CN106397382A - 板栗壳中原花青素的提取工艺优化方法及提取方法 - Google Patents

板栗壳中原花青素的提取工艺优化方法及提取方法 Download PDF

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杨芳
苏云霞
周霁
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Abstract

本发明提供一种板栗壳中原花青素的提取工艺优化方法及提取方法，该方法包括以下步骤：将板栗壳粉碎并干燥，采用恒温水浴振荡进行提取，考察提取时间、提取温度、乙醇浓度及料液比四因素对原花青素提取效果的影响，根据单因素试验结果来确定响应面设计的三因素三水平，最后以原花青素得率为指标优选出的最佳提取工艺为：提取液乙醇溶液的体积分数为70％、提取时间90min、提取温度65℃、料液比1g:15mL，该工艺原花青素得率>3％，纯度>55％。本发明方法根据单因素实验结果利用design expert软件设计响应面优化法，整个实验体系比较完善可靠，并且将废弃的板栗壳重新利用，解决了环境污染问题，提取液用量少经济环保。

Description

板栗壳中原花青素的提取工艺优化方法及提取方法
技术领域
本发明涉及板栗壳中原花青素的提取工艺优化方法及提取方法，属于天然药物中有效成分提取技术领域。
背景技术
板栗在我国有非常广泛的种植，其产量位居世界第一，达到全世界板栗产量的60％以上。板栗壳是板栗加工中的废弃物，随着近年来板栗种植规模的不断扩大和加工技术的不断革新，对板栗的需求日益增加，导致大量板栗壳的随意丢弃，其造成的环境污染问题日益严重。因此通过深入研究和开发板栗壳这一废弃资源，不但可以使其变废为宝，还能极大的解决环境污染问题。
板栗壳中含有原花青素，通过了解得知原花青素具有很多生物学作用，比如：具有极强的抗氧化性，可以消除超氧阴离子自由基、羟基自由基等一系列自由基；参与磷酸代谢和蛋白质磷酸化，防止脂质氧化；能够络合金属离子，在体内形成惰性化合物；保护维生素C，防止其降解，利于维生素C在体内的吸收和利用。现已证实，原花青素具有抗心肌、调血脂、抗衰老、改善老年记忆力和保护皮肤等多种功能。综上，开发出一种高效、简单、低成本的板栗壳原青花素提取工艺具有十分重大的意义。
发明内容
本发明的目的在于克服现有从板栗壳提取原青花素工艺中存在的效率不高、纯度低等问题，提供一种相应的提取工艺优化方法及提取方法，本发明方法通过对不同提取因素的分析对比得出了最佳的提取条件，解决了板栗壳污染环境和资源浪费的问题，并且开发了板栗的利用价值。本发明所采用的技术方案如下：
板栗壳中原花青素的提取工艺优化方法，包括以下步骤：(a)将板栗壳洗净并干燥，粉碎过筛备用；(b)将板栗壳粉置于乙醇溶液中恒温水浴振荡提取，离心得粗提取液，分别考察提取时间、提取温度、料液比、乙醇浓度对粗提取液中原花青素含量的影响；(c)以上述四因素为自变量、原花青素得率为因变量绘制图形，选出对原花青素提取工艺影响较大的因素和水平；(d)设计三因素三水平响应面实验，以原花青素的得率为指标优选出最佳的提取工艺。
按照上述方案，步骤(a)中板栗壳洗净后置于40℃干燥至恒重，粉碎后过40-60目的筛网备用。
按照上述方案，步骤(b)中提取时间考察范围为50-130min，提取温度考察范围为40-80℃，料液比考察范围为1g板栗壳粉对应10-35mL乙醇溶液，乙醇体积分数考察范围为40-80％，每考察一个因素时在对应的范围内分散选择至少4个点进行单因素提取实验。
按照上述方案，步骤(d)所述三因素为提取时间、提取温度和乙醇浓度，三水平分别为乙醇体积分数60％、70％、80％，提取温度50℃、65℃、80℃，提取时间60min、90min、120min，通过步骤(c)确定的最佳料液比为1g:15mL，共计17次试验后进行响应面分析，确定板栗壳提取原花青素较优工艺参数为：体积分数为70％的乙醇溶液、提取时间90min、提取温度65℃，料液比1g:15mL。
按照上述方案，测定粗提取液中原花青素含量包括首先采用硫酸-香草醛比色法绘制原花青素标准曲线，接着在500nm处用紫外可见分光光度计测出待测液的吸光度并与标准曲线进行对比得出原花青素浓度。
