CN111166797A - 一种水热提取柠檬籽总黄酮的提取纯化方法及其产品 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种水热提取柠檬籽总黄酮的提取纯化方法及其产品，以柠檬籽为原料，采用乙醇为提取剂，运用搅拌热提取的方法对柠檬籽总黄酮进行提取，最佳工艺参数为乙醇浓度70％、加热温度80℃、料液比1:20(g/mL)、加热60min时，在此条件下，提取率为4.3995mg/g，分离纯化柠檬籽总黄酮的最佳工艺参数为上样浓度0.35mg/mL、乙醇浓度80％、洗脱速度1mL/min，在此条件下，回收率为62.9％。柠檬籽总黄酮在一定程度上，具有清除DPPH自由基、羟基自由基和超氧阴离子自由基的能力和还原力,且前三者IC50分别0.003mg/mL、0.003mg/mL、0.024mg/mL。

Description

一种水热提取柠檬籽总黄酮的提取纯化方法及其产品
技术领域
本发明涉及一种总黄酮提取纯化方法，具体涉及一种水热提取柠檬籽总黄酮的提取纯化方法及其产品。
背景技术
柠檬为芸香科柑橘属植物，广泛分布于亚热带地区。果实中富含维生素、糖类、柠檬酸、橙皮苷等元素，多作为上等调味料，应用于饮料、菜肴、化妆品及药品等。据药典记载，柠檬具有抗菌消炎、生津解暑、开胃、清热化痰以及提高人体免疫力等功效。
柠檬籽是柠檬工业加工的主要副产物，其中含有大量的油脂、黄酮类和柠檬苦素类化合物，随意丢弃会造成环境污染和资源浪费。随着自然资源的过度开发，保护资源或者充分利用资源成为全世界的共同目标。而柠檬籽作为加工柠檬等产品的下脚料，充分开发其价值，既能变废为宝，避免资源的浪费，又提高了资源的综合利用，同时研究柠檬籽的新成分及生理活性，必能为人类治疗疾病带来新的研究方向。黄酮类化合物因为其具有极大的生理活性和药用价值成为现在研究的热门话题。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种水热提取柠檬籽总黄酮的提取纯化方法。
本发明的目的之二在于提供上述方法所制备的柠檬籽总黄酮。
本发明的技术方案之一：一种水热提取柠檬籽总黄酮的提取纯化方法，包括以下步骤：
1)前处理：取柠檬籽清洗干燥至恒重，粉碎，所得粉末用石油醚超声脱脂，抽滤干燥。
2)提取：称取柠檬籽粉末置于加热容器中，加入体积分数为65-80％的乙醇，加热搅拌30-150min，加热温度60-100℃，料液比1:5-25g/mL，过滤，得提取液，减压浓缩。
3)纯化：称取预处理的大孔树脂，玻璃层析柱湿法装柱，上样量6.4mg、上样浓度0.250-0.450g/mL，吸附完全后，用水洗至流出液无色，然后用45mL 50-90％的乙醇，以1-5mL/min的洗脱流速洗脱收集洗脱液即为纯化的柠檬籽总黄酮。
优选的，步骤1)中脱脂温度45℃，料液比1∶30，功率200W，脱脂时间60-90min，干燥后粉末过40目筛。
优选的，步骤2)中提取液减压浓缩至0.642mg/mL。
优选的，步骤2)中乙醇体积分数为70％，加热时间60min，加热温度80℃，料液比1∶250。
优选的，步骤3)中大孔树脂预处理方法：D-101大孔树脂，95％乙醇浸泡24h，蒸馏水洗至无醇味，然后用5％盐酸溶液浸泡12h，蒸馏水洗至中性；最后，用5％氢氧化钠溶液浸泡12h，用蒸馏水洗至中性，最终晾干，备用。
优选的，步骤3)中上样浓度0.35mg/mL，洗脱浓度80％，洗脱流速1mL/min。
