CN103961381B - 一种负压沸腾提取制备低酸型银杏提取物的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种从银杏叶负压沸腾提取制备低酸型银杏提取物的方法。以经过粉碎后的银杏鲜叶或干叶为原料，用含水乙醇为提取溶剂，采用负压沸腾提取，提取液过滤后，先采用石英沙和微孔离心过滤进行预处理，滤过液用陶瓷膜和超滤膜分离纯化，将过超滤膜的溶液用纳滤膜浓缩，回收乙醇，浓缩液再经过大孔树脂纯化和脱酸树脂脱酚酸，通过负压微波喷雾干燥或真空冷冻干燥制备得到低酸型银杏提取物。采用该技术制得的银杏提取物酸值低，纯度高，银杏黄酮含量＞28％，内酯含量＞8％，银杏酸≤1ppm，可以成为工业上生产低酸型银杏提取物产品的一种新技术。

Description

一种负压沸腾提取制备低酸型银杏提取物的方法

技术领域

本发明涉及植物提取物技术领域，特别是涉及一种从银杏叶负压沸腾提取制备低酸型银杏提取物的方法。

背景技术

银杏树(Ginkgo Biloba L.)是活化石，是长寿的象征。银杏叶富含抗病的生物活性因子，如黄酮、内酯、聚戊烯醇、多糖、蛋白质等等，备受国际的重视。德国Schwabe公司利用溶剂萃取技术生产标准银杏叶提取物(GBE761)，主要活性物为黄酮和内酯，是治疗心脑血管疾病的畅销植物药。国际上银杏叶提取物(GBE)及制剂年销售额达65亿美元，一直位居美国草药市场销售前三位。银杏是我国重要的经济林树种，面积40万公顷，白果年产量3万吨，干叶20万吨，占世界资源70％以上，银杏产业链200亿元。其中EGB及其制剂EGB年产量1500吨，60％产品出口，年销售额达50亿元。

国外银杏叶提取物(EGB)的加工技术主要沿用德国Schwabe公司专利技术，采用丙酮提取、正已烷等非极性溶剂除脂，调PH沉淀离心，乙酸乙酸和正丁醇等有机溶剂反复萃取，生产标准银杏叶提取物(EGb761)，其中银杏黄酮＞24％，内酯＞6％，银杏酸小于5ppm。该工艺步骤多，有机溶剂耗量大，产品收率低于1％，成本昂贵。国内早期GBE生产大多采用50％-80％醇水热回流提取，回收乙醇溶剂，再通过聚酰胺树脂吸附黄酮，收率1％左右，黄酮含量在16％-28％，但产品中内酯损失，银杏酸＞200ppm。随后国内EGB的工艺作了创新，采用酸水提取或高浓度乙醇回流提取，再用大孔树脂吸附，EGB收率提高2％-3％，成本明显降低，但质量明显下降，黄酮含量在16％-22％，内酯含量4％-6％，因此，一些企业用芦丁掺假。在银杏叶脱烷基酚酸工艺上，国内采用氯仿、正已烷等溶剂反复萃取，黄酮苷元有损失，并且有害溶剂残留。

银杏叶黄酮和萜内酯为热敏性活性物，在光、热和酶作用下容易分解，产生次生代谢产物。国内银杏叶提取物生产企业大多采用传统的热回流提取，如浸热式和渗漉式为主，生产工艺存在最突出的问题是：时间长，提取效率低；对于黄酮和萜内酯产生破坏较多；提取液质量不高，黄酮和内酯含量低，杂质多，造成后续工艺提纯复杂，如浓缩、醇沉、水沉、过滤、离心、吸附等，从而造成了生产周期长，能耗和成本大大上升，且资源浪费严重。

CN200910154390.7公开了一种用乙醇水溶液热回流提取和用大孔树脂纯化制备银杏提取物的方法，以银杏叶为原料，先以50-70％的乙醇溶液提取，提取液离心后进行两次上大孔树脂解析，解吸液回收酒精浓缩成稠膏，真空干燥即得银杏提取物，所得银杏提取物中总黄酮含量为25％，总内酯为6％，银杏酸小于5ppm。该方法所得的银杏提取物纯度相对较高，银杏酸含量较低，但是采用两次上柱解析，产品的得率相对较低，且生产成本会比较高。

CN201110179948.4提出一种以硅胶柱分离纯化制备低酚酸银杏提取物的方法，该方法以粗银杏提取物为原料，上硅胶柱，然后用甲醇-石油醚-乙酸乙酯溶液进行洗脱。该方法所用的甲醇和乙酸乙酯对人体伤害大，石油醚属于易燃易爆品，安全性低，不适合工业化生产。

CN200710191922.5公开一种银杏提取物的制备方法，以市售银杏提取物为原料，先用石油醚脱酸，乙酸乙酯提内酯，乙酸乙酯部位用丙酮溶解过氧化铝柱精制处理得内酯；不溶于乙酸乙酯部位分别用大孔树脂和聚酰胺树脂进行纯化得到黄酮。该方法所得银杏提取物纯度高，总黄酮为29％，总内酯为8％，银杏酸小于1ppm。但该方法耗时比较长，操作繁琐，且使用大量有机溶剂，对人体伤害大，且生产成本太高。

