CN115634259A - 一种优化酶解超声提取和大孔树脂纯化总黄酮的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种优化酶解超声提取和大孔树脂纯化总黄酮的方法，包括以下具体步骤：S1：样本处理；S2：芦丁标准曲线绘制；S3：酶解超声提取总黄酮：选取不同品种的酶，并分别混合黄精叶粉末和乙醇溶液进行超声提取实验，提取液加入亚硝酸钠溶液、硝酸铝溶液和氢氧化钠，测定吸光度，计算总黄酮质量浓度，比较各项实验数据，借助响应面法分析并优化总黄酮的提取工艺；S4：大孔树脂纯化总黄酮：在S3后利用大孔树脂对总黄酮进行纯化，本发明公开的优化酶解超声提取和大孔树脂纯化总黄酮的方法具有利用酶辅助超声法确定提取多花黄精叶中总黄酮最大得率和利用大孔树脂纯化酶辅助超声提取的黄精叶总黄酮最佳纯度的效果。

Description

一种优化酶解超声提取和大孔树脂纯化总黄酮的方法

技术领域

本发明涉及大健康产品制备领域，尤其涉及一种优化酶解超声提取和大孔树脂纯化总黄酮的方法。

背景技术

黄酮是植物界中广泛存在的一大类以苯色酮环为基础的酚类化合物，是许多中草药的有效成分。天然来源的生物类黄酮分子量比较小，能够被人体迅速吸收，可以通过血脑屏障，进入脂肪组织，具有消除疲劳、保护血管、防动脉粥样硬化、降血糖、降血脂、扩张毛细血管、活化大脑细胞和其他脏器细胞的功能、抗衰老和抗菌作用等多种功效。

超声酶法协同提取多花黄精叶中总黄酮的原理是：酶可将植物组织分解，从而破坏细胞结构，使得细胞与溶剂之间的阻力减小，超声波提取是应用其空化效应和搅拌作用来破坏药材细胞,两者结合后共同作用可加速细胞内有效成分的释放和扩散,并提高成分提取率。因此，酶辅助超声法提取中药有效成分可减少溶剂用量，缩短提取时间，并提高药用成分的得率，大孔吸附树脂对黄酮的纯化取决于它的吸附性和分子筛性。吸附性的大小又取决于树脂的极性和黄酮的极性，分子筛性则取决于树脂本身的多孔性结构和黄酮的分子大小。加上大孔树脂性能稳定，不溶于酸碱和有机溶剂，对黄酮的选择性好，可以有效纯化总黄酮。

如何利用酶辅助超声法提取黄精总黄酮从而优化黄酮类物质的提取工艺，并利用大孔树脂纯化总黄酮成了我们需要考虑的问题。

发明内容

本发明公开一种优化酶解超声提取和大孔树脂纯化总黄酮的方法，旨在解决如何利用酶辅助超声法提取黄精总黄酮从而优化黄酮类物质的提取工艺，并利用大孔树脂纯化总黄酮的技术问题。

为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：

一种优化酶解超声提取的方法，包括以下具体步骤：

S1：样本处理：处理新鲜的黄精叶，并制成黄精叶粉末备用；

S2：芦丁标准曲线绘制：取芦丁标准溶液，并在添加辅料后测定吸光度，得到芦丁标准曲线；

S3：酶解超声提取总黄酮：选取不同品种的酶，并分别混合黄精叶粉末和乙醇溶液进行超声提取实验，提取液加入亚硝酸钠溶液、硝酸铝溶液和氢氧化钠，测定吸光度，计算总黄酮质量浓度，比较各项实验数据，借助响应面法分析并优化总黄酮的提取工艺。

通过采用酶辅助超声法提取黄精总黄酮，并结合黄酮类物质提取关键因素即酶解时间、乙醇浓度、料液比、超声功率等，借助响应面法优化黄酮类物质的最优提取工艺，通过得到的多元二次回归方程，并求解方程确定超声酶法协同提取多花黄精叶中总黄酮酶解的最佳工艺条件和最大得率。

在一个优选的方案中，所述S1中，样本处理包括以下步骤：

S11：预处理：将新鲜黄精叶清洗干净，于烘箱中60℃烘干，再置于粉碎机中粉碎；S12：初步处理：取300g黄精叶粉末用二氯甲烷做初步脱脂处理；S13：干燥滤渣：进行抽滤，并将滤渣收集放在通风位置干燥，待其中的二氯甲烷自然挥发后，放入烘箱烘烤至完全干燥；S14：装袋：待黄精叶粉末干燥后，装入密封袋备用。

多花黄精药食两用，根作为食用部位，供不应求，多花黄精叶中含有大量的总黄酮，但目前对于其中总黄酮研究很少，导致多黄黄精叶资源被白白丢弃，浪费严重，因此，我们通过深入研究黄精叶总黄酮的提取工艺，不仅增加多花黄精中总黄酮的得率，同时也提高了多花黄精叶的利用价值，也为后续的多花黄精叶的利用和进一步开发提供理论依据。

