CN106727746B - 低酸水溶性银杏叶提取物的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种低酸水溶性银杏叶提取物的制备方法。本发明所提供的低酸水溶性银杏叶提取物的制备方法，包括以下步骤：(1)上样：将水溶性银杏叶提取物的水溶液上聚酰胺吸附柱；(2)待所述水溶性银杏叶提取物的水溶液通过聚酰胺吸附柱后，再用纯化水洗脱，收集上样流出液和洗脱液，即得到低酸水溶性银杏叶提取物。采用本发明得到的银杏叶提取物，其工艺流程步骤少，产品银杏酸含量小于1ppm，产品有效成分含量高，将洗脱液浓缩干燥得到粉末，总黄酮质量分数大于24％，内酯含量大于6％。

Description

低酸水溶性银杏叶提取物的制备方法

技术领域

本发明涉及银杏叶提取物的制备方法，尤其涉及低酸水溶性银杏叶提取物的制备方法。

背景技术

银杏(Ginkgo bilobal)是冰川时期存活在地球上的古老植物，素有“活化石”之称。中国是银杏的发源地，其资源占世界总量的70％左右。近年来，银杏叶提取物及其制剂对冠心病，心绞痛，大脑退行性病变及心血管疾病引起的脑动能障碍，老年痴呆症等疗效确切，已成为治疗心脑血管疾病的首选药物。

中国是全球第一大银杏叶提取物生产国，行业产能占全球总产能的50％以上。2013年中国银杏叶提取物产量达到了348.6吨。2014年为468.5吨，为全球总产量的48.52％。我国虽然是银杏叶提取物产量大国，但在国际市场的占有率大大落后于欧美与日本。其主要原因是我国的银杏叶提取物及其制剂处于全球产业链的低端，抑制了我国企业议价能力的提升。

通过比较银杏叶提取物在各国药典现行质量标准的主要指标，说明《中国药典》与欧美药典存在明显差距，最引人关注的有毒物质银杏酸的含量在《中国药典》限量为小于10ppm，欧美药典为小于5ppm，高于欧美药典限量的一倍。

银杏酸具有潜在的致敏，致突变的作用及细胞毒性，可引起严重的过敏反应，基因突变。在国际市场上含量高低直接影响产品的质量和价格，因此降低银杏叶提取物中的银杏酸含量是迫切需要解决的问题。目前关于降低银杏叶提取物中银杏酸的方法从检索的专利资料来看基本为溶剂萃取和大孔树脂吸附法。现有技术中使用聚酰胺柱纯化银杏叶提取物，去银杏酸，大多局限于粗提取，在经过柱子之后还需要繁琐的步骤来对粗产品进一步纯化，并且，在过柱子时，大多采用醇溶液体系，之后还涉及到去除有机溶剂的步骤，对制剂的安全性有一定的影响。

CN201310336439公开了一种以银杏落叶为原料的银杏叶精制提取物及其制备方法与应用。此专利中分别使用70％-85％的乙醇，90％-95％的乙醇，70％-75％的甲醇，还使用了大孔树脂吸附柱和聚酰胺柱，均为醇溶液上柱。首先是步骤较为繁琐，其次使用高浓度的有机溶剂增加了生产成本，最后，把加入的助溶剂去除，使产品达到国家标准也是很大的问题。此专利只公开了去除甲醇的方法为减压浓缩，冷冻干燥，而冷冻干燥的方法对甲醇的去除效果并不明显，而后续的检测也并没有给出甲醇的残留量。

CN101194918B公开了一种银杏酸脱除工艺，步骤比较简单，然而对于实施时的温度，用量公开均不充分，本行业技术人员无法实施，同时产物中的银杏酸含量低于5ppm，还是比本发明中的含量高。

全球银杏叶提取物(总黄酮)每年总产量为888.4吨，中国约占450吨。上述提取物均以银杏叶为原料提取所得，目前为止还没有1吨提取物是从银杏根皮中提取得到的，因此降低银杏叶提取物中银杏酸含量是当务之急，是银杏产业升级的重要一环，只有降低银杏叶提取物中的银杏酸，而且大大低于欧盟标准的＜5ppm，在生产上才有实际意义，才会带来巨大的经济效益。

发明内容

根据上述领域的不足，本发明提供一种银杏酸含量极低的，高效、安全、简捷、经济、极易被人体组织吸收的低酸水溶性银杏叶提取物的生产工艺。

本发明的技术方案如下：

低酸水溶性银杏叶提取物的制备方法，包括以下步骤：

(1)上样：将水溶性银杏叶提取物的水溶液上聚酰胺吸附柱；(2)待所述水溶性银杏叶提取物的水溶液通过聚酰胺吸附柱后，再用纯化水洗脱，收集上样流出液和洗脱液，即得到低酸水溶性银杏叶提取物。

