）将绣球菌粗多糖提取液灭酶后在8000r/min离心10min后取上清液，减压浓缩至原体积的1/2，在浓缩液中加入4倍体积75%的乙醇醇沉，8000r/min离心15min后在50℃烘箱中干燥6h即制得绣球菌粗多糖。
（2）绣球菌多糖的精制：将步骤（1）中的绣球菌粗多糖依次经过sevage法脱蛋白、活性炭脱色、DEAE-52纤维素柱洗脱分离处理，用0.5mol/L的NaCl溶液洗脱出后经分子量为8000 Da的透析袋透析72 h，浓缩，冷冻干燥即得精制绣球菌多糖。
（3）绣球菌多糖的富硒化：称取步骤（2）中的精制绣球菌多糖100 mg，加入0.5%硝酸、足量的硒化试剂亚硒酸钠、催化剂氯化钡，调pH 7~8后，反应在超声条件下进行，超声频率30 KHZ，超声功率85 W，超声时间4 h；之后进行透析、无水乙醇醇沉、冷冻干燥即得富硒化绣球菌多糖A。测得硒化取代度为0.19。
实施例2
本发明实施例2提供一种富硒化绣球菌多糖及其制备方法，包括以下步骤：
（1）绣球菌多糖的提取：
1）取新鲜绣球菌，用清水清洗并沥干；
2）将新鲜绣球菌通过螺旋挤压脱水机进行脱水处理，脱除新鲜绣球菌中82%的水份；
3）将经过脱水处理后的绣球菌进行粉碎处理，粉碎至粒径10~20mm；
4）取粉碎的绣球菌50 g，加入纤维素酶、纯水得混合液，加入环己烷、柠檬酸调pH5.5后进行超声处理得绣球菌粗多糖提取液，混合液中绣球菌与纯水的质量比为1：40，纤维素酶占混合液总重量的2.0%，环己烷体积占混合液体积的3%，超声处理频率为20KHZ，功率为50W，温度为40℃，时间50min；
5）将绣球菌粗多糖提取液灭酶后在8000r/min离心10min后取上清液，减压浓缩至原体积的1/2，在浓缩液中加入4倍体积75%的乙醇醇沉，8000r/min离心15min后在50℃烘箱中干燥6h即制得绣球菌粗多糖。
（2）绣球菌多糖的精制：将步骤（1）中的绣球菌粗多糖依次经过sevage法脱蛋白、活性炭脱色、DEAE-52纤维素柱洗脱分离处理，用0.5mol/L的NaCl溶液洗脱出后经分子量为8000 Da的透析袋透析72 h，浓缩，冷冻干燥即得精制绣球菌多糖。
（3）绣球菌多糖的富硒化：称取步骤（2）中的精制绣球菌多糖100 mg，加入0.5%硝酸、足量的硒化试剂亚硒酸钠、催化剂氯化钡，调pH 7~8后，反应在超声条件下进行，超声频率35 KHZ，超声功率85 W，超声时间5 h；之后进行透析、无水乙醇醇沉、冷冻干燥即得富硒化绣球菌多糖B。测得硒化取代度为0.21。
实施例3
本发明实施例3提供一种富硒化绣球菌多糖及其制备方法，包括以下步骤：
（1）绣球菌多糖的提取：
1）取新鲜绣球菌，用清水清洗并沥干；
2）将新鲜绣球菌通过螺旋挤压脱水机进行脱水处理，脱除新鲜绣球菌中78%的水份；
3）将经过脱水处理后的绣球菌进行粉碎处理，粉碎至粒径10~20mm；
4）取粉碎的绣球菌50 g，加入纤维素酶、纯水得混合液，加入环己烷、柠檬酸调pH4.7后进行超声处理得绣球菌粗多糖提取液，混合液中绣球菌与纯水的质量比为1：40，纤维素酶占混合液总重量的2.5%，环己烷体积占混合液体积的5%，超声处理频率为20KHZ，功率为50W，温度为40℃，时间50min；
5）将绣球菌粗多糖提取液灭酶后在8000r/min离心10min后取上清液，减压浓缩至原体积的1/2，在浓缩液中加入4倍体积75%的乙醇醇沉，8000r/min离心15min后在50℃烘箱中干燥6h即制得绣球菌粗多糖。
（2）绣球菌多糖的精制：将步骤（1）中的绣球菌粗多糖依次经过sevage法脱蛋白、活性炭脱色、DEAE-52纤维素柱洗脱分离处理，用0.5mol/L的NaCl溶液洗脱出后经分子量为8000 Da的透析袋透析72 h，浓缩，冷冻干燥即得精制绣球菌多糖D。