在一个优选的方案中，所述S3中，总黄酮提取包括以下具体步骤：

S31：酶选取：选取不同品种的酶各50mg，并采用溶剂溶解不同品种的酶，制成酶溶液进行S3中的实验，其中不同品种的酶为漆酶、纤维素酶和半纤维素酶；S32：称取粉末：称取处理过的黄精叶粉末1g；S33：配置乙醇溶液：以料液比1:25g/mL，配置25mL的80％的乙醇；S34：酶解：加入50mg的酶，静置酶解1h；S35：超声提取：在超声功率450W、温度40℃的情况下超声提取40min；S36：抽滤、量取滤液：进行抽滤，取滤液装入25mL容量瓶中；S37：样品溶液乙醇定容：用30％乙醇定容，待测定总黄酮用；S38：乙醇补充：吸取2mL样液于25mL容量瓶中，再用30％的乙醇补充至12.5mL；S39：添加辅料：加入0.6mL亚硝酸钠溶液轻微摇晃后静置五分钟，然后再滴加0.6mL的硝酸铝溶液轻微摇晃并静置五分钟，最后加入5mL的氢氧化钠；S310：乙醇定容：用30％乙醇定容至刻度线并静置15min；S311：测定吸光度：在500nm波长处测定吸光度；S312：计算总黄酮质量浓度：利用标准曲线回归方程计算总黄酮质量浓度；S313：比较实验数据：结合酶解时间、乙醇浓度、料液比、超声功率的数据，借助响应面法分析并优化总黄酮的提取工艺。

通过设置有利用多种酶进行实验，实验结果与理论拟合值偏差小，说明该模型能够精准的预测响应值，展现了响应面分析法作为一种多变量的复杂工艺过程优化的可靠性，本次试验设计了没有酶参与的多花黄精叶中总黄酮乙醇超声提取得率作为参照，还对漆酶、纤维素梅、半纤维素酶三种酶的对比试验，确定出三种酶中提取率相对最优的酶为半纤维素酶，半纤维素酶的辅助工艺是大多数植物中有效成分的主要提取步骤，对照传统超声提取方法能有效增加得率。

一种大孔树脂纯化总黄酮的方法，包括以下具体步骤：

S4：大孔树脂纯化总黄酮：在S3，对优化后的超声酶解工艺提取的总黄酮，利用大孔树脂进行纯化；

所述S4，大孔树脂纯化总黄酮包括以下具体步骤：

S41：树脂筛选：挑选七种不同型号的大孔树脂进行静态吸附解吸实验；S42：静态吸附解吸实验：测试静态环境下吸附解吸速率，并制作静态吸附速率曲线；S43：温度影响实验：测试温度对静态吸附和解吸效果的影响，选择20℃，30℃，40℃三个温度条件进行静态吸附解吸实验；S44：pH值影响实验：测试pH值对静态吸附和解吸效果的影响，选择pH为5，pH为7，pH为9三个梯度进行实验；S45：洗脱液浓度影响实验：测试洗脱液浓度对静态解吸效果的影响，选择乙醇作为洗脱液，测试不同体积分数的乙醇的洗脱效果；S46：上样体积影响实验：将上样液的浓度配置为2.0mg/mL，以10mL为一份收集流出液，测定黄酮含量；S47：上样浓度影响实验：将上样液配置成不同浓度进行上样，上样体积为2BV，收集流出液测定总黄酮含量，计算吸附率；S48：上样流速影响实验：将上样液以不同流速进行上样，收集流出液，测定总黄酮含量，计算吸附率；S49：洗脱液体积影响实验：选择乙醇作为洗脱液，选择60％，70％,80％,90％四个不同体积分数的乙醇进行洗脱实验；S410：洗脱液流速影响实验：将洗脱液以不同流速进行洗脱，收集流出液，测定总黄酮含量，计算吸附率，并结合其他数据得出最佳工艺条件。

通过优化酶超声提取的方法提高总黄酮提取效率后，通过从树脂筛选、静态吸附解吸实验、温度影响实验、pH值影响实验、洗脱液浓度影响实验、上样体积影响实验、上样浓度影响实验、上样流速影响实验、洗脱液体积影响实验和洗脱液流速影响实验等多个方面进行验证，从而得到了最佳工艺条件，证明了利用DM130大孔树脂对黄精叶总黄酮进行纯化的方法可行，从而进一步提高总黄酮的纯化率。