CN03117443.4发明了一种用丙酮水溶液热回流提取和用离子交换树脂纯化制备高含量银杏提取物的方法，以银杏叶为原料，先以60％的丙酮溶液提取，提取液离心后上离子交换树脂，然后用丙酮和乙酸乙酯等有机溶剂进行解析，解吸液回收有机溶剂后干燥即得银杏提取物，所得银杏提取物纯度高，总黄酮含量为30％，总内酯为12％。但该方法生产成本高，产品得率低，且使用大量有毒的有机溶剂，不适合工业化生产。

针对以上发明的不足，本发明提出采用负压沸腾法提取银杏叶中有效成分，提取液先用石英沙和微孔离心过滤进行预处理，然后再通过陶瓷膜、有机超滤膜、大孔树脂纯化和脱酸树脂脱酚酸得到低酸值的银杏提取物。减压提取技术提取银杏叶中热敏性成分，在负压状态下使得提取溶剂在较低的温度下沸腾，使有效成分得以较快的溶出，不仅提取温度低、提取效率高，而且节约能源；采用石英沙和微孔离心过滤对提取液进行预处理，可有效保护膜和树脂，延长其使用寿命；膜和树脂集成分离纯化银杏叶中有效成分，使用溶剂少，安全无毒，工艺操作简单，所使用的溶剂和大孔树脂均可重复利用，生产成本低，生产的银杏提取物纯度高，银杏黄酮＞28％，内酯＞8％，且银杏酸含量低，银杏酸≤1ppm。可以成为工业上生产低酸值银杏提取物产品的一种新技术。

发明内容

本发明的目的在于提供一种从银杏叶负压沸腾提取制备低酸型银杏提取物的方法，该方法操作简单，生产成本低，所得的银杏提取物产品纯度高，酸值低，适合工业化生产。

本发明是通过以下技术方案实现的。

一种负压沸腾提取制备低酸型银杏提取物的方法，具体步骤如下：

(1)负压提取

将银杏鲜叶或银杏干叶粉碎至0.5cm以下，用40～80％乙醇为提取溶剂，负压沸腾提取30～90min，提取溶剂与银杏叶的比例为1～30∶1，提取温度为20～70℃，提取压力为0.01～0.09MPa，提取1～4次，过滤，合并提取液；

(2)提取液预处理

提取液先进行石英沙过滤，粒度为100～300目，然后进行微孔离心过滤，孔径为1.0μm～1.5μm，离心转速为3000～6000rpm；

(3)膜分离

将上述滤液通过0.1μm～0.8μm孔径的陶瓷膜，操作压力为0.15～0.3MPa，将陶瓷膜透过液继续通过截留相对分子质量为5000～50000的超滤膜，将超滤膜透过液用截留相对分子质量为100～300的纳滤膜进行浓缩，浓缩液减压回收乙醇，用酸调节浓缩液的pH值至4～6后得到上柱液；

(4)大孔树脂纯化

上柱液用大孔树脂吸附，先以水洗至无色，再以40％～90％乙醇溶液洗脱，洗脱剂用量为3～6倍的柱体积，收集乙醇洗脱部分；

(5)脱酸树脂脱酚酸

上述乙醇洗脱液再经过脱酸树脂吸附，流出液减压回收乙醇浓缩得到浓缩液；

(6)干燥

将上述浓缩液进行负压微波喷雾干燥或真空冷冻干燥，真空度0.05～0.10MPa，负压微波喷雾干燥进口温度160～195℃，出口温度60～85℃，微波干燥温度40～60℃，冷冻温度小于-35℃，干燥后得到低酸型银杏提取物，含水量小于5％，经HPLC分析，银杏黄酮＞28％，内酯＞8％，银杏酸≤1ppm。

本专利以银杏叶为原料，采用负压沸腾法提取银杏黄酮和内酯，负压沸腾提取为热回热、微波提取或超声波提取中一种，将银杏鲜叶或银杏干叶粉碎至0.5cm以下，用40～80％乙醇为提取溶剂，负压沸腾提取30～90min，优选45～60min，提取溶剂与银杏叶粉末的比例为1～30∶1，优选5～15∶1，提取温度为20～70℃，优选40～60℃，提取压力为0.01～0.09MPa，优选0.06～0.09MPa，提取1～4次，优选2～3次，提取液先进行石英沙过滤，粒度为100～300目，然后进行微孔离心过滤，孔径为1.0μm～1.5μm，离心转速为3000～6000rpm；银杏总黄酮的提取率大于90％，银杏内酯的提取率大于80％。

本专利采用膜分离纯化提取滤液，将提取滤液先通过0.1μm～0.8μm孔径的陶瓷膜，优选陶瓷膜孔径为0.5μm，操作压力为0.15～0.3MPa，将陶瓷膜透过液继续通过截留相对分子质量为5000～50000的超滤膜，优选超滤膜截留相对分子质量为10000；结果表明，0.5μm孔径的膜通量、总黄酮和总内酯的转移率和除杂率都相对较高；随着超滤膜截留相对分子质量的增大，膜通量有不同程度的增大，但是除杂率会降低，结果表明，超滤膜截留相对分子质量为10000时总黄酮和总内酯的转移率和除杂率都相对较高，故优选截留相对分子质量为10000的超滤膜进行纯化。