本发明的目的之二，提供上述方法所制备的柠檬籽总黄酮。
本发明具有以下有益效果：
1)本发明通过搅拌热提取法并限定过程参数，从柠檬籽中成功提取出柠檬籽总黄酮，工艺简单，柠檬籽总黄酮的提取率高达4.480mg/g，提取过程中加热时间、加热温度、料液比以及乙醇浓度对于总黄酮提取率均存在显著的影响。
2)提取率随着加热时间的延长，先升高而后降低。当加热60min时，提取率达到最大值。因此，在其他因素不变的情况下，加热时间宜选择在60min附近。
3)提取率随着乙醇用量的增大，先上升后下降。在本发明实施例中，提取率最大时，料液比为1:20，故在其他因素不变的情况下，料液比宜选择在1:20附近。
4)提取率随着乙醇浓度的增大，呈先增大后略微下降的趋势。在本发明实施例中，乙醇浓度70％时，提取率达到峰值。所以，在其他因素不变的情况下，宜选取70％的乙醇浓度。
5)温度从60-80℃，随着温度的升高，分子运动加速，分子扩散和渗透能力加强，让柠檬籽内的黄酮溶出率增加，最终使得提取率升高。而当温度超过80℃，可能会破坏的黄酮的内部结构，致使提取率下降。同时，高温度可能也会对仪器造成损害，因此，在其他因素不变的情况下，宜选取在80℃附近。
6)本发明提取出的柠檬籽总黄酮，对DPPH自由基清除率高达80％，对OH·清除率最高达70％，对O2 -·清除率最高达89.3％，可以证明柠檬籽总黄酮在一定程度上具有抗氧化的能力，该结论为研发抗衰老药物提供一种新方向，同时也为开发低毒甚至无毒的抗氧化剂提供了理论基础。
附图说明
图1为实施例1绘制的标准曲线。
图2为实施2中加热时间对柠檬籽总黄酮提取率的影响曲线图。
图3为实施3中料液比对柠檬籽总黄酮提取率的影响曲线图。
图4为实施4中乙醇浓度对柠檬籽总黄酮提取率的影响曲线图。
图5为实施5中加热温度对柠檬籽总黄酮提取率的影响曲线图。
图6为实施7中黄酮浓度泄露曲线图。
图7为实施7中上样浓度对柠檬籽总黄酮吸附率的影响曲线图。
图8为实施7中不同管数对应的黄酮浓度曲线图。
图9为实施7中洗脱浓度对柠檬籽总黄酮回收率的影响曲线图。
图10为实施7中洗脱流速对柠檬籽总黄酮回收率的影响曲线图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1标准曲线绘制
精密称取0.0050g芦丁标准品，加入适量70％乙醇溶解，定容至50mL得芦丁标准品溶液，分别精密吸取上述标准品溶液1.00、2.00、3.00、4.00、5.00mL于10mL容量瓶中，即得；
向不同浓度的芦丁溶液中依次加入0.4mL 5％NaNO2溶液、0.4mL 10％Al(NO3)3溶液、4mL 4％NaOH溶液，每加一种试剂，静置10min，最后并用70％乙醇定容到10mL。
在510nm波长下测定其吸光度值，以吸光度值A为纵坐标(Y)，以芦丁的质量浓度(mg/mL)为横坐标(X)绘制芦丁标准曲线图1，并根据标准曲线计算后续提取液中总黄酮浓度以及提取率。
提取率的计算公式：Y＝(C×V)×W
式中:Y—提取率，mg/g；C—提取液黄酮浓度，mg/mL；V—提取总体积，mL；W—称取的样品质量，g。
实施例2
1)前处理：取柠檬籽清洗干燥至恒重，粉碎，所得粉末用石油醚超声脱脂，抽滤干燥，其中脱脂温度45℃，料液比1∶30，功率200W，脱脂时间60min，干燥后粉末过筛40目；
