CN109957039A - 一种荷仙菇多糖提取工艺参数优化方法及提取方法 - Google Patents

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耿广军
曹向宇
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Abstract

本发明公开了一种荷仙菇多糖提取工艺参数优化方法及提取方法，该方法综合分析了超声时间、pH、酶活力、酶解温度、酶解时间和液料比对多糖提取的影响，并通过响应面模型对提取条件进行优化，得到一种新的提取工艺，能够高效地提取荷仙菇中的多糖。与现有提取工艺相比，本发明的提取工艺科学合理，提取率高，成本低。

Description

一种荷仙菇多糖提取工艺参数优化方法及提取方法
技术领域
本发明属于天然提取物技术领域，具体涉及一种基于响应面法优化荷仙菇多糖提取工艺参数的方法及荷仙菇多糖提取方法。
背景技术
荷仙菇属于多孔菌目、荷仙菇科、荷仙菇属。其分布很广，在澳大利亚、加拿大、中国、芬兰、法国、德国、日本、瑞士、泰国以及英国和美国均有其存在。夏秋季在云杉、冷杉或松林及混交林中分散生长，柄基部似根状并与树根相连。
荷仙菇又名花瓣菇，它是一种药食两用的真菌，含有丰富的蛋白质、维生素和矿物质等多种营养物质，此外还有丰富的活性多糖。多糖除了可以为人体的生长提供能量，还具有抵抗肿瘤、降血脂、降血糖、抗感染和免疫调节的活性作用，因此，荷仙菇多糖物质的含量可作为内在品质的评价指标。
目前，有关荷仙菇多糖的报道较少，而且其提取工艺参数不完善，已有的提取方法，相比其丰富的含量来说，提取率较低，能耗较高，成本高。
发明内容
为克服荷仙菇多糖提取率较低的问题，本发明的发明人经尝试探索试验，提出一种基于响应面优化荷仙菇多糖提取工艺参数的方法，该方法以荷仙菇为材料，以提高多糖的提取率为目的，采用超声波辅助酶法提取，在单因素试验的基础上，利用响应面优化提取工艺，为荷仙菇多糖的提取提供技术支持，为荷仙菇资源的综合利用以及提高附加值提供理论依据。
为了实现上述目的，本发明创造采用的技术方案为：一种基于响应面法优化荷仙菇多糖提取工艺参数优化方法，其特征包括以下步骤：
S1：采集荷仙菇原料，干燥，粉碎，荷仙菇粉末备用；
S2：用超声波辅助酶法提取荷仙菇中的多糖，测定提取液中多糖的含量；
S3：选择超声时间、pH、酶活力、酶解温度、酶解时间和液料比进行单因素试验；
S4：在单因素试验的基础上，选取影响最大的三个因素，以酶活力、pH和超声时间为自变量，以多糖的提取率为响应值，建立多元二次方程；
S5：对多元二次方程进行响应面分析，取多糖提取率为最大值，对荷仙菇多糖的提取工艺进行优化，得到提取工艺参数。
S6：利用S5中得到的提取工艺参数再进行荷仙菇多糖最佳提取参数的确定和实验验证。
所述的S2中测定提取液中多糖含量的具体方法为按照苯酚-硫酸法，再根据线性回归方程换算成样品中的多糖含量，其荷仙菇多糖的提取率计算公式如下：
式中：
C：根据标准曲线得到的稀释后的样品浓度mg/mL；
K：稀释倍数；
V：提取液体积mL；
m：样品质量g。
所述的S3中进行单因素试验时，分析各因素对多糖提取率的影响，选取超声时间、pH、酶活力、酶解温度、酶解时间和液料比依次进行单因素试验，其中超声时间为：10、20、30、40、50min；pH为：3.5、4.0、4.5、5.0、5.5；酶活力为：60、120、180、240、300U/g；酶解温度为：30、40、50、60、70℃；酶解时间为：1、1.5、2、2.5、3h；液料比为：20、30、40、50、60mL/g。