本专利将超滤膜透过液用截留相对分子质量为100～300的纳滤膜进行浓缩，浓缩液减压回收乙醇，用酸调节浓缩液的pH值至4～6后得到上柱液；所述酸为盐酸、醋酸或柠檬酸中的一种。由于银杏黄酮类化合物多为多羟基酚类化合物，具有一定的极性和酸性，因为酸性物质更容易在酸性环境中吸附，所以在弱酸性条件下，银杏黄酮类化合物在溶液中保持分子形式，容易被吸附，且在酸性条件下，银杏内酯以分子形式存在于溶液中，也容易被树脂吸附，故将上柱液用酸调节pH值为4～6。

本专利采用大孔树脂吸附纯化银杏内酯和黄酮，先以水洗至无色，再以40％～90％乙醇洗脱，洗脱用乙醇溶液的用量为3～6倍的柱体积，优选为3～4倍的柱体积，收集乙醇洗脱部分，所述的大孔树脂类型为AB-8、D101、DM130、DM-2或HP20中的一种，本发明考察了不同大孔树脂对银杏总黄酮和总内酯的静态吸附容量试验和静态吸附-洗脱性能试验，结果表明AB-8和HP20均有较大的吸附率，并且在解吸附试验中，AB-8树脂的解吸量和洗脱液中总黄酮和总内酯的纯度均高于HP20树脂，故优选使用AB-8树脂分离纯化银杏总黄酮和总内酯。

银杏黄酮类化合物主要成分为槲皮素、山奈素、异鼠李素，分子中羟基数目较多，极性较大，内酯的极性适中，因此选用极性较大的溶剂作为洗脱剂，考虑到试剂使用的安全性，故选用乙醇溶液为洗脱剂，并以水为极性调节剂。

本发明对大孔树脂的洗脱溶剂进行了考察，取已充分吸附银杏黄酮和内酯的AB-8树脂100ml装柱，分别以蒸馏水及20％、40％、60％、70％、80％、90％乙醇各400ml恒速洗脱，每个浓度收集为1个流份，分别测定各洗脱液流份中总黄酮和总内酯的洗脱率，结果表明，70％乙醇可将90％以上的银杏黄酮和内酯洗脱下来，故优选70％乙醇为洗脱溶媒。

本专利采用脱酸树脂脱除银杏酚酸，将大孔树脂乙醇洗脱液经过脱酸树脂吸附，收集流出液；所述的脱酸树脂类型为D301、D360、TS-2或HPD500中的一种；本发明考察了不同脱酸树脂对银杏酚酸的去除效果，结果表明TS-2的脱除率最高，并且银杏黄酮和内酯的损失率最小，故优选使用TS-2脱酸树脂脱银杏酚酸。

本发明低酸型银杏提取物的干燥方式为负压微波喷雾干燥或真空冷冻干燥，真空度0.05～0.10MPa，负压微波喷雾干燥进口温度160～195℃，出口温度60～85℃，微波干燥温度40～60℃，冷冻温度小于-35℃，干燥后得到低酸型银杏提取物，含水量小于5％。经HPLC分析，银杏黄酮＞28％，内酯＞8％，银杏酸≤1ppm。所述负压微波喷雾干燥所使用的负压微波喷雾干燥器为自制，由真空系统、冷凝系统、旋风分离器、微波加热、高速雾化器、温控回路等构成。

本发明采用HPLC测定银杏提取物中总黄酮、总内酯和银杏酸的含量，其中银杏黄酮色谱分析条件为：色谱柱C18 ODS(Φ4.6mm×200mm，5μm)，流动相∶甲醇-水(含0.4％的磷酸)体积比50∶50，紫外(360nm)检测器检测，流速为1mL/min；银杏内酯色谱分析条件为：色谱柱C18 ODS(Φ4.6mm×200mm，5μm)，流动相∶正丙醇-四氢呋喃-水体积比1∶15∶84，示差或蒸发光散射检测器检测，流速为1mL/min；银杏酸色谱分析条件为：色谱柱C18 ODS(Φ4.6mm×200mm，5μm)，流动相∶甲醇-水(含0.4％的乙酸)体积比90∶10，紫外(310nm)检测器检测，流速为1mL/min。

本发明的有益效果：

(1)本发明采用负压沸腾法提取银杏叶中黄酮和内酯，代替传统的酸水或醇溶剂高温提取浓缩银杏提取物，解决了目前高温煎煮产生诸多弊病不合理且单一的操作条件。不仅保证银杏叶热敏性成分不被破坏，且提取时间大大缩短，提取率大大提高。

(2)本发明采用石英沙和微孔离心过滤对提取液进行预处理，可有效去除提取液中的大颗粒杂质，减少膜和树脂的污染，延长其使用寿命。

(3)采用陶瓷膜、超滤膜和纳滤膜分离藕合技术，不仅除去高分子蛋白、胶质、叶绿素、高分子单宁等杂质，而且膜分离过程无相变，确保了银杏叶活性成分理化性质的稳定性，富集银杏黄酮、内酯等非常均衡的混合物成分，提高了产品的活性。