上述方案中，硫酸-香草醛比色法具体为将清液、浓度为30g/L的香草醛-甲醇溶液(将3g香草醛溶于100ml的甲醇中)、体积分数为30％的硫酸-甲醇溶液(将30ml的浓硫酸与70ml的甲醇混溶)按照1:5:5的体积比进行混合，在25℃反应20min。
本发明还提供一种板栗壳中原花青素的提取方法，包括以下步骤：首先将板栗壳洗净并在40℃干燥，粉碎过20-100目筛网备用；接着将板栗壳粉按照1g：15mL的比例与体积分数为70％的乙醇溶液混合，在65℃恒温水浴振荡提取90min，离心得粗提取液；最后将粗提取液置于45-55℃减压浓缩，冷冻干燥即得。
优选的，板栗壳粉碎后过40-60目筛网，减压浓缩温度为50℃。
本发明具有以下有益效果：(1)工艺简单易操作，有利于产业化应用，并且所选原料为废弃物板栗壳，不仅解决了环境污染问题，而且开发了板栗的利用价值；(2)目前从植物中提取原花青素是最经济最可靠的途径，本发明利用乙醇和水组成的混合液对板栗壳进行提取，发现原花青素在乙醇-水体系中的溶解度远大于在水中的溶解度，并且乙醇相比其他有机溶剂属于比较干净的能源，能够降低对环境的污染；(3)干燥方法主要是真空干燥、冷冻干燥、喷雾干燥，不同干燥处理方法对原花青素聚合度有很大影响，本发明采用冷冻干燥，冷冻干燥样品聚合度低于其他处理，而低聚合度原花青素抗氧化能力更强，此外冷冻干燥保留产品的生物和化学结构及其活性的完整性；(4)本发明研究四个单因素对原花青素提取的影响，根据单因素实验的结果利用design expert软件设计响应面优化法，整个实验体系比较完善且可靠。
附图说明
图1为本发明实施例1不同乙醇浓度与原花青素得率的关系图；
图2为本发明实施例1不同料液比与原花青素得率的关系图；
图3为本发明实施例1不同提取温度与原花青素得率的关系图；
图4为本发明实施例1不同提取时间与原花青素得率的关系图。
具体实施方式
为使本领域普通技术人员充分理解本发明的技术方案和有益效果，以下结合附图及具体实施例进行进一步说明。应当理解，此处所描述的实施例仅仅用于解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明采用乙醇溶剂恒温水浴振荡提取板栗壳中的原花青素，分别考察了提取时间、提取温度、乙醇浓度及料液比四因素对原花青素提取效果影响，以原花青素的得率(mg/g)为指标，根据单因素试验的结果来确定响应面设计的三因素三水平，最终优选出最佳提取工艺为：体积分数为70％的乙醇溶液、提取时间90min、提取温度65℃,料液比1g:15mL，该工艺原花青素得率>3％，纯度>55％。本发明所用的板栗壳来源于河南信阳，其它试剂或原料皆为市售，响应曲面法研究采用design expert软件进行。原花青素得率计算方法为：原花青素浓度乘以滤液稀释倍数乘以滤液体积得出原花青素质量，再除以板栗壳粉的质量即为原花青素得率。
实施例1
1.板栗壳的预处理
将板栗壳洗净并在40℃真空干燥至恒重，用高速粉碎机粉碎后过20-100目筛网备用。
2.不同乙醇浓度对原花青素提取效果的影响研究
称取5份板栗壳粉，每份2.5g，分别采用体积分数为40％、50％、60％、70％、80％的乙醇溶液按照料液比1g:15mL在60℃的条件下恒温水浴振荡提取95min后抽滤。取1mL滤液用水定容至10mL(滤液稀释10倍)备用；其他滤液离心得粗提取液，将粗提取液置于45-55℃减压浓缩，冷冻干燥称重。
硫酸-香草醛比色法测定原花青素含量：原花青素与硫酸-香草醛发生显色反应，在紫外可见分光光度计500nm处有最大吸收峰，硫酸-香草醛比色法具体操作为：取定容后的滤液0.5mL为样品，量取2.5mL浓度为3％的香草醛溶液(将3g香草醛溶于100ml的甲醇中)，量取2.5mL体积分数为30％的硫酸溶液(将30ml的浓硫酸与70ml的甲醇混溶)，将量好的香草醛溶液和硫酸溶液混合均匀再加入样品，摇匀，在25℃的条件下恒温水浴振荡反应20min，500nm处测出原花青素的吸光度，与标准曲线进行对比得出原花青素浓度。
原花青素浓度乘以滤液稀释倍数，再乘以滤液体积得出原花青素质量，最后除以板栗壳粉的质量即为原花青素得率。以原花青素得率为指标，比较原花青素得率与乙醇体积分数的关系，确定最佳乙醇提取剂体积分数，结果如图1所示。从图中可知，随着乙醇浓度增大，原花青素得率相应增加，乙醇体积分数为70％时提取量最高；当乙醇体积分数大于70％时，原花青素得率有所下降。因此，确定提取原花青素最佳乙醇浓度选择响应面参考范围为60-80％。
3.不同料液比对原花青素提取效果的影响研究