由上可知，一种优化酶解超声提取和大孔树脂纯化总黄酮的方法，包括以下具体步骤：S1：样本处理：处理新鲜的黄精叶，并制成黄精叶粉末备用；S2：芦丁标准曲线绘制：取芦丁标准溶液，并在添加辅料后测定吸光度，得到芦丁标准曲线；S3：酶解超声提取总黄酮：选取不同品种的酶，并分别混合黄精叶粉末和乙醇溶液进行超声提取实验，提取液加入亚硝酸钠溶液、硝酸铝溶液和氢氧化钠，测定吸光度，计算总黄酮质量浓度，比较各项实验数据，借助响应面法分析并优化总黄酮的提取工艺。本发明提供的优化酶解超声提取和大孔树脂纯化总黄酮的方法具有利用酶辅助超声法确定提取多花黄精叶中总黄酮最大得率和利用大孔树脂纯化酶辅助超声提取的黄精叶总黄酮最佳纯度的技术效果。

附图说明

图1为本发明提出的一种优化酶解超声提取和大孔树脂纯化总黄酮的方法的整体结构图。

图2为本发明提出的一种优化酶解超声提取的方法的样本处理流程图。

图3为本发明提出的一种优化酶解超声提取的方法的芦丁标准曲线测定流程图。

图4为本发明提出的一种优化酶解超声提取的方法的总黄酮提取流程图。

图5为本发明提出的一种优化酶解超声提取的方法的芦丁标准曲线图。

图6为本发明提出的一种优化酶解超声提取的方法的乙醇体积分数对多花黄精叶总黄酮得率的影响示意图。

图7为本发明提出的一种优化酶解超声提取的方法的酶用量对多花黄精叶总黄酮得率的影响示意图。

图8为本发明提出的一种优化酶解超声提取的方法的超声时间对多花黄精叶总黄酮得率的影响示意图。

图9为本发明提出的一种优化酶解超声提取的方法的料液比对多花黄精叶总黄酮得率的影响示意图。

图10为本发明提出的一种优化酶解超声提取的方法的超声功率对多花黄精叶总黄酮得率的影响示意图。

图11为本发明提出的一种优化酶解超声提取的方法的酶催化反应时间对多花黄精叶总黄酮得率的影响示意图。

图12为本发明提出的一种大孔树脂纯化总黄酮的方法的整体流程图。

图13为本发明提出的一种大孔树脂纯化总黄酮的方法的不同树脂吸附实验图。

图14为本发明提出的一种大孔树脂纯化总黄酮的方法的静态吸附速率曲线图。

图15为本发明提出的一种大孔树脂纯化总黄酮的方法的温度对静态吸附和解吸效果的影响数据图。

图16为本发明提出的一种大孔树脂纯化总黄酮的方法的pH值对静态吸附和解吸效果的影响数据图。

图17为本发明提出的一种大孔树脂纯化总黄酮的方法的洗脱液浓度对静态解吸效果的影响数据图。

图18为本发明提出的一种大孔树脂纯化总黄酮的方法的上样体积对静态解吸效果的影响数据图。

图19为本发明提出的一种大孔树脂纯化总黄酮的方法的上样浓度对静态解吸效果的影响数据图。

图20为本发明提出的一种大孔树脂纯化总黄酮的方法的上样流速对静态解吸效果的影响数据图。

图21为本发明提出的一种大孔树脂纯化总黄酮的方法的乙醇浓度对静态解吸效果的影响数据图。

图22为本发明提出的一种大孔树脂纯化总黄酮的方法的洗脱液流速对静态解吸效果的影响数据图。

图23为本发明提出的一种优化酶解超声提取和大孔树脂纯化总黄酮的方法的整体流程图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。

本发明公开的一种优化酶解超声提取和大孔树脂纯化总黄酮的方法主要应用于多花黄精叶黄酮提取的场景。

参照图1和图23，一种优化酶解超声提取的方法，包括以下具体步骤：S1：样本处理：处理新鲜的黄精叶，并制成黄精叶粉末备用；

S2：芦丁标准曲线绘制：取芦丁标准溶液，并在添加辅料后测定吸光度，得到芦丁标准曲线；S3：酶解超声提取总黄酮：选取不同品种的酶，并分别混合黄精叶粉末和乙醇溶液进行超声提取实验，提取液加入亚硝酸钠溶液、硝酸铝溶液和氢氧化钠，测定吸光度，计算总黄酮质量浓度，比较各项实验数据，借助响应面法分析并优化总黄酮的提取工艺，实验中设计了酶的用量、酶解时间、乙醇浓度、超声时间、超声功率以及料液比六个单因素实验，根据单因素实验结果，确定响应面分析的真实因子和水平范围，确定在超声时间、酶解时间、乙醇浓度和料液比的基础上设计BoxBehnken响应面分析方案，分为16个析因试验，8个星点试验和5个中心点试验，得到一个多元二次回归方程。

参照图2，在一个优选的实施方式中，S1中，样本处理包括以下步骤：S11：预处理：将新鲜黄精叶清洗干净，于烘箱中60℃烘干，再置于粉碎机中粉碎；S12：初步处理：取300g黄精叶粉末用二氯甲烷做初步脱脂处理；S13：干燥滤渣：进行抽滤，并将滤渣收集放在通风位置干燥，待其中的二氯甲烷自然挥发后，放入烘箱烘烤至完全干燥；S14：装袋：待黄精叶粉末干燥后，装入密封袋备用。

