CN108834479A - 定量测定大麦种子活力的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提出一种定量测定大麦种子活力的方法，属于大麦种子活力评价技术领域，能够快速稳定的对大麦种子的发芽潜力进行评估，为种子的采购和生产提供参考依据。该方法包括利用四氮唑(TTC)对解剖好的大麦种子进行染色，采用冻干结合球磨粉碎的技术手段对染色好的大麦种子进行粉碎处理，以10％的三氯乙酸甲醇溶液作为萃取液对粉碎后的大麦种子进行萃取得到三苯甲臢(TTF)，采用吸光光度法，根据TTF标准曲线定量分析其含量来预测大麦种子活力。其中，采用冻干结合球磨粉碎的技术手段，减少了样品在操作过程中的损失，保证实验结果更加精确可靠。对大麦种子进行分离解剖，减少了无用物质对后续实验的干扰，缩小了反应体积，节省了实验成本和工作量。

Description

定量测定大麦种子活力的方法

技术领域

本发明属于大麦种子活力评价技术领域，尤其涉及一种利用四氮唑(TTC)对大麦种子进行染色处理，进一步用有机溶剂萃取得到三苯甲臢(TTF)，采用吸光光度法，根据三苯甲臢标准曲线定量分析其含量来预测大麦种子活力的评价方法。

背景技术

种子的活力是种子质量的重要评价指标，它与种子的萌发率具有密切的相关性，对种子活力的快速准确测定可以真实反映种子的发芽能力，尤其适合处于休眠期不能正常萌发种子的评价。目前常用的种子活力评价方法有四氮唑(2,3,5-氯化三苯基四氮唑，TTC)染色法，溴麝香草酚兰(BTB)法和电导率测定法等，其中TTC染色法仅在1-2天内即可对种子的活力进行快速的评价，而且避免了休眠期种子对萌发的判断干扰，具有明显的优势。

1972年最先公开了将种子进行TTC染色后生成的红色物质TTF用甲醇萃取，测量吸光值并对种子的活力进行定量分析(参见文献Quantitative reduction of triphenyltetrazolium chloride as a measure of viability in cereal seeds(Harty等，Australian Journal of Experimental Agriculture，1972年，第12期，第12卷，第517-522页))；随后，相继有人对染色浓度、染色时间、萃取方法进行了优化；最近，文献ASpectrophotometric Assay for Robust Viability Testing of Seed Batches Using2,3,5-Triphenyl Tetrazolium Chloride:Using Hordeum vulgare L.as a Model(Egido等，Frontiers in Plant Science，2017年，第8期，第747卷，第747页)对不同的方法进行了系统的比较并进行改进，其实验结果表明，10％三氯乙酸(TCA)甲醇溶液在提取效率上优于甲醇和丙酮的提取方法。

然而，上述实验过程中采用了液氮研磨的方法对种子进行粉碎处理，操作繁琐费力，同时，种子的转移会造成种子在研钵和研杵上残留，液氮处理会在样品中混入不定量的冷凝水，导致实验产生不稳定误差，影响种子活力评价的准确性。

发明内容

本发明的目的在于提供一种定量测定大麦种子活力的方法，该方法可以快速稳定的对大麦种子的发芽潜力进行评估，为种子的采购和生产提供参考依据。

为了达到上述目的，本发明提供了一种定量测定大麦种子活力的方法，包括以下步骤：

将低温保存在反应管中的采用四氮唑染液染色好的大麦种子充分冻干，球磨粉碎，离心，得到粉碎后的大麦种子；

向上述装有粉碎后的大麦种子的反应管中加入甲醇稀释的三氯乙酸溶液，充分萃取后，离心，取上清液，得到含有三苯甲臢的上清液；

测定上述上清液在484nm下的吸光值，以甲醇稀释的三氯乙酸溶液作为空白对照，根据三苯甲臢标准曲线计算对应吸光值下的三苯甲臢浓度，定量测定大麦种子的活力。

作为优选，所述染色好的大麦种子由以下方法得到:

将活化好的大麦种子进行解剖，去除胚乳，采用四氮唑染液对解剖后的大麦种子进行染色，充分染色后，去除染色液，用去离子水洗涤大麦种子，吸干残余的去离子水，-20℃保存染色好的大麦种子。

作为优选，所述活化好的大麦种子通过以下方法得到：

将大麦种子用2-3％的过氧化氢溶液洗涤，随后用去离子水洗涤，最后加入去离子水充分浸泡，得到活化好的大麦种子。

作为优选，所述四氮唑染液的浓度为0.2-1％。

作为优选，所述活化好的大麦种子在20-37℃恒温下进行染色。

作为优选，所述甲醇稀释的三氯乙酸溶液由以下方法得到：

向100％的三氯乙酸母液中加入甲醇稀释10倍，得到质量分数为10％的三氯乙酸甲醇溶液。

作为优选，所述大麦种子与10％的三氯乙酸甲醇溶液的加入比例为10粒大麦种子对应2mL 10％的三氯乙酸甲醇溶液。

作为优选，所述粉碎后的大麦种子于恒温震荡中进行充分萃取，萃取温度为20-40℃。

作为优选，所述三苯甲臢标准曲线由以下方法得到：

配制三苯甲臢标准溶液，用标准溶液依次稀释配制不同浓度的三苯甲臢溶液，测量不同浓度的三苯甲臢溶液在484nm下的吸光值，建立三苯甲臢吸光值与对应浓度的标准曲线。

与现有技术相比，本发明的优点和积极效果在于：

1、本发明在萃取过程中采用了冻干结合球磨粉碎的技术手段，与传统的液氮研磨方案相比，更加省时省力，一次性可以粉碎80个样品，效率大大提高；同时，样品从粉碎到萃取不需要转移至其它容器，避免了样品与研钵研杵接触所造成的损失，使得实验数据结果更加精确可靠。

2、本方法在染色前对大麦进行了分离解剖，去除了大部分不具有活性的胚乳，只保留了种子中具有活性的胚组织，大大减少了无用物质对后续实验的干扰，同时缩小了实验的反应体积，节省了实验成本和工作量。

附图说明

图1为三苯甲臢浓度的标准曲线；

图2为实施例1中三苯甲臢-大麦萌发率曲线；

图3为实施例2中三苯甲臢-大麦萌发率曲线；

图4为实施例3中三苯甲臢-大麦萌发率曲线；

图5为实施例4中三苯甲臢-大麦萌发率曲线；

图6为实施例5中三苯甲臢-大麦萌发率曲线。

具体实施方式

下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明实施例提供了一种定量测定大麦种子活力的方法，包括以下步骤：

S1：将低温保存在反应管中的采用四氮唑染液染色好的大麦种子充分冻干，球磨粉碎，离心，得到粉碎后的大麦种子；

在上述步骤中，采用四氮唑染液对大麦种子进行染色，其原理为：活力高的种胚含有较高活力的脱氢酶，在脱氢酶的还原作用下，种子吸收的无色四氮唑染液(TTC)被还原成红色不溶于水的三苯甲臜(TTF)附着于种胚上，如果种胚死亡则TTC不能被还原为TTF，若种胚活力衰减则生成的TTF量较少，种子活力越高，生成的TTF的量越高，因此可以根据生成的TTF的量来定量测定大麦种子的活力。

同时，本步骤中采用冻干结合球磨粉碎的技术手段对染色好的大麦种子进行粉碎处理，与传统的液氮研磨的方案相比，更加省时省力，一次性可以粉碎80个样品，效率大大提高；同时，由于样品粉碎后，无需将其转移至其它容器即可进行萃取，避免了因操作过程中的样品损失造成测量的TTF量偏小，使得数据结果更加精确可靠。