（3）绣球菌多糖的富硒化：称取步骤（2）中的精制绣球菌多糖100 mg，加入0.5%硝酸、足量的硒化试剂亚硒酸钠、催化剂氯化钡，调pH 7~8后，反应在超声条件下进行，超声频率35 KHZ，超声功率90 W，超声时间6 h；之后进行透析、无水乙醇醇沉、冷冻干燥即得富硒化绣球菌多糖C。测得硒化取代度为0.21。
应用例
本发明应用例提供一种富硒化绣球菌多糖在抗氧化活性上的应用。将实施例1~实施例3制备的富硒化绣球菌多糖A、B、C及实施例3制备的精制绣球菌多糖D分别配成浓度为0.1mg/mL、0.2mg/mL、0.3mg/mL、0.4mg/mL、0.5mg/mL的样品溶液，各取2 mL预热后加入3 mLpH 8.2的Tris-Hcl缓冲液、0.3 mL邻苯三酚混合均匀，25 ℃反应5 min后加入1 mL Hcl终止反应。用分光光度法测定各样品对超氧阴离子自由基的清除率，结果如图1所示。
从图1中看到，本发明实施例1~实施例3制备的富硒化绣球菌多糖对超氧阴离子自由基均体现出较高的清除率，但实施例3制备的未经过富硒化的精制绣球菌多糖对超氧阴离子自由基的清除率明显降低，一方面可能与硒含量有关，另一方面可能是经过富硒化的绣球菌多糖其制备过程经过了两次超声处理过程，超声处理过程可能会破坏多糖的分子结构，超声过程更有利于制备的多糖的抗氧化活性的提高。
本发明不局限于上述具体的实施方式，本发明可以有各种更改和变化。凡是依据本发明的技术实质对以上实施方式所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (4)
1.一种富硒化绣球菌多糖在制备抗氧化活性制品上的应用，其特征在于，富硒化绣球菌多糖的制备包括以下步骤：
绣球菌多糖的提取、绣球菌多糖的精制、绣球菌多糖的富硒化；
所述绣球菌多糖的富硒化按以下过程进行：
向所述精制后的绣球菌多糖中加入硝酸、硒化试剂、催化剂，调pH 7~8后，反应在超声条件下进行；之后进行透析、醇沉、冷冻干燥；
所述绣球菌多糖的提取包括以下步骤：
将新鲜绣球菌通过物理挤压的方式进行脱水处理；
将经过所述脱水处理后的绣球菌进行粉碎处理；
取粉碎的绣球菌，加入纤维素酶、纯水得混合液，加入有机溶剂保护剂、pH调节剂调pH4.5~5.5后进行超声处理，得绣球菌粗多糖提取液；
将所述绣球菌粗多糖提取液经过灭酶、浓缩、醇沉、干燥后即制得绣球菌粗多糖；
所述混合液中绣球菌与纯水的质量比为1：20~40，纤维素酶占所述混合液总重量的1~3%，所述有机溶剂保护剂占所述混合液体积的1~5%；
所述有机溶剂保护剂为环己烷或四氯化碳；所述pH调节剂为柠檬酸。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述硒化试剂为亚硒酸钠，所述催化剂为氯化钡；所述超声条件为：超声频率30~35 KHZ，超声功率85~90 W，超声时间4~6 h。
3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述绣球菌多糖的精制包括sevage法脱蛋白、活性炭脱色、DEAE-52纤维素柱洗脱分离。
4.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述超声处理频率为20KHZ，功率为40~80W，温度为40~50℃，时间为30~60min。
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