参照图2，在一个优选的实施方式中，S12中，初步处理的具体实施方式为将黄精叶与二氯甲烷以1:8-1:10m/V的比例混合，振荡混合后静置2小时以上，再超声50分钟。

参照图3和图5，在一个优选的实施方式中，S2中，芦丁标准曲线测定包括以下具体步骤：S21：制备芦丁标准溶液：分别取芦丁标准溶液1、2、4、6和8mL于5只25mL容量瓶中；S22：补充乙醇：用30％乙醇补充至约12.5mL；S23：加入辅料溶液：加入0.6mL亚硝酸钠溶液，摇匀并放置5min,再加入0.6mL硝酸铝溶液，摇匀并静置5min，后再加入5mL氢氧化钠溶液混匀；S24：标准溶液乙醇定容：用30％乙醇定容至刻度，摇匀；S25：标准曲线测定：检测混合溶液吸光度，并绘制出标准曲线。

参照图3，在一个优选的实施方式中，S25中，标准曲线测定的具体实施方式为：混合溶液放置15min后，在波长500nm处测定其吸光度，试剂空白为参比，平行实验三次，将测定的各溶液在500nm处吸光值设定为纵坐标，并以各溶液芦丁浓度为横坐标，绘制出标准曲线，其中求出回归方程为:y＝10.9063x+0.0091。

参照图4，在一个优选的实施方式中，S3中，总黄酮提取包括以下具体步骤：

S31：酶选取：选取不同品种的酶各50mg，并采用溶剂溶解不同品种的酶，制成酶溶液进行S3中的实验，其中不同品种的酶为漆酶、纤维素酶和半纤维素酶；S32：称取粉末：称取处理过的黄精叶粉末1g；S33：配置乙醇溶液：以料液比1:25g/mL，配置25mL的80％的乙醇；S34：酶解：加入50mg的酶，静置酶解1h；S35：超声提取：在超声功率450W、温度40℃的情况下超声提取40min；S36：抽滤、量取滤液：进行抽滤，取滤液装入25mL容量瓶中；S37：样品溶液乙醇定容：用30％乙醇定容，待测定总黄酮用。

参照图4，在一个优选的实施方式中，S3中，总黄酮提取包括以下具体步骤：

S38：乙醇补充：吸取2mL样液于25mL容量瓶中，再用30％的乙醇补充至12.5mL；S39：添加辅料：加入0.6mL亚硝酸钠溶液轻微摇晃后静置五分钟，然后再滴加0.6mL的硝酸铝溶液轻微摇晃并静置五分钟，最后加入5mL的氢氧化钠；S310：乙醇定容：用30％乙醇定容至刻度线并静置15min；S311：测定吸光度：在500nm波长处测定吸光度；S312：计算总黄酮质量浓度：利用标准曲线回归方程计算总黄酮质量浓度；S313：比较实验数据：结合酶解时间、乙醇浓度、料液比、超声功率的数据，借助响应面法分析并优化总黄酮的提取工艺。

参照图4，在一个优选的实施方式中，S312中，计算总黄酮质量浓度的具体计算方式为：利用y＝10.9063x+0.0091进行计算，式中，y为吸光度，x为黄酮质量浓度mg/mL，利用计算得出的总黄酮质量浓度，算出总黄酮得率，公式如下:T＝CVn/m，式中，T为总黄酮物质的得率mg/g，C为总黄酮质量浓度mg/mL，V为总黄酮提取液体积mL，m为样品质量g，n为稀释倍数。

实施例一：乙醇浓度对黄精叶粉末总黄酮得率的影响：

精密称取1g多花黄精叶粉末5份，分别加入体积分数50％、60％、70％、80％、90％的乙醇溶液，再加入配置好的酶溶液，固定料液比为1:25g/mL，在功率450W、温度40℃下超声提取40min，固定提取次数为1次，按“2.2.5”项下方法进行总黄酮得率测定，并进行重复试验，结果如图6所示；

由图6可得出，在乙醇体积分数50％-80％范围内，提取率随乙醇体积分数增加而增加，表明乙醇穿透多花黄精细胞的能力较强，对黄酮类成分有较好的溶解度，一般来说，体积分数越大溶解度越大，即提取率越大，在乙醇体积分数80％-90％范围内，提取率随乙醇浓度升高反而降低，即乙醇体积分数为80％时，总黄酮的提取效果最好，说明当乙醇体积分数再升高时，其他易溶于醇的杂质及亲脂性杂质的溶解开始增大，总黄酮得率开始减少，且浓度越高溶剂的沸点越低，溶剂的挥发性随之增大，因而选取乙醇浓度为80％左右。