(4)本发明采用对银杏黄酮、内酯有选择性吸附的大孔树脂，可有效的提高产品纯度，获得高纯度的银杏提取物产品(银杏黄酮＞28％，内酯＞8％)。

(5)本发明采用脱酸树脂脱酚酸，可有效解决银杏脱酚酸的问题，获得的银杏提取物中银杏酸≤1ppm，该技术能耗和生产成本低，清洁环保，技术通用性好，应用范围广。

(6)本发明工艺操作简单，生产成本低，安全性高，适合工业化生产。

附图说明

图1低酸值银杏提取物的制备方法流程图

图2负压微波喷雾干燥器结构示意图

图3银杏叶提取物中总黄酮的HPLC图谱

图4银杏叶提取物中总内酯的HPLC(示差检测器)图谱

图5银杏叶提取物中总内酯的HPLC(蒸发光散射检测器)图谱

图6银杏叶提取物中银杏酸的HPLC图谱

图7不同陶瓷膜孔径对银杏总黄酮和内酯转移率及除杂率的影响

图8不同截留分子量的超滤膜通量随时间的变化

图9不同截留分子量的超滤膜对银杏总黄酮和内酯转移率及除杂率的影响

具体实施方式

以下实施例对本发明作进一步详细的描述，本发明不受此限制。

实施例1

1.银杏提取物中总黄酮的HPLC分析方法

采用紫外检测方法

(1)色谱条件：色谱柱C₁₈ODS(Φ4.6mm×200mm，5μm)，流动相∶甲醇-水(含0.4％的磷酸)体积比50∶50，检测波长360nm，流速为1mL/min。

(2)标准曲线绘制：分别精密称取槲皮素、山奈酚、异鼠李素对照品适量，置于10mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，制成浓度分别为0.854，0.562，0.259mg/mL的混合对照品溶液；依次精密量取混合对照品溶液0.05，0.10，0.15，0.20，0.25，0.30，0.40，0.50mL置于5mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀后分别取10μL进样，进行色谱分析。槲皮素标准曲线方程为y＝51908x+63760，r＝0.9996；山奈酚标准曲线方程为y＝40870x+52295，r＝0.9998；异鼠李素标准曲线方程为y＝28656x+17124，r＝0.9996。

(3)样品纯度测定：精密称取银杏提取物粉末适量(约0.1g)，置于50mL圆底烧瓶中，加入30mL甲醇-25％盐酸(4∶1)混合液，摇匀溶解，置于水浴(85℃)中加热回流30min，然后迅速冷却至室温，转移至50mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，摇匀，即得样品溶液。照上述方法HPLC测定，结果银杏提取物中总黄酮含量为28.76％。HPLC色谱见图3。

2.银杏提取物中总内酯的HPLC分析方法

方法一：采用示差检测方法

(1)色谱条件：色谱柱C₁₈ODS(Φ4.6mm×200mm，5μm)，流动相：正丙醇-四氢呋喃-水体积比1∶15∶84，流速为1mL/min。

(2)标准曲线绘制：分别称取白果内酯及银杏内酯A、B、C对照品0.82、0.85、0.86、0.76mg，用50％甲醇溶解定容在10mL容量瓶中，制成银杏内酯的对照品溶液。分别精密吸取上述银杏内酯对照品溶液2.5、10、25、40、60μL进样，进行色谱分析。白果内酯标准曲线方程为y＝8.704x+11.348，r＝0.9998；银杏内酯A标准曲线方程为y＝11.610x+295.543，r＝0.9999；银杏内酯B标准曲线方程为y＝8.867x+22.302，r＝0.9998；银杏内酯C标准曲线方程为y＝5.365x+135.128，r＝0.9998。

(3)样品纯度测定：取银杏叶提取物50mg，加水2ml置水浴中温热使溶散，加2％盐酸溶液1滴，用乙酸乙酯振摇提取4次(3mL、2mL、2mL、2mL)，合并提取液，用5％醋酸钠溶液4ml洗涤，分取醋酸钠液，再用乙酸乙酯2mL洗涤，合并乙酸乙酯提取液及洗液，用水洗涤2次，每次4mL分取水液，用乙酸乙酯2mL洗涤，合并乙酸乙酯液，回收溶剂至干，残渣用甲醇溶解并转移至2mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀即得。照上述方法HPLC测定，结果银杏提取物中总内酯含量为7.14％。HPLC色谱见图4。

方法二：采用蒸发光散射检测方法

(1)色谱条件：色谱柱C₁₈ODS(Φ4.6mm×200mm，5μm)，流动相：正丙醇-四氢呋喃-水体积比1∶15∶84，流速为0.8mL/min。蒸发光散射检测条件：蒸发温度100℃，气体流量2.5L/min。