称取5份板栗壳粉，每份2.5g，分别采用料液比为1g:10mL、1g:15mL、1g:20mL、1g:25mL，体积分数为68％的乙醇溶液在60℃的条件下恒温水浴振荡提取95min后抽滤。取1ml滤液用水定容至10ml备用，其他滤液离心得粗提取液，将粗提取液置于45-55℃减压浓缩，冷冻干燥称重。
采用同样的硫酸-香草醛比色法测定滤液中原花青素的含量，以原花青素得率为指标，比较原花青素得率与料液比的关系，结果如图2所示。从图中可知，原花青素得率随着液料比的增大而增大，但液料比为1g∶25mL和1g∶20mL与液料比为1g∶15mL相比，原花青素的得率变化不大。为节省提取溶剂的用量、降低成本，最终选择1g∶15mL的料液比最为经济实用。
4.不同提取温度对原花青素提取效果的影响研究
称取5份板栗壳粉，每份2.5g，分别在40℃、50℃、60℃、70℃、80℃提取温度下采用体积分数为68％的乙醇溶液按照料液比为1g：15mL恒温水浴振荡提取95min后抽滤。取1ml滤液用水定容至10ml备用，其他滤液离心得粗提取液，将粗提取液置于45-55℃减压浓缩，冷冻干燥称重。
采用同样的硫酸-香草醛比色法测定滤液中原花青素的含量，以原花青素得率为指标，比较原花青素得率与温度的关系，结果如图3所示。从图中可知，温度升高能加快分子的运动速率，有利于提取溶剂进入板栗壳的内部，加快原花青素的溶出；但温度太高，原花青素不稳定，因此提取温度不宜过高。综合考虑最佳提取温度选择响应面参考范围50-80℃。
5.不同提取时间对原花青素提取效果的影响研究
称取6份板栗壳粉，每份2.5g，分别采用体积分数为68％的乙醇溶液按照料液比1g：15mL在60℃下恒温水浴振荡提取50min、65min、80min、95min、110min、130min。取1ml滤液用水定容至10ml备用，其他滤液离心得粗提取液，将粗提取液置于45-55℃减压浓缩，冷冻干燥称重。
采用同样的硫酸-香草醛比色法测定滤液中原花青素的含量，以原花青素得率为指标，比较原花青素得率与时间的关系，如图4所示。从图中可知，长时间加热提取可能会导致原花青素不稳定、得率下降。因此确定的最佳提取时间选择响应面参考范围60-120min。
6.响应面法优化原花青素提取工艺
根据前四个单因素实验结论可知，选取乙醇体积分数、温度和提取时间3个因素每个因素3水平，利用design expert软件根据中心组合实验设计原理，响应曲面法研究乙醇体积分数、提取温度和提取时间对原花青素提取率的影响。响应面因素水平如表1。
表1响应面因素水平及编码
采用三因素三水平共17个试验点的响应面分析试验，响应面分析试验设计如表2所示。
表2响应面分析试验设计及结果
利用design expert软件对表2的数据进行分析的结果如图3所示。
表3响应面试验结果分析表
由表3的结果可知：模型极显著，失拟项P＝0.0573>0.05，不显著，模型校正系数R2＝0.9742，说明该模型可以解释97.42％的试验，方程的拟合度较高。模型校正系数RAdj2＝0.9411，说明该模型能解释94.11％的响应值变化；离散系数CV表示实验的精确度，CV值越低，实验的可靠性越高，本实验的CV＝4.62％，说明实验操作可信。信噪比为15.112，远大于4，说明该模型拟合度和可信度均较高。由此可见，此模型可用于板栗壳原花青素提取条件的分析和预测。利用design expert软件，根据表1的数据，得出最佳提取原花青素工艺为：体积分数为70％的乙醇溶液、提取时间90min、提取温度65℃、料液比1g:15mL，采用该工艺原花青素得率>3％，纯度＞55％。
实施例2
一种从板栗壳中提取原花青素的方法，具体步骤如下：首先准确称取2.5g板栗壳并洗净，在40℃真空干燥至恒重，用高速粉碎机粉碎后过20-100目筛网备用。接着将板栗壳粉按照1g：15mL的比例与体积分数为70％的乙醇溶液混合，在65℃恒温水浴振荡提取90min，离心得粗提取液。最后将粗提取液置于45-55℃减压浓缩，冷冻干燥即得。
实施例3
一种从板栗壳中提取原花青素的方法，具体步骤如下：首先准确称取2.5g板栗壳并洗净，在40℃真空干燥至恒重，用高速粉碎机粉碎后过40-60目筛网备用。接着将板栗壳粉按照1g：15mL的比例与体积分数为70％的乙醇溶液混合，在65℃恒温水浴振荡提取90min，离心得粗提取液。最后将粗提取液置于50℃减压浓缩，冷冻干燥即得。