实施例二：酶用量对黄精叶粉末总黄酮得率的影响：

精密称取1g多花黄精叶粉末5份，分别加入配置好的10mg、20mg、30mg、40mg、50mg、60mg的酶溶液，再加入体积分数80％的乙醇溶液，固定料液比为1:25g/mL，在功率450W、温度40℃下超声提取40min，固定提取次数为1次，按“2.2.5”项下方法进行总黄酮得率测定，并进行重复试验，结果如图7所示；

由图7可得出，随着酶用量的不断增加，黄精叶中总黄酮的提取呈现处先快速上升、然后再下降的趋势，当酶用量为50mg时，总黄酮的得率最高，快速上升可能是半纤维素酶能破坏细胞结构，超声的空化能促进细胞壁的破碎，二者共同促进了黄酮的释放，提高了提取率，当酶用量再升高时，总黄酮得率开始减少，可能是因为随着酶剂量增加，酶的作用达到高峰值，总黄酮得率并没有再随着半纤维素酶添加量增加而提升，但透光率却因为过多的半纤维素酶分解其他物质而导致杂质增多，通光效果下降；或总黄酮的溶出率逐渐增加，但是过多的酶具有黏附性能，阻塞了黄酮的溶出通道，因此其得率有所下降，因此再继续添加量，只能增加使用的成本和使总黄酮提取量下降，因而选取酶用量为50mg左右。

实施例三：超声时间对黄精叶粉末总黄酮得率的影响：

精密称取1g多花黄精叶粉末5份，加入体积分数80％的乙醇溶液，再加入配置好的酶溶液，固定料液比为1:25(g/mL)，在功率450W、温度40℃下分别超声溶解10、20、30、40、50min，固定提取次数为1次，按“2.2.5”项下方法进行总黄酮得率测定，并进行重复试验，结果如图8所示；

由图8可得出，在超声时间10min-40min内，随着超声时间的不断增加，多花黄精叶中总黄酮的得率呈现上升趋势，在超声时间40min-50min内，随着超声时间的不断增加，黄精叶中总黄酮的得率反而呈现下降趋势，因此确定当超声时间为40min时，总黄酮的提取效果最好，当超声时间继续升高，总黄酮得率由增加变为减少时，表明一定时间内的超声处理使得细胞壁的破坏加快，使总黄酮不断地快速溶出，而长时间的超声处理可能破坏细胞内黄酮类化合物的结构，不利于溶出，因而选取超声时间为40min左右。

实施例四：料液比对黄精叶粉末总黄酮得率的影响：

料液比对黄精叶粉末总黄酮得率的影响精密称取1g多花黄精叶粉末5份，料液比分别为1:10、1:15、1:20、1:25、1:30g/mL，加入体积分数80％的乙醇溶液，再加入配置好的酶溶液，在功率450W、温度40℃下超声提取40min，固定提取次数为1次，按“2.2.5”项下方法进行总黄酮得率测定，并进行重复试验，结果如图9所示；

由图9可得出，随着料液比的不断增加，多花黄精叶中总黄酮的提取呈现处先上升、然后再缓慢下降的趋势，当料液比为1:25g/mL时，总黄酮的提取效果最好，推测由于乙醇溶液用量不断增加，使得物料和溶剂的接触面积增大，黄酮类物质的溶出量变大，总黄酮提取率提高；但当料液比再升高时，总黄酮得率开始缓慢减少，说明料液比在1:25g/mL时有效成分提取已比较充分，由于物料被溶剂充分包裹，再继续增大乙醇溶液，可能会造成其他杂质溶出，最终导致总黄酮提取率下降，因而选取料液比为1:25g/mL。

实施例五：超声功率对黄精叶粉末总黄酮得率的影响：

精密称取1g多花黄精叶粉末5份，加入体积分数80％的乙醇溶液，再加入配置好的酶溶液，固定料液比为1:25g/mL，采用超声提取法在超声功率分别为300W、375W、450W、525W、600W超声溶解40min，固定提取次数为1次，按“2.2.5”项下方法进行总黄酮得率测定，并进行重复试验，结果如图10；

由图10可得出，超声功率在300W-375W之间，多花黄精叶中总黄酮的提取量随着功率的增加不断增加，在375W-600W之间，多花黄精叶中总黄酮的提取量随着功率的增加而不断降低，即当功率375W时，总黄酮的提取效果最好，因此当功率再升高时，总黄酮得率开始快速减少，表明较高功率的超声波会使溶质形成类似团状的小球，使得总黄酮无法从细胞中溶出，因而选取功率375W。

实施例六：酶催化反应时间对黄精叶粉末总黄酮得率的影响：

精密称取1g多花黄精叶粉末5份，料液比为1:25g/mL，加入体积分数80％的乙醇溶液，再加入配置好的酶溶液，分别反应30min、45min、60min、75min、90min，在功率375W、温度40℃下超声溶解40min，固定提取次数为1次，按“2.2.5”项下方法进行总黄酮得率测定，并进行重复试验，结果如图11；