S2：向上述装有粉碎后的大麦种子的反应管中加入甲醇稀释的三氯乙酸溶液，充分萃取后，离心，取上清液，得到含有三苯甲臢的上清液。

在上述步骤中，采用甲醇稀释的三氯乙酸溶液作为萃取液对粉碎后的大麦种子进行萃取，其中，三氯乙酸的作用是沉淀种子中的蛋白，避免对定量结果造成干扰，提高了TTF的提取率，使得实验结果更加准确。

S3：测定上述上清液在484nm下的吸光值，以甲醇稀释的三氯乙酸溶液作为空白对照，根据三苯甲臢标准曲线计算对应吸光值下的三苯甲臢浓度，定量测定大麦种子的活力。

在上述步骤中，若样品吸光值超过标准曲线计算范围，可以稀释后测量，根据三苯甲臢标准曲线计算对应吸光值下的TTF浓度(稀释样品计算时需要乘以对应的稀释倍数)，结合建立的三苯甲臢-大麦萌发率曲线评估大麦的最大发芽潜力，评定种子活力及质量水平，指导后续的生产或采购计划。

在一优选实施例中，所述染色好的大麦种子由以下方法得到:

将活化好的大麦种子进行解剖，去除胚乳，采用四氮唑染液对解剖后的大麦种子进行染色，充分染色后，去除染色液，用去离子水洗涤大麦种子，吸干残余的去离子水，-20℃保存染色好的大麦种子。

在上述实施例中，对活化好的大麦种子进行解剖，去除胚乳，原因在于，胚乳为种子储藏营养物质的部分，不含有脱氢酶活性，且胚乳的质量占大麦种子总质量的80％以上，通过解剖去除不含有脱氢酶活性的无用物质，能够减小该部分对后续实验的干扰，同时缩小了实验的反应体积，节省了实验成本和工作量。

在一优选实施例中，所述活化好的大麦种子通过以下方法得到：

将大麦种子用2-3％的过氧化氢溶液洗涤，随后用去离子水洗涤，最后加入去离子水充分浸泡，得到活化好的大麦种子。

在上述实施例中，采用2-3％的过氧化氢溶液洗涤大麦种子，并用去离子水充分浸泡，用以活化大麦种子内部的脱氢酶活性，其中，使用过氧化氢溶液洗涤大麦种子，目的在于清除大麦种子表面的残留微生物，避免对后续实验造成干扰。

在一优选实施例中，所述四氮唑染液的浓度为0.2-1％。在该实施例中，具体限定了四氮唑染液的浓度，原因在于，当四氮唑染液的浓度小于0.2％时，大麦种子染色效果不好，当四氮唑染液的浓度高于1％时，会对种子产生毒性，不利于染色，可以理解的是四氮唑染液的浓度还可以是0.4％、0.6％、0.8％及其范围内的任意点值。

在一优选实施例中，所述活化好的大麦种子在20-37℃恒温下进行染色。本实施例具体限定了染色温度，可以理解的是，所述染色温度还可以是25℃、30℃、35℃及其范围内的任意点值。

在一优选实施例中，所述甲醇稀释的三氯乙酸溶液由以下方法得到：

向100％的三氯乙酸母液中加入甲醇稀释10倍，得到质量分数为10％的三氯乙酸甲醇溶液。

在该实施例中，具体限定了三氯乙酸甲醇溶液中三氯乙酸的质量分数为10％，原因在于，该浓度下的三氯乙酸甲醇溶液对TTF的萃取率较高，有利于TTF的充分萃取，提高实验结果的准确性。

在一优选实施例中，所述大麦种子与10％的三氯乙酸甲醇溶液的加入比例为10粒大麦种子对应2mL 10％的三氯乙酸甲醇溶液。在该实施例中，具体限定了大麦种子与10％的三氯乙酸甲醇溶液的加入比例，原因在于，在该加入量下，能够保证大麦种子中TTF的充分萃取，同时尽量减少萃取液的用量。