2)提取：称取5g柠檬籽粉末置于加热容器，加入体积分数为70％的乙醇加热温度80℃min，加热时间分别为30、60、90、120、150min，料液比1:10g/mL，过滤，得提取液。
准确量取所得的柠檬籽提取液5.0mL于10mL容量瓶中，依次加入0.4mL5％NaNO2溶液、0.4mL 10％Al(NO3)3溶液、4mL 4％NaOH溶液，每加一种试剂，静置10min，最后用70％乙醇定容，在510nm波长下测定其吸光度值，根据图1芦丁标准曲线计算总黄酮浓度以及提取率，加热时间对柠檬籽总黄酮提取率的影响结果见图2。
由图2得，提取率随着加热时间的延长，提取率先升高而后降低。当加热60min时，提取率达到最大值。因此，在其他因素不变的情况下，加热时间宜选择在60min附近。
实施例3
同实施例2，区别在于，加热时间60min，乙醇浓度70％，加热温度80℃，料液比分别为1:5、1:10、1:15、1:20、1:25，得提取液。
准确量取所得的柠檬籽提取液5.0mL于10mL容量瓶中，依次加入0.4mL 5％NaNO2溶液、0.4mL 10％Al(NO3)3溶液、4mL 4％NaOH溶液，每加一种试剂，静置10min，最后用70％乙醇定容，在510nm波长下测定其吸光度值，根据图1芦丁标准曲线计算总黄酮浓度以及提取率，料液比对柠檬籽总黄酮提取率的影响结果见图3。
由图3得，提取率随着乙醇用量的增大，先上升后下降。在本实施例中，提取率最大时，料液比为1:20，故在其他因素不变的情况下，料液比宜选择在1:20附近。
实施例4
同实施2区别在于加热时间60min，加热温度80℃，料液比1:20，乙醇浓度分别为60％、65％、70％、75％、80％，得提取液。
准确量取所得的柠檬籽提取液5.0mL于10mL容量瓶中，依次加入0.4mL 5％NaNO2溶液、0.4mL 10％Al(NO3)3溶液、4mL 4％NaOH溶液，每加一种试剂，静置10min，最后用70％乙醇定容，在510nm波长下测定其吸光度值，根据图1芦丁标准曲线计算总黄酮浓度以及提取率，乙醇浓度对柠檬籽总黄酮提取率的影响结果见图4。
由图4可得，提取率随着乙醇浓度的增大，提取率呈先增大后略微下降的趋势。在本实施例中，乙醇浓度70％时，提取率达到峰值。所以，在其他因素不变的情况下，宜选取70％得乙醇浓度。
实施例5
同实施2区别在于加热时间60min，料液比1∶20，乙醇浓度70％，加热温度分别为60、70、80、90、100℃，得提取液。
准确量取所得的柠檬籽提取液5.0mL于10mL容量瓶中，依次加入0.4mL 5％NaNO2溶液、0.4mL 10％Al(NO3)3溶液、4mL 4％NaOH溶液，每加一种试剂，静置10min，最后用70％乙醇定容，在510nm波长下测定其吸光度值，根据图1芦丁标准曲线计算总黄酮浓度以及提取率，料液比对柠檬籽总黄酮提取率的影响结果见图5。
由图5可得，不同温度对应的提取率有所差异。温度从60-80℃，随着温度的升高，分子运动加速，分子扩散和渗透能力加强，让柠檬籽内的黄酮溶出率增加，最终使得提取率升高。而当温度超过80℃，可能会破坏的黄酮的内部结构，致使提取率下降。同时，高温度可能也会对仪器造成损害，因此，在其他因素不变的情况下，宜选取在80℃附近。
实施例6
根据实施例2-5的单因素试验结构，结合实际，采用L9(34)正交表，进行加热时间、料液比、乙醇浓度和加热温度4因素3水平的正交试验，见表1。
表1正交试验的设计及结果
Figure BDA0002239655860000051