由图11可得出，随着酶解时间的不断增加，多花黄精叶中总黄酮的提取呈现处先快速上升、然后再缓慢下降，最后趋于平稳的趋势。当酶解时间为60min时，总黄酮的提取效果最好，当酶解时间继续升高，总黄酮得率开始缓慢减少并趋于平稳，说明多花黄精叶中的总黄酮几乎完全溶出，继续延长酶解时间提取率不再增加,且时间过长容易导致黄酮类物质不稳定发生分解或者转化为其他物质，根据实验合理性判断，选取酶解时间为60min为宜。

参照图12-23，一种大孔树脂纯化总黄酮的方法，包括以下具体步骤：

S4：大孔树脂纯化总黄酮：在S3，对优化后的超声酶解工艺提取的总黄酮，利用大孔树脂进行纯化；

所述S4，大孔树脂纯化总黄酮包括以下具体步骤：

S41：树脂筛选：挑选七种不同型号的大孔树脂进行静态吸附解吸实验；

S42：静态吸附解吸实验：测试静态环境下吸附解吸速率，并制作静态吸附速率曲线；

S43：温度影响实验：测试温度对静态吸附和解吸效果的影响，选择20℃，30℃，40℃三个温度条件进行静态吸附解吸实验；

S44：pH值影响实验：测试pH值对静态吸附和解吸效果的影响，选择pH为5，pH为7，pH为9三个梯度进行实验；

S45：洗脱液浓度影响实验：测试洗脱液浓度对静态解吸效果的影响，选择乙醇作为洗脱液，测试不同体积分数的乙醇的洗脱效果。

参照图12-23，在一个优选的实施方式中，包括以下具体步骤：

S46：上样体积影响实验：将上样液的浓度配置为2.0mg/mL，以10mL为一份收集流出液，测定黄酮含量；

S47：上样浓度影响实验：将上样液配置成不同浓度进行上样，上样体积为2BV，收集流出液测定总黄酮含量，计算吸附率；

S48：上样流速影响实验：将上样液以不同流速进行上样，收集流出液，测定总黄酮含量，计算吸附率；

S49：洗脱液体积影响实验：选择乙醇作为洗脱液，选择60％，70％,80％,90％四个不同体积分数的乙醇进行洗脱实验；

S410：洗脱液流速影响实验：将洗脱液以不同流速进行洗脱，收集流出液，测定总黄酮含量，计算吸附率，并结合其他数据得出最佳工艺条件。

实施例七：

挑选七种不同型号的大孔树脂进行静态吸附解吸实验，从图13中可以看出，DM130树脂的吸附和解吸效果最好，后续实验将采用DM130型号的树脂进行；

静态吸附速率曲线制作：

由图14中可以看出，随着时间的增加，吸附率先迅速上升然后逐渐趋于平稳，在前120min，大孔树脂对黄精叶总黄酮的吸附量随着吸附时间的延长而迅速增加，在120-360min，大孔树脂对黄精叶总黄酮的吸附量增速放缓，在360min-720min，大孔树脂对黄精叶总黄酮的吸附量逐渐趋于平衡，综上分析可知，DM130树脂对黄精叶总黄酮具有较好的吸附效果，并在前期吸附速度较快，考虑到时间成本，吸附时间选择6h较好；

测试温度对静态吸附和解吸效果的影响：

选择20℃，30℃，40℃三个温度条件进行静态吸附解吸实验，由图15可知，三个温度条件下的吸附和解吸效果相差不大，相较之下，温度为30℃时吸附和解吸效果最好，因此，后续实验将温度定为30℃；

测试pH值对静态吸附和解吸效果的影响：

吸附液的pH值对吸附和解吸效果的影响不同，选择pH为5，pH为7，pH为9三个梯度进行实验，由图16可知，不同pH值条件下，吸附和解吸效果相差较大，在中性条件下吸附和解吸效果最好，酸性条件次之，碱性条件下最差，因此，后续实验将吸附液的pH定为7；

测试洗脱液浓度对静态解吸效果的影响：

选择乙醇作为洗脱液，不同体积分数的乙醇洗脱效果不同，选择60％，70％,80％,90％四个不同体积分数的乙醇进行洗脱实验，由图17可知，随着乙醇浓度的增加，解析率先上升后下降，在浓度为80％时洗脱效果最好，因此，后续实验将洗脱液的浓度定为80％；

测试上样体积的影响：

将上样液的浓度配置为2.0mg/mL，以10mL为一份收集流出液，测定黄酮含量，当流出液浓度达到上样液浓度的十分之一时达到泄漏点，由图18可知，在第6份流出液中黄酮含量为0.19mg/mL，基本达到上样液浓度的10％，因此，认为上样液体积为60mL,即2BV时达到最佳上样量；

测试上样浓度的影响：

将上样液配置成不同浓度进行上样，上样体积为2BV，收集流出液测定总黄酮含量，计算吸附率，由图19可知，随着上样液浓度的增加，大孔树脂对黄精叶总黄酮的吸附率逐渐降低，当浓度由2mg/mL增加值2.5mg/mL时，吸附率明显下降，因此，考虑到工作效率，选择上样液浓度为2mg/mL；