(2)标准曲线绘制：精密称取银杏内酯A、B、C和白果内酯对照品适量，用甲醇溶解并定容至5mL棕色容量瓶中，制成浓度分别为1.014，1.062，1.102，1.124mg/mL的混合对照品溶液。依次精密量取混合对照品溶液1，0.6，0.5，0.4，0.25，0.2，0.16mL置于2mL容量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀后分别取10μL进样，进行色谱分析。银杏内酯A标准曲线方程为y＝299487x-22158，r＝0.9995；银杏内酯B标准曲线方程为y＝247160x-20445，r＝0.9996；银杏内酯C标准曲线方程为y＝300035x-23162，r＝0.9995；白果内酯标准曲线方程为y＝314056x-28416，r＝0.9998。

(3)样品纯度测定：取银杏叶提取物50mg，加水2mL置水浴中温热使溶散，加2％盐酸溶液1滴，用乙酸乙酯振摇提取4次(3mL、2mL、2mL、2mL)，合并提取液，用5％醋酸钠溶液4mL洗涤，分取醋酸钠液，再用乙酸乙酯2mL洗涤，合并乙酸乙酯提取液及洗液，用水洗涤2次，每次4mL分取水液，用乙酸乙酯2mL洗涤，合并乙酸乙酯液，回收溶剂至干，残渣用甲醇溶解并转移至2mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀即得。照上述方法HPLC测定，结果银杏提取物中总内酯含量为8.32％。HPLC色谱见图5。

3.银杏提取物中总酚酸的HPLC分析方法

采用紫外检测方法

(1)色谱条件：色谱柱C₁₈ODS(Φ4.6mm×200mm，5μm)，流动相：甲醇-水(含0.4％的乙酸)体积比90∶10，检测波长310nm，流速为1mL/min。

(2)标准曲线绘制：精密称取一定量的银杏酸标准品，加流动相溶解，配制成300mg/L的贮备液，分别定量移取此贮备液，用流动相稀释成浓度分别为150，90，60，30，9，0.9mg/L的系列对照液，分别取20μL进样，进行色谱分析。银杏酸的标准曲线方程为y＝8.85x+12.40，r＝0.9998。

(3)样品纯度测定：准确称取银杏提取物30g，置于500mL烧瓶中，然后用90％甲醇定容，在50℃水浴锅内加热溶解，过滤，准确吸取滤液2mL于试管中，加入正己烷6mL，适量HCl-NaCl溶液(pH＝2.5)振荡，静置，待分层后，准确吸取上层有机相3mL于另一干燥试管中，测试前真空挥干萃取剂，残渣溶于甲醇5ml。照上述方法HPLC测定，结果银杏提取物中银杏酸含量为0.86ppm。HPLC色谱见图6。

实施例2

负压提取和提取液预处理

将银杏鲜叶或银杏干叶粉碎至0.5cm以下，用40～80％乙醇为提取溶剂，负压沸腾提取30～90min，优选45～60min，提取溶剂与银杏叶粉末的比例为1～30∶1，优选5～15∶1，提取温度为20～70℃，优选40～60℃，提取压力为0.01～0.09MPa，优选0.06～0.09MPa，提取1～4次，优选2～3次，提取液先进行石英沙过滤，粒度为100～300目，然后进行微孔离心过滤，孔径为1.0μm～1.5μm，离心转速为3000～6000rpm；银杏总黄酮的提取率大于90％，银杏内酯的提取率大于80％。

本发明研究了提取压力、醇浓度、料液比和提取时间对茶皂素提取率的影响，设计了4因素4水平[L₁₆(4⁴)]正交试验，以银杏黄酮和银杏内酯的提取率为指标考察减压沸腾提取工艺，试验结果见表1，表2，表3。

表1银杏叶负压提取正交试验结果

表2银杏叶减压提取正交直观分析

表3银杏叶减压提取正交试验方差分析

由方差分析结果可以看出，以总内酯提取率为指标，四因素对提取结果均无显著性影响；以总黄酮提取率为指标，因素A和因素D对总黄酮提取率有显著影响，结合总黄酮和总内酯各水平含量和生产实际，优选最佳减压提取工艺为A₃B₂C₂D₃，即：原料用60％乙醇提取，料液比为1∶8，提取压力为0.08MPa，提取时间为60min，提取2次。

实施例3

膜纯化工艺

将上述滤液通过0.1μm～0.8μm孔径的陶瓷膜，优选陶瓷膜孔径为0.5μm，操作压力为0.15～0.3MPa，将陶瓷膜透过液继续通过截留相对分子质量为5000～50000的超滤膜，优选超滤膜截留相对分子质量为10000，将超滤膜透过液用截留相对分子质量为100～300的纳滤膜进行浓缩，浓缩液减压回收乙醇，用酸调节浓缩液的PH值至4～6后得到上柱液。

本发明选取0.1μm，0.2μm，0.5μm，0.8μm的陶瓷膜孔径，考察膜孔径对膜通量、总黄酮和总内酯的转移率和除杂率的影响，结果如图7所示。从图中可以看出随着膜过滤时间的延长膜通量都有不同程度的下降。结果表明，0.5μm孔径的膜通量、总黄酮和总内酯的转移率和除杂率都相对较高，故优选0.5μm孔径的陶瓷膜进行纯化。