所述的S4中建立多元二次方程时，选择对提取率影响大的三个因素，酶活力、pH和超声时间，根据实验数据进行多元回归拟合，获得荷仙菇中多糖提取率对自变量三个因素，酶活力、pH和超声时间的二次多项方程，根据实验结果建立数学模型，建立数学模型后，对荷仙菇中多糖提取的数学模型进行显著性差异检验。
在S5中，选取最佳工艺参数时，在选取的三个因素范围内，多糖提取率选最大，根据回归模型，通过软件分析得出荷仙菇多糖最佳提取工艺参数。
一种荷仙菇多糖提取方法，其步骤为：
1)：确定提取过程中所需的超声时间、pH、酶活力、酶解温度、酶解时间和液料比；
2)：采集荷仙菇原料，干燥，粉碎，荷仙菇粉末备用；
3)：将S2中得到的黄荷仙菇粉末加入水中，并采用超声辅助酶法提取荷仙菇多糖，得到提取液，该步中超声时间、pH、酶活力、酶解温度、酶解时间和液料比为S1中的确认值。
所述的步骤1)中，超声时间为10～50min；pH为3.5～5.5；酶活力为60～300U/g；酶解温度为30～70℃；酶解时间为1～3h；液料比为20～60mL/g。
所述的超声时间为21min；pH为4.9；酶活力为185U/g；酶解温度为60℃；酶解时间为2h；液料比为50mL/g。
本发明创造的有益效果为：本发明提供的一种荷仙菇多糖的提取工艺参数优化方法，是在综合考虑了超声时间、pH、酶活力、酶解温度、酶解时间和液料比等因素对多糖提取的影响，并通过响应面模型对提取条件进行优化，得到新的提取工艺參数，能够高效、准确的提取荷仙菇中的多糖。采用本方法优化后的工艺与现有工艺相比，本发明的提取工艺科学合理，总多糖提取率高。
附图说明
图1是绘制的标准曲线。
图2是超声时间对多糖提取率的影响曲线图。
图3是pH对多糖提取率的影响曲线图。
图4是酶活力对多糖提取率的影响曲线图。
图5是酶解温度对多糖提取率的影响曲线图。
图6是酶解时间对多糖提取率的影响曲线图。
图7是液料比对多糖提取率的影响曲线图。
图8是Box-Behnken响应面分析实验因素与水平表。
图9是响应面分析方案及实验结果表。
图10是回归方差分析表。
图11是酶活力和pH交互作用响应面图。
图12是酶活力和超声时间交互作用响应面图。
图13是pH进而超声时间交互作用响应面图。
具体实施方式
一种基于响应面法优化荷仙菇多糖提取工艺参数优化方法，其特征包括以下步骤：
S1：采集荷仙菇原料，干燥，粉碎，荷仙菇粉末备用。
S2：用超声波辅助酶法提取荷仙菇中的多糖，测定提取液中多糖的含量。所述的S2中测定提取液中多糖含量的具体方法为按照苯酚-硫酸法，再根据线性回归方程换算成样品中的多糖含量，其荷仙菇多糖的提取率计算公式如下：
式中：
C：根据标准曲线得到的稀释后的样品浓度mg/mL；
K：稀释倍数；
V：提取液体积mL；
m：样品质量g。
S3：选择超声时间、pH、酶活力、酶解温度、酶解时间和液料比进行单因素试验。所述的S3中进行单因素试验时，分析各因素对多糖提取率的影响，选取超声时间、pH、酶活力、酶解温度、酶解时间和液料比依次进行单因素试验，其中超声时间为：10、20、30、40、50min；pH为：3.5、4.0、4.5、5.0、5.5；酶活力为：60、120、180、240、300U/g；酶解温度为：30、40、50、60、70℃；酶解时间为：1、1.5、2、2.5、3h；液料比为：20、30、40、50、60mL/g。
S4：在单因素试验的基础上，选取影响最大的三个因素，以酶活力、pH和超声时间为自变量，以多糖的提取率为响应值，建立多元二次方程。所述的S4中建立多元二次方程时，选择对提取率影响大的三个因素，酶活力、pH和超声时间，根据实验数据进行多元回归拟合，获得荷仙菇中多糖提取率对自变量三个因素，酶活力、pH和超声时间的二次多项方程，根据实验结果建立数学模型，建立数学模型后，对荷仙菇中多糖提取的数学模型进行显著性差异检验。