Figure BDA0002239655860000061
各因素对结果影响最大的水平如下：乙醇浓度75％、加热温度80℃、料液比为1:25、加热时间90min。同时，因加热时间的III型平方和最小，故其对整个试验的影响结果最小。以加热时间作为误差估计，运用SPSS软件重新分析，得方差分析表，见表2。
表2方差分析表
Figure BDA0002239655860000062
由表1和表2分析得，各个单因素对柠檬籽总黄酮提取率的影响从大到小分别为：乙醇浓度>加热温度>料液比>加热时间。另外，乙醇浓度和加热温度的p值小于0.05，说明有显著差异。搅拌热提取法的最佳工艺参数如下：乙醇浓度75％、加热温度80℃、料液比1:25、加热90min。在该条件下，柠檬籽总黄酮的提取率为4.480mg/g。按最佳工艺条件进行3次验证试验，结果显示，柠檬籽总黄酮提取率平均为4.3995mg/g，RSD为7.75％。
实施例7
将实施例2柠檬籽总黄酮提取液减压浓缩至0.642mg/mL，总上样量以30mL上样。每3mL收集一管流出液，第一管弃去，测黄酮浓度，绘制泄露曲线，当管内黄酮含量为初始黄酮浓度1/10时视作泄漏，得泄露曲线图6。由图6得，随着收集管数的增多，流出液中的黄酮浓度逐渐增大，当收集到第4管时，黄酮浓度达到初始浓度的1/10，树脂达到了泄漏点，当超过6管后黄酮浓度忽然增大，可能是树脂已基本达到饱和。因此，为避免黄酮样液浪费，选取10mL浓缩黄酮提取液，即6.40mg为柠檬籽总黄酮最佳上样量。
规定上样量6.40mg，研究上样浓度对柠檬籽总黄酮吸附率的影响，结果见图7，由图7得，不同上样浓度对应的吸附率有所差异。上样浓度在0.25-0.30mg/mL内，吸附率随上样浓度的增大而增加。而当上样浓度大于0.30mg/mL时，吸附率反而下降，可能是增多的杂质和黄酮发生竞争吸附，影响了大孔树脂对柠檬籽总黄酮的有效吸附，为了能够更充分地利用柠檬籽总黄酮，选取0.30mg/mL黄酮浓度进一步试验。
规定上样量6.40mg，上样浓度0.30mg/mL，吸附完全后，用水洗至流出液无色。紧接着就用准备好的45mL 80％的乙醇，以2mL/min流速洗脱。收集洗脱液，每3mL收集一管，测黄酮浓度，绘制洗脱曲线，结果见图8，由图8得，不同管数对应的黄酮浓度个别相差极大，部分相差不大。第一管到第七管，洗脱液中的黄酮浓度显著升高，第七管(21mL)时黄酮浓度最大。第七管之后，黄酮浓度逐渐降低，第十五管(45mL)时，黄酮浓度几乎为0，所以，选取洗脱用量45mL进行下一步试验。
规定上样量6.40mg，上样浓度为0.30mg/mL，洗脱量45mL，洗脱流速2mL/min，研究洗脱浓度对柠檬籽总黄酮回收率的影响，结果见图9，由图9得，随着乙醇浓度增加，回收率上升。但超过80％时，回收率迅速降低，这可能是由于D-101树脂为非极性树脂，乙醇溶液极性越小，对有效成分的解吸效果越好，而当乙醇浓度过大，解吸出的杂质也随之增加，使得回收率降低。因此选择80％乙醇进行后续试验。
规定上样量6.40mg，上样浓度0.30mg/mL，洗脱量45mL，洗脱浓度80％，研究洗脱流速对柠檬籽总黄酮回收率的影响，结果见图10，由图10得，当流速在1～5mL/min范围内，回收率稍微升高后逐渐减小。这可能是一定量洗脱剂，在洗脱太快的情况下，被树脂吸附的柠檬籽总黄酮因没有充足的时间溶解于洗脱剂当中而留在了树脂里，致使洗脱液中黄酮量不多，造成黄酮低回收率。然而，洗脱太慢的话，可能将杂质洗脱下来，同时洗脱时间较长，考虑生产成本与效率，选择2mL/min作为最佳洗脱速率。