在一优选实施例中，所述粉碎后的大麦种子于恒温震荡中进行充分萃取，萃取温度为20-40℃。在该实施例中，具体限定了萃取温度，原因在于三苯甲臢在温度高于40℃时不稳定，温度低于20℃时，萃取效率低。可以理解的是，萃取温度还可以为25℃、30℃、35℃及其范围内的任意点值。

在一优选实施例中，所述三苯甲臢标准曲线由以下方法得到：

配制三苯甲臢标准溶液，用标准溶液依次稀释配制不同浓度的三苯甲臢溶液，测量不同浓度的三苯甲臢溶液在484nm下的吸光值，建立三苯甲臢吸光值与对应浓度的标准曲线。

为了更清楚详细地介绍本发明实施例所提供的定量测定大麦种子活力的方法，下面将结合具体实施例进行描述。

实施例1

配制TTF标准溶液(1g/L)，将标准溶液依次稀释到100、80、60、40、20和10mg/L，用分光光度计测定不同浓度的TTF溶液在484nm下的吸光值，建立如图1所示的不同浓度TTF溶液与对应吸光值的标准曲线，并计算线性回归方程，得到回归方程为y＝0.0158x+0.0047。

随机选取50粒大麦样品，并用3％的过氧化氢溶液洗涤5min，随后用去离子水洗涤样品去除残留的过氧化氢，最后加入2mL去离子水，使大麦充分浸泡于水中，避光20℃保存6h，活化大麦内部的脱氢酶活性。

将活化好的大麦样本用吸水滤纸充分吸干水分，随机挑选10粒大麦，用解剖刀沿大麦纵轴切割分离，再将麦胚部位切割分离放入2mL离心管中，加入1mL新鲜配制的1％TTC染液(用25％TTC母液稀释25倍后使用)，避光于37℃恒温水浴中染色3h，染色后8000rpm离心3min，吸取去除染色液，再用去离子水反复洗涤2次，吸干残余的去离子水，将染色好的大麦样品冻存于-20℃低温冰箱中待用，重复3次试验(共选择10*3粒大麦)。

将冷冻好的染色大麦样品迅速放入预冷好的冻干机中，冻干16h左右取出，每个2mL离心管中放入直径1cm的钢珠，用震荡粉碎机对大麦样品进行震荡粉碎1min，震荡参数为1200strokes/min，震荡完毕后8000rpm离心10min并取出钢珠，粉碎后的大麦样品进行下一步实验。

向粉碎后的大麦样品中加入2mL 10％TCA甲醇溶液(100％TCA母液用甲醇稀释10倍后使用)，于恒温震荡金属浴中萃取2-3min，萃取参数为20℃，750rpm，萃取后的溶液15000rpm离心10min，小心吸出上清溶液，加入新的2mL离心管中。

测量上述步骤得到的上清溶液在484nm下的吸光值，以萃取溶液(10％TCA甲醇)作为空白对照，测定样品稀释3倍后的吸光值，重复测试3次，经过TTF浓度公式计算TTF平均浓度，将其换算得到单位数量大麦种子中TTF的质量。

实施例2

定量测定大麦种子活力的方法同实施例1，不同之处在于四氮唑染液的浓度为0.2％。

实施例3

定量测定大麦种子活力的方法同实施例1，不同之处在于四氮唑染液的浓度为0.5％。

实施例4

定量测定大麦种子活力的方法同实施例1，不同之处在于染色温度为20℃。

实施例5

定量测定大麦种子活力的方法同实施例1，不同之处在于萃取温度为30℃。

对比例1

定量测定大麦种子活力的方法同实施例1，不同之处在于采用液氮研磨方法对大麦种子进行粉碎处理。

对比例2

定量测定大麦种子活力的方法同实施例1，不同之处在于未对大麦种子进行解剖处理。

性能测试

1、TTF浓度结果

表1实施例1-5及对比例1-2测得的TTF浓度结果

由表1实验结果可以发现，实施例1-5萃取得到的TTF的浓度高于对比例1-2萃取得到的TTF的浓度，即采用冻干结合球磨粉碎的处理方法减少了样品损失，提高了TTF的萃取效率。