S5：对多元二次方程进行响应面分析，取多糖提取率为最大值，对荷仙菇多糖的提取工艺进行优化，得到提取工艺参数。在S5中，选取最佳工艺参数时，在选取的三个因素范围内，多糖提取率选最大，根据回归模型，通过软件分析得出荷仙菇多糖最佳提取工艺参数。
S6：利用S5中得到的提取工艺参数再进行荷仙菇多糖最佳提取参数的确定和实验验证。
一种荷仙菇多糖提取方法，其步骤为：
1)：确定提取过程中所需的超声时间、pH、酶活力、酶解温度、酶解时间和液料比。其中，超声时间为10～50min；pH为3.5～5.5；酶活力为60～300U/g；酶解温度为30～70℃；酶解时间为1～3h；液料比为20～60mL/g。优选的，超声时间为21min；pH为4.9；酶活力为185U/g；酶解温度为60℃；酶解时间为2h；液料比为50mL/g。
2)：采集荷仙菇原料，干燥，粉碎，荷仙菇粉末备用。
3)：将S2中得到的黄荷仙菇粉末加入水中，并采用超声辅助酶法提取荷仙菇多糖，得到提取液，该步中超声时间、pH、酶活力、酶解温度、酶解时间和液料比为S1中的确认值。
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。
实施例1
一种基于响应面法优化荷仙菇多糖提取工艺参数的方法包括以下过程：
1)收集荷仙菇菌体，清洗，烘干，粉碎成粉末备用。
2)葡萄糖标准液的配置及标准曲线的制定。
采用苯酚-硫酸法，浓硫酸水解多糖或寡糖为单糖，并使得单糖迅速脱水为糠醛衍生物，强酸条件下糠醛衍生物可与苯酚发生显色反应，生成的橙黄色物质在490nm处有最大吸收值。由于吸光值与多糖浓度在一定浓度范围内成线性关系，故可用比色法测定多糖含量。
称取100mg葡萄糖，加蒸馏水溶解，转移至1000mL容量瓶定容，配成100μg/mL葡萄糖标准溶液。分别取葡萄糖标准溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4mL于试管中，用蒸馏水补至2.0mL，依次加入5％苯酚溶液1.0mL，然后迅速加入浓硫酸溶液5.0mL，静置10min后摇匀，待其冷却后测定其在490nm处的吸光值，以蒸馏水作空白对照。绘制以浓度为横坐标，以吸光值为纵坐标而成的标准曲线。
3)荷仙菇中多糖含量分析
取2mL多糖提取液，加5％苯酚溶液1mL，混匀后加浓硫酸5mL，摇匀，温室放置10min，摇匀，待其冷却后于490nm波长处测定吸光度，根据线性回归方程换算成样品中多糖的含量，荷仙菇中多糖的提取率计算公式如下：
式中：C-根据标准曲线得到的稀释后的样品浓度mg/mL，K-稀释倍数，V-提取液体积mL，m-样品质量g。
4)荷仙菇中多糖提取单因素试验
研究各因素对多糖提取率的影响，选取超声时间、pH、酶活力、酶解温度、酶解时间和液料比依次进行单因素试验。分别试验超声时间为：10、20、30、40、50min；pH为：3.5、4.0、4.5、5.0、5.5；酶活力为：60、120、180、240、300U/g；酶解温度为：30、40、50、60、70℃；酶解时间为：1、1.5、2、2.5、3h；液料比为：20、30、40、50、60mL/g，对荷仙菇多糖提取率的影响，结果如附图2-附图7所示，由附图可知：
由附图2可知，超声时间在15～20min的范围内，荷仙菇多糖的得率逐渐提高，在超声时间到达20min时，荷仙菇多糖得率最高，随之后再增加超声时间，提取率趋于稳定。
由附图3可知，随着提取液pH值的增大，荷仙菇多糖得率呈现先增大后减小的趋势，其中在pH值为5时多糖的得率达到最大。可能是因为pH值影响酶的活性，在最适pH值条件下，酶解反应达到最大速度，而高于或低于最适pH值，都会降低酶活性，随之，荷仙菇多糖得率也会下降。