根据上述单因素试验结果，从实际出发，采用L9(34)正交表，进行上样浓度、洗脱浓度和洗脱流速3因素3水平的正交试验，见表3：
表3正交试验的设计及结果
Figure BDA0002239655860000081
由表3分析得，各因素对结果影响最大的水平如下：上样浓度0.35mg/mL、乙醇浓度80％、洗脱速度1mL/min。同时，因洗脱速度的III型平方和最小，故其对整个试验的影响结果最小。以洗脱速度作为误差估计，运用SPSS软件重新分析，得方差分析表，见表4：
表4方差分析表
Figure BDA0002239655860000082
Figure BDA0002239655860000091
由表3和表4分析得，各个单因素对柠檬籽总黄酮纯化影响从大到小分别为：洗脱浓度>上样浓度>洗脱流速，其中洗脱浓度对柠檬籽总黄酮的纯化具有显著性。纯化柠檬籽总黄酮的参数如下：上样浓度0.35mg/mL、乙醇浓度80％、洗脱速度1mL/min。在该条件下，柠檬籽总黄酮类化合物的回收率为62.9％。按最佳工艺条件进行3次验证试验，结果显示，柠檬籽总黄酮回收率平均为67.3％，RSD为0.71％。
实施例8
将上述制备的柠檬籽总黄酮分别进行DPPH自由基清除率试验、OH·清除率试验、O2-·清除试验以及还原力试验等抗氧化实验，结果显示：
柠檬籽总黄酮有较好的清除DPPH自由基的作用。随着样品浓度增加，样品液对DPPH自由基的清除作用不断增强，但当样品浓度增加至0.008mg/mL后，清除率趋于平缓。当样品浓度为0.010mg/mL时，清除率最大，为78.60％。运用SPSS软件进行分析得，柠檬籽总黄酮样品液清除一半DPPH自由基时，其浓度为0.003mg/mL。
柠檬籽总黄酮对OH·有一定的清除作用。然而，OH·清除作用随着浓度的增加而减弱。本实施例中，当样品液浓度为0.0005mg/mL时，清除率最大，为71.01％。运用SPSS软件进行分析得，柠檬籽总黄酮样品液清除一半OH·时，其浓度为0.003mg/mL。
当柠檬籽总黄酮浓度在0.01-0.05mg/mL范围内，O2 -·清除率随样品浓度的增加而增加。并且，当样品浓度为0.05mg/mL时，清除率最大，为89.30％。运用SPSS软件进行分析得，柠檬籽总黄酮样品液清除一半O2 -·时，其浓度为0.024mg/mL。
在还原力测定试验中，A越大，说明还原力越强。随着样品浓度的增加，样品液黄酮还原力逐渐提高。本实施例中，样品浓度为0.05mg/mL时，还原力最大。
实施例9
1)前处理：取柠檬籽清洗干燥至恒重，粉碎，所得粉末用石油醚超声脱脂，抽滤干燥，其中脱脂温度45℃，料液比1∶30，功率200W，脱脂时间60min，干燥后粉末过筛40目；
2)提取：称取5g柠檬籽粉末置于加热容器，加入乙醇和乙酸乙酯混合液，其中乙醇和乙酸乙酯体积比为3∶1，加热温度80℃，加热时间60min，料液比1:20g/mL，过滤，得提取液。
准确量取所得的柠檬籽提取液5.0mL于10mL容量瓶中，依次加入0.4mL 5％NaNO2溶液、0.4mL 10％Al(NO3)3溶液、4mL 4％NaOH溶液，每加一种试剂，静置10min，最后用70％乙醇定容，在510nm波长下测定其吸光度值，根据图1芦丁标准曲线计算总黄酮浓度以及提取率，得柠檬籽总黄酮的提取率为4.953mg/g。