本发明选取截留相对分子质量分别为5000，10000，30000，50000的超滤膜，考察超滤膜孔径对膜通量、总黄酮和总内酯的转移率和除杂率的影响，结果如图8、图9所示。从图中可以看出随着膜截留相对分子质量的增大，膜通量有不同程度的增大，但是除杂率会降低。结果表明，超滤膜截留相对分子质量为10000时总黄酮和总内酯的转移率和除杂率都相对较高，故优选截留相对分子质量为10000的超滤膜进行纯化。

本发明用酸调节浓缩液的PH值至4～6后得到上柱液。银杏黄酮类化合物多为多羟基酚类化合物，具有一定的极性和酸性。因为酸性物质更容易在酸性环境中吸附，所以在弱酸性条件下，银杏黄酮类化合物在溶液中保持分子形式，容易被吸附，且在酸性条件下，银杏内酯以分子形式存在于溶液中，也容易被树脂吸附。

实施例4

大孔树脂纯化工艺

上柱液用大孔树脂吸附，先以水洗至无色，再以40％～90％乙醇洗脱，洗脱用乙醇溶液的用量为3～6倍的柱体积，优选为3～4倍的柱体积，收集乙醇洗脱部分。

所述的大孔树脂类型为AB-8、D101、DM130、DM-2或HP20中的一种。本发明考察了不同大孔树脂对银杏总黄酮和总内酯的静态吸附容量试验和静态吸附-洗脱性能试验，结果见表4、表5。结果表明AB-8和HP20均有较大的吸附率，并且在解吸附试验中，AB-8树脂的解吸量和洗脱液中总黄酮和总内酯的纯度均高于HP20树脂，故优选使用AB-8树脂分离纯化银杏总黄酮和总内酯。

表4不同树脂对银杏总黄酮的静态吸附-洗脱性能试验

表5不同树脂对银杏总内酯的静态吸附-洗脱性能试验

银杏黄酮类化合物主要成分为槲皮素、山奈素、异鼠李素，分子中羟基数目较多，极性较大，内酯的极性适中，因此选用极性较大的溶剂作为洗脱剂，考虑到试剂使用的安全性，故选用乙醇溶液为洗脱剂，并以水为极性调节剂。

本发明对大孔树脂的洗脱溶剂进行了考察，取已充分吸附银杏黄酮和内酯的AB-8树脂100ml装柱，分别以蒸馏水及20％、40％、60％、70％、80％、90％乙醇各400mL恒速洗脱，每个浓度收集为1个流份，分别测定各洗脱液流份中总黄酮和总内酯的洗脱率，结果见表6。结果表明，70％乙醇可将90％以上的银杏黄酮和内酯洗脱下来。故优选70％乙醇为洗脱溶媒。

表6大孔树脂洗脱溶剂的选择

实施例5：脱酸树脂脱酚酸

将大孔树脂乙醇洗脱液再经过脱酸树脂吸附，流出液减压回收乙醇浓缩，进行负压微波喷雾干燥或真空冷冻干燥，真空度0.05～0.10MPa，负压微波喷雾干燥进口温度160～195℃，出口温度60～85℃，微波干燥温度40～60℃，冷冻温度小于-35℃，干燥后得到低酸型银杏提取物，含水量小于5％。

所述的脱酸树脂类型为D301、D360、TS-2或HPD500中的一种；本发明考察了不同脱酸树脂对银杏酚酸的去除效果，结果见表7，表明TS-2的脱除率最高，并且银杏黄酮和内酯的损失率最小，故优选使用TS-2脱酸树脂脱银杏酚酸。

表7不同脱酸树脂对银杏的脱除率及黄酮内酯的损失率

实施例6：

低酸型银杏提取物的制备

(1)负压提取

取银杏鲜叶1000g，粉碎至0.1cm，用60％乙醇为提取溶剂，减压沸腾提取60min，提取溶剂与银杏叶粉末的比例为8∶1，提取温度为40℃，提取压力为0.08MPa，提取2次，过滤，合并提取液；

(2)提取液预处理

提取液先进行石英沙过滤，粒度为100目，然后进行微孔离心过滤，孔径为1.2μm，离心转速为4000rpm；

(3)膜分离

将上述滤液通过0.5μm孔径的陶瓷膜，操作压力为0.20MPa，将陶瓷膜透过液继续通过截留相对分子质量为10000的超滤膜，将超滤膜透过液用截留相对分子质量为100的纳滤膜进行浓缩，浓缩液减压回收乙醇，用盐酸调节浓缩液的pH值至5后得到上柱液；

(4)大孔树脂纯化、脱酸树脂脱酚酸、干燥

a.湿法装柱，柱直径6cm，高80cm，AB-8大孔树脂装量为2kg，D301脱酸树脂装量为2kg。

b.上述过膜浓缩液上大孔树脂吸附，先以4倍柱体积的水洗至无色，再以3倍柱体积的70％乙醇洗脱，收集乙醇洗脱部分，乙醇洗脱液再经过脱酸树脂D301吸附，流出液减压回收乙醇浓缩，进行负压微波喷雾干燥，真空度0.08MPa，负压微波喷雾干燥进口温度160℃，出口温度60℃，微波干燥温度40℃，得到低酸型银杏提取物50.24g，含水量2.5％，经HPLC分析，银杏黄酮含量为29.07％，内酯含量为9.75％，银杏酸为0.82ppm。