所述步骤(1)中所述聚酰胺吸附柱装填有粒度为100～300目的聚酰胺吸附剂，所述聚酰胺吸附剂质量与所述水溶性银杏叶提取物的水溶液的质量比为1:1～1:3；所述上样流出液和洗脱液的流速为2ml/min～5ml/min；同时动态监控所述上样流出液和洗脱液中的银杏酸含量；

所述步骤(2)中所述洗脱为用4～5倍柱体积的纯化水洗脱。

所述水溶性银杏叶提取物为银杏酸含量小于10ppm的水溶性银杏叶提取物。

所述水溶性银杏叶提取物由如下方法制备得到：

采用脂溶性银杏叶提取物为原料，20％～60％的热乙醇为提取溶剂；用所述热乙醇充分溶解脂溶性银杏叶提取物后，冷却并放置过夜以沉淀出不溶性杂质，滤去滤渣的滤液A；将所述滤液A减压蒸馏除去提取剂乙醇，过滤得水溶性银杏叶提取物，所述水溶性银杏叶提取物中银杏酸含量小于10ppm；所述脂溶性银杏叶提取物的提取溶剂为70％稀乙醇。

所述水溶性银杏叶提取物为银杏酸含量小于5ppm的水溶性银杏叶提取物。

所述水溶性银杏叶提取物由如下方法制备得到：

采用脂溶性银杏叶提取物为原料，22％～28％的热乙醇为提取溶剂；用所述热乙醇充分溶解脂溶性银杏叶提取物后，冷却并放置过夜以沉淀出不溶性杂质，滤去滤渣的滤液A；将所述滤液A减压蒸馏除去提取剂乙醇的过程中要不断添加热水到所述滤液A中以使固体的重量含量占溶剂的体积的分数控制在7～9％，放置室温过夜，过滤得水溶性银杏叶提取物；所述水溶性银杏叶提取物中银杏酸含量小于5ppm；所述脂溶性银杏叶提取物的提取溶剂为70％稀乙醇。

所述低酸水溶性银杏叶提取物为银杏酸含量小于1ppm的水溶性银杏叶提取物。

所述步骤(1)中的动态监控为进行薄层层析定性监控，防止流速过快带出银杏酸；所述洗脱液每10分钟计作1流分；

所述步骤(2)收集洗脱液后，进行减压浓缩，真空干燥至变成粉末。

所述聚酰胺吸附柱装填有粒度为300目的聚酰胺吸附剂；

所述聚酰胺吸附剂质量与所述水溶性银杏叶提取物的水溶液的质量比为1:1；

所述洗脱液的流速为5ml/min，每10分钟计作1流分，进行薄层层析定性监控，防止流速过快带出银杏酸，6～8小时完成25升水溶性银杏叶提取物的水溶液通过聚酰胺吸附柱。

由上述方法制备得到的水溶性银杏叶提取物，其银杏酸含量小于1ppm。

本研究采用的银杏酸含量测定方法见《中国药典》2015版银杏叶提取物的相关项目：高效液相分离的色谱法(通则0512)测定。

银杏酸为6-烷基或烯基水杨酸，其结构中虽有芳羟基和羧基等极性基团，但因6位上的侧链具有碳数为13至17的长链，使得银杏酸为脂溶性成分，显弱极性可溶于非极性溶剂，难溶于水。基于上述原理，本发明采用了将银杏酸含量较低的水溶性银杏叶提取物的水溶液用聚酰胺吸附柱吸附法脱酸，减少了后续去除助溶剂等的步骤，方法简便，可操作性强，成本低，有效成分提高，有害成分银杏酸可降低到小于1ppm。选择粒度为100～300目的聚酰胺吸附剂吸附分离银杏酸的效果最佳。吸附剂质量与投料质量为1:1～1:3，选择其他比例会影响产品质量和生产成本。洗脱液的流速为2ml/min～5ml/min，流速太快会影响银杏酸的吸附分离，流速太慢必然延长生产时间增加成本。

本发明人用水溶性银杏叶提取物为原料，对其进行进一步提纯，所得产品能直接进行调味，灌装，极大地简化了生产步骤，减少了生产成本；同时，在此精制过程中没有用到任何有机溶剂，没有了残留溶剂的威胁；此外，在降低银杏酸含量方面，把银杏酸含量降低到1ppm以下，效果突出；最后，本发明得到的产品有效成分含量高，将洗脱液浓缩干燥得到粉末，总黄酮质量分数大于24％，内酯含量大于6％，冷水溶解度大于5g/100ml。