Claims (8)

1.板栗壳中原花青素的提取工艺优化方法，其特征在于，包括以下步骤：(a)将板栗壳洗净并干燥，粉碎过筛备用；(b)将板栗壳粉置于乙醇溶液中恒温水浴振荡提取，离心得粗提取液，分别考察提取时间、提取温度、料液比、乙醇浓度对粗提取液中原花青素含量的影响；(c)以上述四因素为自变量、原花青素得率为因变量绘制图形，选出对原花青素提取工艺影响较大的因素和水平；(d)设计三因素三水平响应面实验，以原花青素得率为指标优选出最佳的提取工艺。
2.如权利要求1所述板栗壳中原花青素的提取工艺优化方法，其特征在于：步骤(a)中板栗壳洗净后置于40℃干燥至恒重，接着粉碎后过40-60目的筛网备用。
3.如权利要求1所述板栗壳中原花青素的提取工艺优化方法，其特征在于：步骤(b)中提取时间考察范围为50-130min，提取温度考察范围为40-80℃，料液比考察范围为1g板栗壳粉对应10-35mL乙醇溶液，乙醇体积分数考察范围为40-80％，每考察一个因素时在对应的范围内分散选择至少4个点进行单因素提取实验。
4.如权利要求1所述板栗壳中原花青素的提取工艺优化方法，其特征在于：步骤(d)所述三因素为提取时间、提取温度和乙醇浓度，三水平分别为乙醇体积分数60％、70％、80％，提取温度50℃、65℃、80℃，提取时间60min、90min、120min，通过步骤(c)确定的最佳料液比为1g:15mL，共计17次试验后进行响应面分析，确定板栗壳提取原花青素较优工艺参数为体积分数70％的乙醇溶液、提取时间90min、提取温度65℃，料液比1g:15mL。
5.如权利要求1所述板栗壳中原花青素的提取工艺优化方法，其特征在于：测定粗提取液中原花青素含量包括首先采用硫酸-香草醛比色法绘制原花青素标准曲线，接着在500nm处用紫外可见分光光度计测出待测液的吸光度并与标准曲线进行对比得出原花青素浓度。
6.如权利要求5所述板栗壳中原花青素的提取工艺优化方法，其特征在于：硫酸-香草醛比色法具体为将清液、浓度为30g/L的香草醛-甲醇溶液、体积分数为30％的硫酸-甲醇溶液按照1:5:5的体积比进行混合，在25℃反应20min。
7.一种板栗壳中原花青素的提取方法，其特征在于，包括以下步骤：首先将板栗壳洗净并在40℃干燥，粉碎过20-100目筛网备用；接着将板栗壳粉按照1g：15mL的比例与体积分数为70％的乙醇溶液混合，在65℃恒温水浴振荡提取90min，离心得粗提取液；最后将粗提取液置于45-55℃减压浓缩，冷冻干燥即得。
8.如权利要求7所述板栗壳中原花青素的提取方法，其特征在于：板栗壳粉碎后过40-60目筛网，减压浓缩温度为50℃。
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