测试上样流速的影响：

将上样液以不同流速进行上样，收集流出液，测定总黄酮含量，计算吸附率，由图20可知，随着流速的增加，吸附率逐渐降低，流速由1mL/min增加至2mL/min时，吸附率下降趋势较为平缓，当流速由2mL/min增加至3mL/min时，吸附率下降趋势明显，考虑到实际应用中的工作效率，选择上样流速为2mL/min；

测试动态洗脱液体积分数的影响：

选择乙醇作为洗脱液，不同体积分数的乙醇洗脱效果不同，选择60％，70％,80％,90％四个不同体积分数的乙醇进行洗脱实验，由图21可知，随着乙醇浓度的增加，解吸率先上升后下降，在浓度为80％时洗脱效果最好，因此，后续实验将洗脱液的浓度定为80％；

测试洗脱液流速的影响：

将洗脱液以不同流速进行洗脱，收集流出液，测定总黄酮含量，计算吸附率，由图22可知，流速由1mL/min增加至2mL/min时，解吸率呈先上升后下降的趋势，但过程较为平缓，当流速由2mL/min增加至3mL/min时，解吸率下降趋势明显，考虑到实际应用中的工作效率，选择洗脱液流速为2mL/min，根据静态和动态单因素实验结果，确定纯化黄精叶总黄酮的最佳工艺条件为：选用DM130树脂，上样时，上样液浓度为2mg/mL，pH值为7，上样体积为2BV，上样流速为2mL/min，洗脱时，先用30％的乙醇除杂，后选择浓度为80％的乙醇进行洗脱，流速为2mL/min，在此工艺条件下，黄精叶总黄酮的质量分数由4.7％提高到38.5％，纯度提升了8.2倍，证明利用DM130大孔树脂对黄精叶总黄酮进行纯化的方法可行。

工作原理：通过采用酶辅助超声法提取黄精总黄酮，并结合黄酮类物质提取关键因素即酶解时间、乙醇浓度、料液比、超声功率等，借助响应面法优化黄酮类物质的最优提取工艺，通过得到的多元二次回归方程，并求解方程确定超声酶法协同提取多花黄精叶中总黄酮酶解的最佳工艺条件和最大得率，通过优化酶超声提取的方法提高总黄酮提取效率后，通过从树脂筛选、静态吸附解吸实验、温度影响实验、pH值影响实验、洗脱液浓度影响实验、上样体积影响实验、上样浓度影响实验、上样流速影响实验、洗脱液体积影响实验和洗脱液流速影响实验等优化总黄酮纯化工艺,进一步显著提高总黄酮纯度。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种优化酶解超声提取的方法，其特征在于，包括以下具体步骤：

S1：样本处理：处理新鲜的黄精叶，并制成黄精叶粉末备用；

S2：芦丁标准曲线绘制：取芦丁标准溶液，并在添加辅料后测定吸光度，得到芦丁标准曲线；

S3：酶解超声提取总黄酮：选取不同品种的酶，并分别混合黄精叶粉末和乙醇溶液进行超声提取实验，提取液加入亚硝酸钠溶液、硝酸铝溶液和氢氧化钠，测定吸光度，计算总黄酮质量浓度，比较各项实验数据，借助响应面法分析并优化总黄酮的提取工艺。

2.根据权利要求1所述的一种优化酶解超声提取的方法，其特征在于，所述S1中，样本处理包括以下步骤：

S11：预处理：将新鲜黄精叶清洗干净，于烘箱中60℃烘干，再置于粉碎机中粉碎；

S12：初步处理：取300g黄精叶粉末用二氯甲烷做初步脱脂处理；

S13：干燥滤渣：进行抽滤，并将滤渣收集放在通风位置干燥，待其中的二氯甲烷自然挥发后，放入烘箱烘烤至完全干燥；

S14：装袋：待黄精叶粉末干燥后，装入密封袋备用。

3.根据权利要求2所述的一种优化酶解超声提取的方法，其特征在于，所述S12中，初步处理的具体实施方式为将黄精叶与二氯甲烷以1:8-1:10m/V的比例混合，振荡混合后静置2小时以上，再超声50分钟。