专利的价值不仅仅在于理论，而且需要体现出在生产实践中的可操作性、可重复性和适合规模化生产，同时整个工艺过程还要确保符合国家食品药品监督局的质量标准。

在有关降低银杏酸专利的检索中发现，很多文献中的生产流程只顾及降低银杏酸的指标，没有考虑国家食品药品监督局对产品的质量标准要求。中国药典2015版规定银杏提取物(总黄酮)的提取溶剂为70％稀乙醇，其它如用盐酸或水等提取方法都存在质量风险。

本申请整个工艺流程充分考虑了上述因素和风险，在生产实践中工人易学，操作简便，得到的产品安全有效，符合国内国际标准的要求。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明做进一步的详细说明，需要声明的是，下述实施例仅作为解释和说明，不构成对本发明保护范围的限制。

试剂来源：

脂溶性银杏叶提取物：购于山东仁和药业商家，规格型号总黄酮占24％，内酯6％。该脂溶性银杏叶提取物是按照中国药典2015版规定的方法制备得到的，即该脂溶性银杏叶提取物(总黄酮)的提取溶剂为70％稀乙醇，其它如用盐酸、水提取等方法都存在质量风险。

25％的乙醇为自行配制，25％乙醇是指其中所含乙醇体积百分比。

实施例1、制备低酸水溶性银杏叶提取物

取脂溶性银杏叶提取物2000克，加50℃的22％的乙醇15立升(1500ml)充分搅拌使其溶解，放冷后放置过夜，过滤得滤液A，滤渣烘干保留。

将滤液A放置于减压罐内减压，回收乙醇至无醇味，在回收乙醇过程中要不断向滤液A中添加52℃热水10立升(10000毫升)，使固体的重量含量占溶剂的体积分数控制在7％，放置室温过夜，过滤得滤液B，即水溶性银杏叶提取物。取样检测其总黄酮含量、内脂含量以及银杏酸含量，检测方法均按中国药典2015版银杏叶提取物项下的规定，高效液相色谱法(通则0512)。结果：总黄酮含量25.5％，内脂含量7％，银杏酸含量小于5ppm。

向上述的滤液B中直接添加纯净水至400立升，得水溶性银杏叶提取物溶液，其质量百分比浓度为8％。

将得到的水溶性银杏叶提取物溶液上300目聚酰胺吸附柱，该聚酰胺吸附柱规格为5cm×120cm，层析柱装填有粒度300目的聚酰胺吸附剂2000克(购自国药集团化学试剂有限公司，Q/CYDZ 2305-2009)，吸附剂质量与投料质量为1:1，洗脱液流速为5ml/min，每10分钟计作1流分，进行薄层层析定性监控，防止流速过快带出银杏酸，约6至8小时完成25升溶液通过聚酰胺吸附柱，再用4-5倍柱体积的纯化水洗脱，收集上样流出液、柱内的残液和洗脱液，减压浓缩，真空干燥至变成粉末。

洗脱液经浓缩干燥，得到水溶性银杏叶提取物粉末。测定银杏酸、银杏总黄酮、银杏总内酯含量，其检测方法均按中国药典2015版银杏叶提取物项下的规定，高效液相色谱法(通则0512)。

结果：银杏酸含量为0.65ppm；冷水溶解度大于5g/100ml；总黄酮含量25％，内脂含量6.5％。

实施例2、制备低酸水溶性银杏叶提取物

取脂溶性银杏叶提取物2000克，加50℃的28％的乙醇15立升(1500ml)充分搅拌使其溶解，放冷后放置过夜，过滤得滤液A，滤渣烘干保留。

将滤液A放置于减压罐内减压，回收乙醇至无醇味，在回收乙醇过程中要不断向滤液A中添加52℃热水10立升(10000毫升)，使固体的重量含量占溶剂的体积分数控制在9％，放置室温过夜，过滤得滤液B，即水溶性银杏叶提取物。取样检测其总黄酮含量、内脂含量以及银杏酸含量，检测方法均按中国药典2015版银杏叶提取物项下的规定，高效液相色谱法(通则0512)。结果：总黄酮含量26％，内脂含量6.2％，银杏酸含量小于5ppm。

