CN113041178A - 一种不含银杏酸的水溶性银杏叶提取物的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种不含银杏酸的水溶性银杏叶提取物的制备方法。首先采用浓度为10‑45%的乙醇对银杏叶进行多次浸提后,过滤、合并滤液并减压浓缩至无醇;其次采用纯水加热搅拌溶解、冷却静置、离心再膜过滤;再次上大孔吸附树脂柱,采用5‑30%的乙醇洗脱,洗脱液上脱酸树脂柱,浓缩、真空干燥制得粗品;最后采用浓度为90‑95%的乙醇对粗品加热回流后,经冷却、过滤,浓缩、干燥、粉碎,制得不含银杏酸的水溶性银杏叶提取物。本发明的制备方法能够有效提取不含银杏酸的淡黄色水溶性银杏叶提取物,该银杏叶提取物极易溶于水,水溶液颜色浅,长时间放置无沉淀析出,且能很好地清除自由基,抗氧化能力强,同时兼顾抑制酪氨酸酶的功效。
Description
技术领域
本发明属于银杏叶提取物的制备领域,尤其涉及一种不含银杏酸的水溶性银 杏叶提取物的制备方法。
背景技术
以银杏叶为原料制备的银杏叶标准提取物为棕色粉末,味苦,具有活血、化 瘀、通络、扩张血管、改善微循环等功效,因而广泛应用于心脑血管疾病患者的 治疗与康复。目前市场上银杏叶标准提取物的质量标准为银杏黄酮含量>24%, 银杏内酯>6%,银杏酸<10ppm。然而该类银杏叶标准提取物中含有银杏酸,其 具有强致敏性及细胞毒性等毒副作用,限制了其在美容产品中的应用;其次,该 类银杏叶标准提取物大约50%成分不溶于水,不利于配制化妆品;此外,该类银 杏叶提取物配制的化妆品颜色深,限制了其在化妆品中的添加量。
发明内容
发明目的:本发明的目的是提供一种能够用于化妆品、不含银杏酸的水溶性 银杏叶提取物的制备方法,该方法制备的银杏叶提取物不仅能很好地清除自由基, 抗氧化能力强,水溶性好,久置稳定,同时兼顾抑制酪氨酸酶的功效。
技术方案:本发明不含银杏酸的水溶性银杏叶提取物的制备方法,包括如下 步骤:
(1)采用浓度为10-45%的乙醇对银杏叶进行多次浸提后,过滤、合并滤液 并减压浓缩至无醇;
(2)采用纯水加热搅拌溶解、冷却至2-10℃,离心、经陶瓷膜过滤,采用 5-30%的乙醇洗脱,获得的洗脱液上脱酸树脂柱,浓缩、真空干燥制得粗品;
(3)采用浓度为90-95%的乙醇对粗品加热回流后,经冷却、过滤,浓缩、 干燥、粉碎,制得不含银杏酸的水溶性银杏叶提取物。
本发明的制备方法通过先采用低浓度的乙醇进行提取,浓缩、稀释后再冷却 至2-10℃,离心去杂、离心液陶瓷膜过滤,滤液随后上大孔吸附树脂柱,水洗去 杂后再采用低浓度的乙醇进行洗脱,最后将获得的低醇洗脱液上脱酸树脂柱进行 脱酸,通过这些步骤之间的环环相扣,进而能够有效制得不含银杏酸的水溶性银 杏叶提取物。
进一步说,步骤(1)中,所述多次浸提为两次浸提,先采用与银杏叶质量 体积比为1:7-10、浓度为10-45%的乙醇进行回流提取2-3h,再采用与银杏叶质 量体积比为1:5-10、浓度为10-45%的乙醇进行回流提取2-3h。
进一步说,步骤(2)中,所述加热搅拌溶解的温度为20-50℃,时间为30-60min。
进一步说,步骤(2)中,所述乙醇洗脱的流速为每小时1-3柱床体积。
进一步说,步骤(2)中,所述浓缩是经脱酸树脂柱后的流出液纳滤膜浓缩 至固体物含量10-20%,再真空浓缩至浸膏状。
进一步说,步骤(3)中,所述加热回流的温度为20-50℃,时间为30-60min。