通过选用乙醇和乙酸乙酯混合溶剂作为柠檬籽总黄酮的提取剂，可以显著提高柠檬籽总黄酮的提取率。
实施例10
1)前处理：取柠檬籽清洗干燥至恒重，粉碎，所得粉末用石油醚超声脱脂，抽滤干燥，其中脱脂温度45℃，料液比1∶10，功率200W，脱脂时间60min，干燥后粉末过筛40目；
2)提取：称取5g柠檬籽粉末置于加热容器，加入70％乙醇溶液，加入溶液质量百分数5.0％的中性蛋白酶、1.0％的漆酶、0.5％的纤维素酶、0.5％的果胶酶，加热温度40℃，加热时间40min，料液比1:20g/mL，过滤，得提取液。
准确量取所得的柠檬籽提取液5.0mL于10mL容量瓶中，依次加入0.4mL 5％NaNO2溶液、0.4mL 10％Al(NO3)3溶液、4mL 4％NaOH溶液，每加一种试剂，静置10min，最后用70％乙醇定容，在510nm波长下测定其吸光度值，根据图1芦丁标准曲线计算总黄酮浓度以及提取率，得柠檬籽总黄酮的提取率为6.138mg/g。
柠檬籽总黄酮的提取主要受柠檬籽细胞壁及细胞质中大分子(蛋白质、纤维素、淀粉、果胶、木质素等)物质限制，在本实施例中中性蛋白酶能够高效水解蛋白酶，漆酶能够催化木质素类成分降解，纤维素酶能够催化水解纤维素，果胶酶具有针对果胶的解酯、水解、破裂作用，四种酶相互作用，从而显著提高柠檬籽总黄酮的提取率，而由于酶在高温下易失去活性，因此在复合酶制剂参与柠檬籽总黄酮提取过程中，温度不宜过高。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims (6)

1.一种水热提取柠檬籽总黄酮的提取纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)前处理：取柠檬籽清洗干燥至恒重，粉碎，所得粉末用石油醚超声脱脂，抽滤干燥；
2)提取：称取柠檬籽粉末置于加热容器中，加入体积分数为65-80％的乙醇，加热搅拌30-150min，加热温度60-100℃，料液比1:5-25g/mL，过滤，得提取液，减压浓缩；
3)分离纯化：称取预处理的大孔树脂，玻璃层析柱湿法装柱，上样量6.4mg、上样浓度0.250-0.450g/mL，吸附完全后，用水洗至流出液无色，然后用45mL 50-90％的乙醇，以1-5mL/min的洗脱流速洗脱，收集洗脱液即为纯化的柠檬籽总黄酮。
2.根据权利要求1所述的柠檬籽总黄酮的提取纯化方法，其特征在于，步骤1)中脱脂温度45℃，料液比1∶30，功率200W，脱脂时间60-90min，干燥后粉末过40目筛。
3.根据权利要求1所述的柠檬籽总黄酮的提取纯化方法，其特征在于，步骤2)中乙醇体积分数为70％，加热时间60min，加热温度80℃，料液比1∶20。
4.根据权利要求1所述的柠檬籽总黄酮的提取纯化方法，其特征在于，步骤3)中大孔树脂预处理方法：D-101大孔树脂，95％乙醇浸泡24h，蒸馏水洗至无醇味，然后用5％盐酸溶液浸泡12h，蒸馏水洗至中性；最后，用5％氢氧化钠溶液浸泡12h，用蒸馏水洗至中性，最终晾干，备用。
5.根据权利要求1所述的柠檬籽总黄酮的提取纯化方法，其特征在于，步骤3)中上样浓度0.35mg/mL，洗脱浓度80％，洗脱流速1mL/min。
6.一种根据权利要求1-5所述的柠檬籽总黄酮的提取纯化方法所提取出的柠檬籽总黄酮。
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