实施例7：

(1)负压提取

取银杏干叶1000g，粉碎至0.2cm，用70％乙醇为提取溶剂，减压沸腾提取60min，提取溶剂与银杏叶粉末的比例为10∶1，提取温度为50℃，提取压力为0.07MPa，提取2次，过滤，合并提取液；

(2)提取液预处理

提取液先进行石英沙过滤，粒度为150目，然后进行微孔离心过滤，孔径为1.5μm，离心转速为3000rpm；

(3)膜分离

将上述滤液通过0.2μm孔径的陶瓷膜，操作压力为0.15MPa，将陶瓷膜透过液继续通过截留相对分子质量为5000的超滤膜，将超滤膜透过液用截留相对分子质量为200的纳滤膜进行浓缩，浓缩液减压回收乙醇，用醋酸调节浓缩液的pH值至5后得到上柱液；

(4)大孔树脂纯化、脱酸树脂脱酚酸、干燥

a.湿法装柱，柱直径6cm，高80cm，D101树脂装量为2kg，D360脱酸树脂装量为2kg。

b.上述过膜浓缩液上大孔树脂吸附，先以4倍柱体积的水洗至无色，再以3倍柱体积的70％乙醇洗脱，收集乙醇洗脱部分，乙醇洗脱液再经过脱酸树脂D360吸附，流出液减压回收乙醇浓缩，进行真空冷冻干燥，冷冻温度小于-45℃，得到银杏提取物47.79g，含水量3.8％，经HPLC分析，银杏黄酮含量为28.07％，内酯含量为8.02％，银杏酸为0.95ppm。

实施例8：

(1)负压提取

取银杏鲜叶1000g，粉碎至0.3cm，用80％乙醇为提取溶剂，减压沸腾提取90min，提取溶剂与银杏叶粉末的比例为8∶1，提取温度为40℃，提取压力为0.09MPa，提取3次，提取2次，过滤，合并提取液；

(2)提取液预处理

提取液先进行石英沙过滤，粒度为200目，然后进行微孔离心过滤，孔径为1.2μm，离心转速为4000rpm；

(3)膜分离

将上述滤液通过0.2μm孔径的陶瓷膜，操作压力为0.20MPa，将陶瓷膜透过液继续通过截留相对分子质量为30000的超滤膜，将超滤膜透过液用截留相对分子质量为200的纳滤膜进行浓缩，浓缩液减压回收乙醇，用柠檬酸调节浓缩液的pH值至5后得到上柱液；

(4)大孔树脂纯化、脱酸树脂脱酚酸、干燥

a.湿法装柱，柱直径6cm，高80cm，DM130树脂装量为2kg，TS-2脱酸树脂装量为2kg。

b.上述过膜浓缩液上大孔树脂吸附，先以3倍柱体积的水洗至无色，再以3倍柱体积的80％乙醇洗脱，收集乙醇洗脱部分，乙醇洗脱液再经过脱酸树脂TS-2吸附，流出液减压回收乙醇浓缩，进行负压微波喷雾干燥，真空度0.09MPa，负压微波喷雾干燥进口温度170℃，出口温度60℃，微波干燥温度50℃，得到低酸型银杏提取物48.14g，含水量2.8％，经HPLC分析，银杏黄酮含量为28.58％，内酯含量为8.32％，银杏酸为0.91ppm。

实施例9：

(1)负压提取

取银杏干叶1000g，粉碎至0.4cm，用70％乙醇为提取溶剂，减压沸腾提取45min，提取溶剂与银杏叶粉末的比例为12∶1，提取温度为60℃，提取压力为0.07MPa，提取2次，过滤，合并提取液；

(2)提取液预处理

提取液先进行石英沙过滤，粒度为100目，然后进行微孔离心过滤，孔径为1.0μm，离心转速为5000rpm；

(3)膜分离

将上述滤液通过0.5μm孔径的陶瓷膜，操作压力为0.15MPa，将陶瓷膜透过液继续通过截留相对分子质量为50000的超滤膜，将超滤膜透过液用截留相对分子质量为100的纳滤膜进行浓缩，浓缩液减压回收乙醇，用盐酸调节浓缩液的pH值至5后得到上柱液；

(4)大孔树脂纯化、脱酸树脂脱酚酸、干燥

a.湿法装柱，柱直径6cm，高80cm，DM-2树脂装量为2kg，HPD500脱酸树脂装量为2kg。

b.上述过膜浓缩液上大孔树脂吸附，先以3倍柱体积的水洗至无色，再以3倍柱体积的90％乙醇洗脱，收集乙醇洗脱部分，乙醇洗脱液再经过脱酸树脂HPD500吸附，流出液减压回收乙醇浓缩，进行负压微波喷雾干燥，真空度0.08MPa，负压微波喷雾干燥进口温度160℃，出口温度70℃，微波干燥温度60℃，得到低酸型银杏提取物49.02g，含水量1.3％，经HPLC分析，银杏黄酮含量为28.05％，内酯含量为8.14％，银杏酸为0.89ppm。