向上述的滤液B中直接添加纯净水至400立升，得水溶性银杏叶提取物溶液，其质量百分比浓度为8％。

将得到的水溶性银杏叶提取物溶液上200目聚酰胺吸附柱，吸附剂质量与投料质量为1:1，洗脱液流速为3ml/min，其他条件与实施例1相同。

结果：银杏酸含量为0.85ppm；冷水溶解度大于5g/100ml；总黄酮含量25.8％，内脂含量6.0％。

实施例3、制备低酸水溶性银杏叶提取物

取脂溶性银杏叶提取物2000克，加50℃的20％的乙醇15立升(1500ml)充分搅拌使其溶解，放冷后放置过夜，过滤得滤液A，滤渣烘干保留。

将滤液A放置于减压罐内减压，回收乙醇至无醇味，过滤得滤液B，即水溶性银杏叶提取物。取样检测其总黄酮含量、内脂含量以及银杏酸含量，检测方法均按中国药典2015版银杏叶提取物项下的规定，高效液相色谱法(通则0512)。结果：总黄酮含量25％，内脂含量6.5％，银杏酸含量小于10ppm。

将得到的水溶性银杏叶提取物溶液上100目聚酰胺吸附柱，吸附剂质量与投料质量为1:3，洗脱液流速为2ml/min，其他条件与实施例1相同。

结果：银杏酸含量为1.2ppm；冷水溶解度大于5g/100ml；总黄酮含量24.6％，内脂含量6.1％。

实施例4、制备低酸水溶性银杏叶提取物

取脂溶性银杏叶提取物2000克，加50℃的60％的乙醇15立升(1500ml)充分搅拌使其溶解，放冷后放置过夜，过滤得滤液A，滤渣烘干保留。

将滤液A放置于减压罐内减压，回收乙醇至无醇味，过滤得滤液B，即水溶性银杏叶提取物。取样检测其总黄酮含量、内脂含量以及银杏酸含量，检测方法均按中国药典2015版银杏叶提取物项下的规定，高效液相色谱法(通则0512)。结果：总黄酮含量24.2％，内脂含量5.8％，银杏酸含量小于10ppm。

将得到的水溶性银杏叶提取物溶液上100目聚酰胺吸附柱，吸附剂质量与投料质量为1:3，洗脱液流速为2ml/min，其他条件与实施例1相同。

结果：银杏酸含量为1.1ppm；冷水溶解度大于5g/100ml；总黄酮含量24％，内脂含量5.5％。

实施例5、制备低酸水溶性银杏叶提取物

取干燥银杏叶提取物1kg，以65℃热水搅拌溶解，滤过，滤渣再以热水溶解3次，滤过，合并滤液。滤液加纯化水稀释至15L，相对密度1.01，得到水溶性银杏叶提取物水溶液。

将得到的水溶性银杏叶提取物水溶液上300目聚酰胺吸附柱，吸附剂质量与投料质量为1:1，洗脱液流速为5ml/min，其他条件与实施例1相同。

取样检测其总黄酮含量、内脂含量以及银杏酸含量，检测方法均按中国药典2015版银杏叶提取物项下的规定，高效液相色谱法(通则0512)。结果：总黄酮含量20％，内脂含量5.9％，银杏酸含量1.5ppm。

实施例6、溶剂萃取法

依据申请号为02113531.2的名称为“用萃取法从银杏叶提取物中脱银杏酸的工艺”的发明专利，按照其中实施例1中的步骤，将银杏叶去杂，溶解，过滤，萃取，干燥，其中去杂工序是将粉碎后的银杏叶提取物加入乙醇搅拌，溶解，过滤，干燥后完成的，溶解工序是取银杏叶提取物加入甲醇后在室温——摄氏60度的夹层锅中内加热溶解，过滤，收集甲醇溶液，萃取工艺是这样进行的：取甲醇滤液加入萃取器中，加入石油醚，震摇后静置分层，去除上层后，取下层物质继续在加入石油醚，震摇后静置分层，如此重复3-7次，将下层物质放在干燥设备中进行干燥程序。

取样检测其总黄酮含量、内脂含量以及银杏酸含量，检测方法均按中国药典2015版银杏叶提取物项下的规定，高效液相色谱法(通则0512)。结果：总黄酮含量24％，内脂含量6％，银杏酸含量小于10ppm。

实施例7、大孔树脂吸附法

依据申请号为201110026813.4，名称为“超声提取制备低酸值银杏提取物的方法”的发明专利，按照其中实施例1中的步骤：

(1)将银杏叶在60℃的条件下烘干24h，并粉碎得到100目的银杏叶粉末；

(2)将步骤(1)得到的银杏叶粉末与浓度为10％的乙醇溶液混合，银杏粉末与乙醇溶液的比例为1g:5ml，在30℃的条件下超声提取15分钟得到提取液，超声频率为20Hz；