再进一步说,本发明制备的水溶性银杏叶提取物中银杏黄酮醇质量分数为 4-10%,银杏总内酯质量分数为1.5-4%,银杏酸的质量分数为0。
更进一步说,本发明制备的水溶性银杏叶提取物应用于化妆品。
有益效果:与现有技术相比,本发明的显著优点为:该制备方法能够有效提 取不含银杏酸的水溶性淡黄色银杏叶提取物,该银杏叶提取物极易溶于水,能够 长时间放置无沉淀析出,且该银杏叶提取物不仅能很好地清除自由基,抗氧化能 力强,水溶性好,久置稳定,同时兼顾抑制酪氨酸酶功效,将其单独或与其他活 性物质合用,能赋予化妆品以消除炎症,抗花粉过敏,美白,抗蓝光等功效。
附图说明
图1为本发明制备的银杏叶提取物清除羟自由基的反应曲线图;
图2为本发明制备的银杏叶提取物清除DPPH自由基的反应曲线图;
图3为本发明制备的银杏叶提取物酪氨酸酶活能力的抑制反应曲线图。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明的技术方案做进一步详细说明。
实施例1
本发明不含银杏酸的水溶性银杏叶提取物的制备方法,包括如下步骤:
(1)浸提:将银杏绿叶烘干、粉碎,先加入与银杏叶质量体积比为1:7、浓 度为45%的乙醇回流提取3h,过滤;滤渣再加入质量体积比为1:5、浓度为45% 的乙醇回流提取3h,过滤,合并两次浸提的滤液,减压浓缩至无醇;
(2)柱色谱:加入质量比为1:3的纯水加热至50℃搅拌回流30min,冷却 至4℃,离心,将离心液经陶瓷膜过滤,滤液上大孔吸附树脂,水洗除杂后,采 用浓度为30%的乙醇进行洗脱,洗脱的流速为每小时1-3柱床体积;
(3)制备提取物:将洗脱获得的洗脱液上脱酸树脂柱,并将流出液纳滤膜 浓缩至固体物含量20%,再真空浓缩至浸膏状,真空干燥、粉碎,制得粗品;将 粗品加入浓度为95%的乙醇,在50℃条件下加热回流1h,冷却至室温,过滤后 将滤液真空浓缩、干燥、粉碎,制得不含银杏酸的水溶性银杏叶提取物,该银杏 叶提取物的收率为0.4%。
成品检测:该实施例制备的银杏叶提取物为淡黄色,易溶于水,水溶液澄清 透明。并且经HPLC检测,所含银杏黄酮醇为10%,银杏总内酯4%,银杏酸含 量为零。
性能检测
将上述制备的银杏叶提取物分别进行清除羟自由基能力、清除DPPH自由基 能力和抑制酪氨酸酶活能力性能检测,对应的试验方案如下所示。
一、清除羟自由基性能检测
(1)试验材料
试剂:PBS、硫酸亚铁铵、邻二氮菲、0.1%双氧水溶液,ddH2O。
仪器:紫外分光光度计、比色皿、移液皿、水浴锅、试管。
(2)测试方法:紫外分光光度法。
(3)试验步骤
表1试剂及其用量
所有试管依次加入上表中的试剂(双氧水最后一步加入),置于37℃水浴反 应1h,以1号试管溶液为参比,在536nm波长下分别测定2、3、4、5号试管溶 液的吸光度。以抗氧化剂VC作为阳性对照,每次实验进行三次平行,结果取平 均值。
清除率(%)=(A样-A样空-A损)/(A未损-A损);
其中,A样为加入受试物的羟基自由基体系(即Fe2+-邻二氮菲+双氧水+受试 物)的吸光度;
A样空为受试物的吸光度;
A损为加入双氧水的羟自由基体系(即Fe2+-邻氮二菲+双氧水)的吸光度;
A未损为不加入双氧水的羟自由基体系(即Fe2+-邻氮二菲溶液)的吸光度。
(4)试验结果
表2体外抗氧化作用
样品 | 浓度(mg/mL) | 抗氧化率(%) |
V<sub>C</sub> | 1.04 | 50.0 |