由附图4可知，在一定酶活力的范围内，荷仙菇多糖得率随着酶活力的增加而增加，在当酶活力达到180U/g时，多糖得率达到最大值，继续增加酶活力，多糖得率趋于稳定。原因可能是：酶添加量小于最佳值时，酶解反应没有完全，底物较多，酶与底物未能充分接触，部分细胞壁未能破坏，多糖释放较少。当酶添加量为最佳值时，酶解反应较彻底，荷仙菇多糖得率较高。
由附图5可知，在一定温度范围内，荷仙菇多糖的得率随着温度的升高而升高，当温度到达60℃时，多糖得率达到最大值，之后，多糖得率反而降低。这可能是因为酶活性受到温度影响，在适宜的温度环境中，酶的活性会随着温度的升高而增加，因而得率也随之增加；当达到最适温度后，随着温度升高酶活性降低，因此，荷仙菇多糖的得率下降。
由附图6可知，荷仙菇多糖得率随着酶解时间的增加，先增加后减少，当酶解时间为2h时，多糖得率最大。这是因为反应前期底物浓度、酶活性较高，提取率上升较快，但随着酶解时间延长，反应产物的积累抑制了酶的活力，导致多糖提取率下降，因此，酶解时间为2h左右为宜。
由附图7可知，在一定范围内，荷仙菇多糖的得率随着提取液用量的增加而增加，当液料比达到50mL/g时，多糖得率达到最大值，之后随着提取液用量的增加，多糖得率反而下降。这可能是由于在一定的范围内，当酶添加量固定时，随着提取液用量的增加，酶与底物充分接触，酶对细胞壁充分降解，使细胞组织迅速破坏，多糖得以释放。超过一定范围，随着提取液用量继续增加，酶的浓度随之减少，酶与底物不能充分接触，酶解反应速率随着降低。
5)响应面试验
在单因素的基础上，选择对提取率影响最大的三个因素，酶活力、pH和超声时间，根据Box-Behnken设计原则，以酶活力、pH和超声时间为自变量，以荷仙菇的多糖提取率为响应值，对荷仙菇多糖的提取条件进行优化，实验因素及水平设计见附图8，响应面试验设计与结果见附图9，数据的方差分析结果见附图10。预测最佳提取率为22.39％，优化后最佳条件为酶活力184.63U/g、pH为4.90、超声时间为20.75min。
模型方程的建立与显著性检验。利用Design-Expert 8.0.5统计软件，对附图10中实验数据进行多元回归拟合，获得荷仙菇中多糖提取率对自变量pH，酶活力和超声时间的二元多次回归。根据实验结果建立的数学模型为：
Y＝22.15+0.63A-0.86B+1.09C+0.087A*B-0.66A*C+0.54B*C-1.11A2-1.89B2-2.75C2
根据附图10中的方差表分析表明，回归方程具有及高度的显著性(p≤0.01)，R2＝0.9845，调整R2＝0.9645，表明响应值荷仙菇中多糖提取率与预测值之间有较好的拟合度。
对荷仙菇中多糖提取的数学模型进行显著性检验，结果见附图10。由附图10中显示可知，一次项A、B、C极显著(p≤0.01)，说明酶活力、pH和超声时间对荷仙菇中多糖提取率有极显著影响。
交互作用响应面图见附图11-13，由图可知：交互项AC极显著(p≤0.01)，说明酶活力和超声时间交互项对荷仙菇中多糖提取率有极显著影响。交互项AB和BC不显著(p≥0.05)，说明酶活力和pH，pH和超声时间交互项对荷仙菇中多糖提取率无显著影响。二次项A、B、C对仙菇中多糖提取率有极显著影响(p≤0.01)。
验证实验：
首先收集荷仙菇，干燥，粉碎成粉末，然后利用超声辅助酶法提取荷仙菇多糖，优化后最佳条件为酶活力为184.63U/g、pH为4.90、超声时间为20.75min，在此条件下荷仙菇多糖的理论提取率为22.39％，考虑到实际操作中遇到问题，将此工艺修整为：酶活力为185U/g，pH为4.90，超声时间21min。将得到的多糖提取液按照如下公式计算多糖提取率，公式为：
式中：C-根据标准曲线得到的稀释后的样品浓度mg/mL，K-稀释倍数，V-提取液体积mL，m-样品质量g。