(3)将步骤(2)得到的提取液减压浓缩除去乙醇后，得到浓缩液，减压浓缩的真空度为0.05MPa；向浓缩液中加入沉淀剂MgCl₂的饱和溶液，直至浓缩液的pH值为5；经抽滤后得到清夜；

(4)将步骤(3)得到的清夜经AB-8大孔树脂柱富集，以使清夜中的银杏提取物成分富集在树脂上，清夜与树脂的体积比是5:1，清夜的流速是0.5ml/min；用洗脱剂对大孔树脂进行洗脱，将树脂上富集的银杏提取物成分洗脱下来，洗脱机的流速是1ml/min，洗脱剂与树脂的体积比是2:1；收集过柱液，即经洗脱剂洗脱下来的液体；所使用的AB-8打孔树脂的厂家为上海摩速科学器材有限公司；所述洗脱剂为浓度为50％的乙醇溶液；

(5)将步骤(4)收集的过柱液减压浓缩后再经高压喷雾干燥，即得到所述的银杏提取物；减压浓缩的真空度为0.05MPa，干燥温度为300℃，高压喷雾干燥的压力为2MPa，干燥时间为10秒。银杏提取物的产品得率为1.17％，经检测其中银杏黄酮含量为21.53％，银杏内脂含量为5.32％，银杏酚酸含量大于10ppm。

以上详细描述了本发明的较佳的具体的实施例。应当理解，本领域普通技术人员无需付出创造性的劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡是本领域技术人员依照本发明的构思在现有技术的基础之上通过逻辑分析、推理或者是有限次的实验可以得到的技术方案，皆应在本发明权利要求书所确定的保护范围之内。

Claims (4)

1.低酸水溶性银杏叶提取物的制备方法，包括以下步骤：

（1）上样：将水溶性银杏叶提取物的水溶液上聚酰胺吸附柱；（2）待所述水溶性银杏叶提取物的水溶液通过聚酰胺吸附柱后，再用纯化水洗脱，收集上样流出液和洗脱液，即得到低酸水溶性银杏叶提取物；

所述步骤（1）中所述聚酰胺吸附柱装填有粒度为100~300目的聚酰胺吸附剂，所述聚酰胺吸附剂质量与所述水溶性银杏叶提取物的水溶液的质量比为1:1；所述上样流出液和洗脱液的流速为2ml/min ~5ml/min；同时动态监控所述上样流出液和洗脱液中的银杏酸含量；

所述步骤（2）中所述洗脱为用4~5倍柱体积的纯化水洗脱；

所述水溶性银杏叶提取物由如下方法制备得到：

采用脂溶性银杏叶提取物为原料，22%~28%的热乙醇为提取溶剂；用所述热乙醇充分溶解脂溶性银杏叶提取物后，冷却并放置过夜以沉淀出不溶性杂质，滤去滤渣的滤液A；将所述滤液A减压蒸馏除去提取剂乙醇的过程中要不断添加热水到所述滤液A中以使固体的重量含量占溶剂的体积的分数控制在7~9%，放置室温过夜，过滤得水溶性银杏叶提取物；所述水溶性银杏叶提取物中银杏酸含量小于5ppm；所述脂溶性银杏叶提取物的提取溶剂为70%稀乙醇；

所述低酸水溶性银杏叶提取物为银杏酸含量小于1ppm的水溶性银杏叶提取物。

2.根据权利要求1所述的低酸水溶性银杏叶提取物的制备方法，其特征在于：所述水溶性银杏叶提取物为银杏酸含量小于5ppm的水溶性银杏叶提取物。

3.根据权利要求1所述的低酸水溶性银杏叶提取物的制备方法，其特征在于：所述步骤（1）中的动态监控为进行薄层层析定性监控，防止流速过快带出银杏酸；所述洗脱液每10分钟计作1流分；

所述步骤（2）收集洗脱液后，进行减压浓缩，真空干燥至变成粉末。

4.根据权利要求1所述的低酸水溶性银杏叶提取物的制备方法，其特征在于：

所述聚酰胺吸附柱装填有粒度为300目的聚酰胺吸附剂；

所述聚酰胺吸附剂质量与所述水溶性银杏叶提取物的水溶液的质量比为1:1；

所述洗脱液的流速为5ml/min，每10分钟计作1流分，进行薄层层析定性监控，防止流速过快带出银杏酸， 6~8小时完成25升水溶性银杏叶提取物的水溶液通过聚酰胺吸附柱。