银杏叶提取物 | 2.5 | 99.3 |
银杏叶提取物 | 1.25 | 73.5 |
银杏叶提取物 | 0.625 | 60.3 |
银杏叶提取物 | 0.3125 | 49.9 |
根据表2的结果获得剂量-反应曲线,如图1所示。当浓度为2.5mg/mL时, 银杏叶提取物的羟自由基清除率能达到99.3%,且根据图1所示的剂量-反应曲 线可知,其EC50值为0.23mg/mL。由此可知,该银杏叶提取物能够较好地清除 自由基,抗氧化能力强。
二、清除DPPH自由基性能检测
(1)试验材料
待测样品银杏叶提取物,维他命E溶解于无水乙醇溶液。用无水乙醇制备0.1mMDPPH溶液,4℃保存备用。
(2)实验步骤
样品组:在试管中分别依次加入1mL DPPH溶液和0.5mL不同浓度的待测 样品,混匀后黑暗处放置60min,将上述溶液转移至比色皿中,以无水乙醇为基 准(调零)在517nm波长处测吸光值,吸光值记为A1;
空白对照:在试管中分别依次加入1mL无水乙醇和0.5mL不同浓度的待测 样品,黑暗处放置60min,将上述溶液转移至比色皿中,以无水乙醇为基准(调 零)在517nm波长处测吸光值,吸光值记为A2;
控制组:在试管中加入1mL DPPH溶液和0.5mL无水乙醇,混匀后黑暗处 放置60min,将上述溶液转移至比色皿中,以无水乙醇为基准(调零)在517nm 波长处测吸光值,吸光值记为A0。
根据以下自由基清除率公式计算(K):
K(%)=[1-(A1-A2)/A0]*100%
试验重复三次,取其平均值作为最后结果。
(3)试验结果
表3体外抗氧化作用
样品 | 浓度(mg/mL) | 抗氧化率(%) |
VE | 0.0431 | 91.5 |
银杏叶提取物 | 0.040 | 94.6 |
银杏叶提取物 | 0.025 | 84.9 |
银杏叶提取物 | 0.020 | 69.5 |
银杏叶提取物 | 0.010 | 55.7 |
银杏叶提取物 | 0.0050 | 36.2 |
银杏叶提取物 | 0.0025 | 28.1 |
根据表3获得的剂量-反应曲线如图2所示。根据该图2可知,VE在浓度为0.0431mg/mL时的DPPH自由基清除率为91.5%,当浓度为0.040mg/mL时,银 杏叶提取物的DPPH自由基清除率为94.6%,,且其EC50值为0.0079mg/ml。由 此可知,本发明制备的银杏叶提取物对DPPH(1,1-二苯基-2-三硝基苯肼)的清除 能力强于油溶性维生素E。
(三)抑制蘑菇酪氨酸酶活性能检测
(1)试验材料
仪器:水浴锅、ELX808酶标仪、移液枪、EP管、试管、枪头。
试剂:磷酸缓冲液(PB)、蘑菇酪氨酸酶、L-左旋多巴标准溶液、银杏叶提 取物。用PB溶液稀释银杏叶提取物。
(2)试验方法
用移液枪移取40μL浓度为5mmol/L的L-左旋多巴到96孔板中,加入40μL 待测银杏叶提取物,加入80μL的磷酸缓冲液,37℃温育10min,最后加入40μL 酪氨酸酶,温育5-10min,迅速在酶标仪490nm下测定吸光度。每个浓度设置 三个平行:设置空白组(不加酪氨酸酶,以死酶代替)和控制组(不加样品,以 磷酸缓冲液代替)。
酪氨酸酶活性抑制率/%=(1-Ai/Ao)×100%
其中,Ao:控制组扣掉空白组的吸光度;
Ai:样品组扣掉空白组的吸光度;
至少测定3个浓度下的抑制酪氨酸酶活能力,经数据拟合后计算出IC50。IC50越小,则抑制酪氨酸酶能力越强。
(3)试验结果