2、大麦萌发率测试

结合图2-图6所示的不同实施例中三苯甲臢-大麦萌发率曲线，计算得到大麦种子72h的萌发率，经过平板发芽实验计数测定大麦种子72h的实际萌发率，萌发率实验结果见表2。

表2萌发率实验结果

由上述实验结果可以发现，以实施例1-5定量测定的大麦种子的萌发率与传统平板萌发实验测定的大麦种子的萌发率非常接近，即该方法可以替代传统的平板萌发实验对大麦的萌发潜力进行快速准确的评定。

3、实验时间及同时处理样品量

表3实施例1与对比例1样品处理时间及处理量

实施例	粉碎时间/次	同时粉碎样品量	单位样品粉碎时间
				实施例1	1min	80	8s
对比例1	8-10min	1	8-10min

由表3所示实验结果可以发现，相比于对比例1采用液氮研磨方法对大麦种子进行粉碎处理，实施例1采用冻干结合球磨粉碎的处理手段极大地提高了处理效率。

4、萃取溶剂需求量

表4实施例1与对比例1溶剂用量

由上述实验结果可以发现，实施例1由于对大麦样品进行了解剖处理，去除了大部分不具有活性的胚乳，只保留了种子中具有活性的胚组织，大大减少了无用物质对后续实验的干扰，同时缩小了实验的反应体积，节省了实验成本和工作量。

Claims (9)

1.一种定量测定大麦种子活力的方法，其特征在于，包括以下步骤:

将低温保存在反应管中的采用四氮唑染液染色好的大麦种子充分冻干，球磨粉碎，离心，得到粉碎后的大麦种子；

向上述装有粉碎后的大麦种子的反应管中加入甲醇稀释的三氯乙酸溶液，充分萃取后，离心，取上清液，得到含有三苯甲臢的上清液；

测定上述上清液在484nm下的吸光值，以甲醇稀释的三氯乙酸溶液作为空白对照，根据三苯甲臢标准曲线计算对应吸光值下的三苯甲臢浓度，定量测定大麦种子的活力。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述染色好的大麦种子由以下方法得到:

将活化好的大麦种子进行解剖，去除胚乳，采用四氮唑染液对解剖后的大麦种子进行染色，充分染色后，去除染色液，用去离子水洗涤大麦种子，吸干残余的去离子水，-20℃保存染色好的大麦种子。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述活化好的大麦种子通过以下方法得到：

将大麦种子用2-3％的过氧化氢溶液洗涤，随后用去离子水洗涤，最后加入去离子水充分浸泡，得到活化好的大麦种子。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述四氮唑染液的浓度为0.2-1％。

5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述活化好的大麦种子在20-37℃恒温下进行染色。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述甲醇稀释的三氯乙酸溶液由以下方法得到：

向100％的三氯乙酸母液中加入甲醇稀释10倍，得到质量分数为10％的三氯乙酸甲醇溶液。

7.根据权利要求1或6所述的方法，其特征在于，所述大麦种子与10％的三氯乙酸甲醇溶液的加入比例为10粒大麦种子对应2mL 10％的三氯乙酸甲醇溶液。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述粉碎后的大麦种子于恒温震荡中进行充分萃取，萃取温度为20-40℃。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述三苯甲臢标准曲线由以下方法得到：

配制三苯甲臢标准溶液，用标准溶液依次稀释配制不同浓度的三苯甲臢溶液，测量不同浓度的三苯甲臢溶液在484nm下的吸光值，建立三苯甲臢吸光值与对应浓度的标准曲线。