实施例10：

(1)负压提取

取银杏鲜叶1000g，粉碎至0.2cm，用60％乙醇为提取溶剂，减压沸腾提取60min，提取溶剂与银杏叶粉末的比例为10∶1，提取温度为45℃，提取压力为0.08MPa，提取2次，过滤，合并提取液；

(2)提取液预处理

提取液先进行石英沙过滤，粒度为100目，然后进行微孔离心过滤，孔径为1.5μm，离心转速为3000rpm；

(3)膜分离

将上述滤液通过0.5μm孔径的陶瓷膜，操作压力为0.20MPa，将陶瓷膜透过液继续通过截留相对分子质量为10000的超滤膜，将超滤膜透过液用截留相对分子质量为200的纳滤膜进行浓缩，浓缩液减压回收乙醇，用柠檬酸调节浓缩液的pH值至5后得到上柱液；

(4)大孔树脂纯化、脱酸树脂脱酚酸、干燥

a.湿法装柱，柱直径6cm，高80cm，HP20树脂装量为2kg，D301脱酸树脂装量为2kg。

b.上述过膜浓缩液上大孔树脂吸附，先以3倍柱体积的水洗至无色，再以3倍柱体积的90％乙醇洗脱，收集乙醇洗脱部分，乙醇洗脱液再经过脱酸树脂D301吸附，流出液减压回收乙醇浓缩，进行真空冷冻干燥，冷冻温度-55℃，得到银杏提取物51.38g，含水量3.9％，经HPLC分析，银杏黄酮含量为28.94％，内酯含量为9.02％，银杏酸为0.85ppm。

Claims (5)

1.一种负压沸腾提取制备低酸型银杏提取物的方法，其特征在于，其步骤如下：

(1)负压提取

将银杏鲜叶或银杏干叶粉碎至0.5cm以下，用40～80％乙醇为提取溶剂，负压沸腾提取30～90min，提取溶剂与银杏叶的比例为1～30∶1，提取温度为20～70℃，提取压力为0.01～0.09MPa，提取1～4次，过滤，合并提取液；

(2)提取液预处理

提取液先进行石英沙过滤，粒度为100～300目，然后进行微孔离心过滤，孔径为1.0μm～1.5μm，离心转速为3000～6000rpm；

(3)膜分离

将上述滤液通过0.1μm～0.8μm孔径的陶瓷膜，操作压力为0.15～0.3MPa，将陶瓷膜透过液继续通过截留相对分子质量为5000～50000的超滤膜，将超滤膜透过液用截留相对分子质量为100～300的纳滤膜进行浓缩，浓缩液减压回收乙醇，用酸调节浓缩液的pH值至4～6后得到上柱液；

(4)大孔树脂纯化

上柱液用AB-8大孔树脂吸附，先以水洗至无色，再以70％～90％乙醇溶液洗脱，洗脱剂用量为3～6倍的柱体积，收集乙醇洗脱部分；

(5)脱酸树脂脱酚酸

上述乙醇洗脱液再经过脱酸树脂吸附，流出液减压回收乙醇浓缩得到浓缩液；

(6)干燥

将上述浓缩液进行真空冷冻干燥，真空度0.05～0.10MPa，冷冻温度小于-35℃，干燥后得到低酸型银杏提取物，含水量小于5％，经HPLC分析，银杏黄酮＞28％，内酯＞8％，银杏酸≤1ppm。

2.如权利要求1所述的一种负压沸腾提取制备低酸型银杏提取物的方法，其特征在于：步骤(1)中所述负压沸腾提取为热回流、微波提取或超声波提取中的一种。

3.如权利要求1所述的一种负压沸腾提取制备低酸型银杏提取物的方法，其特征在于：步骤(3)中所述酸为盐酸、醋酸或柠檬酸中的一种。

4.如权利要求1所述的一种负压沸腾提取制备低酸型银杏提取物的方法，其特征在于：步骤(5)中所述的脱酸树脂类型为D301、D360、TS-2或HPD500中的一种。

5.如权利要求1所述的一种负压沸腾提取制备低酸型银杏提取物的方法，其特征在于：步骤(6)中所述的HPLC分析，其中银杏黄酮色谱分析条件为：色谱柱：C₁₈ODS，Φ4.6mm×200mm，5μm，流动相：体积比为50∶50的甲醇-含0.4％的磷酸水溶液，紫外检测器检测，检测波长为360nm，流速为1mL/min；银杏内酯色谱分析条件为：色谱柱：C₁₈ODS，Φ4.6mm×200mm，5μm，流动相：体积比为1∶15∶84的正丙醇-四氢呋喃-水溶液，示差或蒸发光散射检测器检测，流速为1mL/min；银杏酸色谱分析条件为：色谱柱：C₁₈ODS，Φ4.6mm×200mm，5μm，流动相：体积比为90∶10的甲醇-含0.4％的乙酸水溶液，紫外检测器检测，检测波长为310nm，流速为1mL/min。