4.根据权利要求1所述的一种优化酶解超声提取的方法，其特征在于，所述S2中，芦丁标准曲线测定包括以下具体步骤：

S21：制备芦丁标准溶液：分别取芦丁标准溶液1、2、4、6和8mL于5只25mL容量瓶中；

S22：补充乙醇：用30％乙醇补充至约12.5mL；

S23：加入辅料溶液：加入0.6mL亚硝酸钠溶液，摇匀并放置5min,再加入0.6mL硝酸铝溶液，摇匀并静置5min，后再加入5mL氢氧化钠溶液混匀；

S24：标准溶液乙醇定容：用30％乙醇定容至刻度，摇匀；

S25：标准曲线测定：检测混合溶液吸光度，并绘制出标准曲线。

5.根据权利要求4所述的一种优化酶解超声提取的方法，其特征在于，所述S25中，标准曲线测定的具体实施方式为：混合溶液放置15min后，在波长500nm处测定其吸光度，试剂空白为参比，平行实验三次，将测定的各溶液在500nm处吸光值设定为纵坐标，并以各溶液芦丁浓度为横坐标，绘制出标准曲线，其中求出回归方程为:y＝10.9063x+0.0091。

6.根据权利要求1所述的一种优化酶解超声提取的方法，其特征在于，所述S3中，总黄酮提取包括以下具体步骤：

S31：酶选取：选取不同品种的酶各50mg，并采用溶剂溶解不同品种的酶，制成酶溶液进行S3中的实验，其中不同品种的酶为漆酶、纤维素酶和半纤维素酶；

S32：称取粉末：称取处理过的黄精叶粉末1g；

S33：配置乙醇溶液：以料液比1:25g/mL，配置25mL的80％的乙醇；

S34：酶解：加入50mg的酶，静置酶解1h；

S35：超声提取：在超声功率450W、温度40℃的情况下超声提取40min；

S36：抽滤、量取滤液：进行抽滤，取滤液装入25mL容量瓶中；

S37：样品溶液乙醇定容：用30％乙醇定容，待测定总黄酮用。

7.根据权利要求6所述的一种优化酶解超声提取的方法，其特征在于，所述S3中，总黄酮提取包括以下具体步骤：

S38：乙醇补充：吸取2mL样液于25mL容量瓶中，再用30％的乙醇补充至12.5mL；

S39：添加辅料：加入0.6mL亚硝酸钠溶液轻微摇晃后静置五分钟，然后再滴加0.6mL的硝酸铝溶液轻微摇晃并静置五分钟，最后加入5mL的氢氧化钠；

S310：乙醇定容：用30％乙醇定容至刻度线并静置15min；

S311：测定吸光度：在500nm波长处测定吸光度；

S312：计算总黄酮质量浓度：利用标准曲线回归方程计算总黄酮质量浓度；

S313：比较实验数据：结合酶解时间、乙醇浓度、料液比、超声功率的数据，借助响应面法分析并优化总黄酮的提取工艺。

8.根据权利要求7所述的一种优化酶解超声提取的方法，其特征在于，所述S312中，计算总黄酮质量浓度的具体计算方式为：利用y＝10.9063x+0.0091进行计算，式中，y为吸光度，x为黄酮质量浓度mg/mL，利用计算得出的总黄酮质量浓度，算出总黄酮得率，公式如下:T＝CVn/m，式中，T为总黄酮物质的得率mg/g，C为总黄酮质量浓度mg/mL，V为总黄酮提取液体积mL，m为样品质量g，n为稀释倍数。

9.一种大孔树脂纯化总黄酮的方法，应用于权利要求1所述的一种优化酶解超声提取的方法，其特征在于，包括以下具体步骤：

S4：大孔树脂纯化总黄酮：在S3，对优化后的超声酶解工艺提取的总黄酮，利用大孔树脂进行纯化；

所述S4，大孔树脂纯化总黄酮包括以下具体步骤：

S41：树脂筛选：挑选七种不同型号的大孔树脂进行静态吸附解吸实验；

S42：静态吸附解吸实验：测试静态环境下吸附解吸速率，并制作静态吸附速率曲线；

S43：温度影响实验：测试温度对静态吸附和解吸效果的影响，选择20℃，30℃，40℃三个温度条件进行静态吸附解吸实验；

S44：pH值影响实验：测试pH值对静态吸附和解吸效果的影响，选择pH为5，pH为7，pH为9三个梯度进行实验；

S45：洗脱液浓度影响实验：测试洗脱液浓度对静态解吸效果的影响，选择乙醇作为洗脱液，测试不同体积分数的乙醇的洗脱效果。

10.根据权利要求9所述的一种大孔树脂纯化总黄酮的方法，其特征在于，包括以下具体步骤：

S46：上样体积影响实验：将上样液的浓度配置为2.0mg/mL，以10mL为一份收集流出液，测定黄酮含量；

S47：上样浓度影响实验：将上样液配置成不同浓度进行上样，上样体积为2BV，收集流出液测定总黄酮含量，计算吸附率；

S48：上样流速影响实验：将上样液以不同流速进行上样，收集流出液，测定总黄酮含量，计算吸附率；

S49：洗脱液体积影响实验：选择乙醇作为洗脱液，选择60％，70％,80％,90％四个不同体积分数的乙醇进行洗脱实验；

S410：洗脱液流速影响实验：将洗脱液以不同流速进行洗脱，收集流出液，测定总黄酮含量，计算吸附率，并结合其他数据得出最佳工艺条件。

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