从本实施例中荷仙菇多糖提取率为22.35％，与预测值基本吻合，说明此模型较好地预测荷仙菇多糖的提取条件和提取量之间的关系，证实试验设计合理。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种基于响应面法优化荷仙菇多糖提取工艺参数优化方法，其特征包括以下步骤：
S1：采集荷仙菇原料，干燥，粉碎，荷仙菇粉末备用；
S2：用超声波辅助酶法提取荷仙菇中的多糖，测定提取液中多糖的含量；
S3：选择超声时间、pH、酶活力、酶解温度、酶解时间和液料比进行单因素试验；
S4：在单因素试验的基础上，选取影响最大的三个因素，以酶活力、pH和超声时间为自变量，以多糖的提取率为响应值，建立多元二次方程；
S5：对多元二次方程进行响应面分析，取多糖提取率为最大值，对荷仙菇多糖的提取工艺进行优化，得到提取工艺参数。
2.根据权利要求1所述的一种基于响应面优化荷仙菇多糖提取工艺参数优化方法，其特征在于，所述的步骤S5后，进行以下步骤：
S6：利用S5中得到的提取工艺参数再进行荷仙菇多糖最佳提取参数的确定和实验验证。
3.根据权利要求1所述的一种基于响应面优化荷仙菇多糖提取工艺参数优化方法，其特征在于：所述的S2中测定提取液中多糖含量的具体方法为按照苯酚-硫酸法，再根据线性回归方程换算成样品中的多糖含量，其荷仙菇多糖的提取率计算公式如下：
式中：
C：根据标准曲线得到的稀释后的样品浓度mg/mL；
K：稀释倍数；
V：提取液体积mL；
m：样品质量g。
4.根据权利要求1所述的一种基于响应面优化荷仙菇多糖提取工艺参数优化方法，其特征在于：所述的S3中进行单因素试验时，分析各因素对多糖提取率的影响，选取超声时间、pH、酶活力、酶解温度、酶解时间和液料比依次进行单因素试验，其中超声时间为：10、20、30、40、50min；pH为：3.5、4.0、4.5、5.0、5.5；酶活力为：60、120、180、240、300U/g；酶解温度为：30、40、50、60、70℃；酶解时间为：1、1.5、2、2.5、3h；液料比为：20、30、40、50、60mL/g。
5.根据权利要求1所述的一种基于响应面优化荷仙菇多糖提取工艺参数优化方法，其特征在于：所述的S4中建立多元二次方程时，选择对提取率影响大的三个因素，酶活力、pH和超声时间，根据实验数据进行多元回归拟合，获得荷仙菇中多糖提取率对自变量三个因素，酶活力、pH和超声时间的二次多项方程，根据实验结果建立数学模型，建立数学模型后，对荷仙菇中多糖提取的数学模型进行显著性差异检验。
6.根据权利要求1所述的一种基于响应面优化荷仙菇多糖提取工艺参数优化方法，其特征在于：在S5中，选取最佳工艺参数时，在选取的三个因素范围内，多糖提取率选最大，根据回归模型，通过软件分析得出荷仙菇多糖最佳提取工艺参数。
7.一种权利要求1-6提取工艺参数优化方法中所应用的荷仙菇多糖提取方法，其特征在于，其步骤为：
1)：确定提取过程中所需的超声时间、pH、酶活力、酶解温度、酶解时间和液料比；
2)：采集荷仙菇原料，干燥，粉碎，荷仙菇粉末备用；
3)：将S2中得到的黄荷仙菇粉末加入水中，并采用超声辅助酶法提取荷仙菇多糖，得到提取液，该步中超声时间、pH、酶活力、酶解温度、酶解时间和液料比为S1中的确认值。
8.根据权利要求7所述的一种荷仙菇多糖提取方法，其特征在于：所述的步骤1)中，超声时间为10～50min；pH为3.5～5.5；酶活力为60～300U/g；酶解温度为30～70℃；酶解时间为1～3h；液料比为20～60mL/g。
9.根据权利要求8所述的一种荷仙菇多糖提取方法，其特征在于：所述超声时间为21min；pH为4.9；酶活力为185U/g；酶解温度为60℃；酶解时间为2h；液料比为50mL/g。
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