表4酪氨酸酶酶活抑制率
样品 | 浓度(mg/mL) | 酪氨酸酶抑制率(%) |
银杏叶提取物 | 2.00 | 77.1 |
银杏叶提取物 | 1.60 | 84.8 |
银杏叶提取物 | 1.20 | 74.1 |
银杏叶提取物 | 0.8 | 58.8 |
银杏叶提取物 | 0.4 | 35.3 |
银杏叶提取物 | 0.2 | 24.6 |
由表4获得的对蘑菇酪氨酸酶的酶活抑制率剂量-反应曲线如图3所示。根 据表4可知,当浓度为1.60mg/ml时,银杏叶提取物对酪氨酸酶酶活抑制率可 以达到84.8%,并且根据剂量-反应曲线计算可得,IC50值为0.564mg/ml。表明, 银杏叶提取物具有较好的美白功效。
综上所述,本发明提取的银杏叶提取物不仅能很好地清除自由基,抗氧化能 力强,水溶性好,久置稳定,同时兼顾抑制酪氨酸酶功效,其能够更安全地应用 于化妆品中。
实施例2
本发明不含银杏酸的水溶性银杏叶提取物的制备方法,包括如下步骤:
(1)浸提:将银杏绿叶烘干、粉碎,先加入质量体积比为1:8、浓度为40% 的乙醇回流提取2.5h,过滤;再加入质量体积比为1:6、浓度为40%的乙醇回流 提取2.5h,过滤,合并两次浸提的滤液,减压浓缩至无醇;
(2)柱色谱:加入质量比为1:4的纯水加热至30℃搅拌回流40min,冷却 至2℃离心,将离心液经陶瓷膜过滤,滤液上大孔吸附树脂,水洗除杂后,采用 浓度为25%的乙醇进行洗脱,洗脱的流速为每小时1-3柱床体积;
(3)制备提取物:将洗脱获得的洗脱液上脱酸树脂柱,并将流出液纳滤膜 浓缩至固体物含量15%,再真空浓缩至浸膏状,真空干燥、粉碎,制得粗品;将 粗品加入浓度为93%的乙醇,加热至30℃回流0.5h,冷却至室温,过滤后将滤 液真空浓缩、干燥、粉碎,制得不含银杏酸的水溶性银杏叶提取物,该银杏叶提 取物的收率为0.35%。
成品检测:该实施例制备的银杏叶提取物为淡黄色,易溶于水,水溶液澄清 透明。并且经HPLC检测,所含银杏黄酮醇为7.4%,银杏总内酯3.8%,银杏酸 含量为零。
实施例3
本发明不含银杏酸的水溶性银杏叶提取物的制备方法,包括如下步骤:
(1)浸提:将银杏绿叶烘干、粉碎,先加入质量体积比为1:9、浓度为30% 的乙醇回流提取2h,过滤;再加入质量体积比为1:7、浓度为30%的乙醇回流提 取2h,过滤,合并两次浸提的滤液,减压浓缩至无醇;
(2)柱色谱:加入质量比为1:5的纯水加热至20℃搅拌回流50min,冷却 至6℃,离心,将离心液经陶瓷膜过滤,滤液上大孔吸附树脂,水洗除杂后,采 用浓度为20%的乙醇进行洗脱,洗脱的流速为每小时1-3柱床体积;
(3)制备提取物:将洗脱获得的洗脱液上脱酸树脂柱,并将流出液纳滤膜 浓缩至固体物含量18%,再真空浓缩至浸膏状,真空干燥、粉碎,制得粗品;将 粗品加入浓度为91%的乙醇,加热至20℃回流0.5h,冷却至室温,过滤后将滤 液真空浓缩、干燥、粉碎,制得不含银杏酸的水溶性银杏叶提取物,该银杏叶提 取物的收率为0.3%。
成品检测:该实施例制备的银杏叶提取物为淡黄色,易溶于水,水溶液澄清 透明。并且经HPLC检测,所含银杏黄酮醇为6.3%,银杏总内酯3.2%,银杏酸 含量为零。
实施例4
本发明不含银杏酸的水溶性银杏叶提取物的制备方法,包括如下步骤:
(1)浸提:将银杏绿叶烘干、粉碎,先加入质量体积比为1:10、浓度为20% 的乙醇回流提取2h,过滤;再加入质量体积比为1:10、浓度为20%的乙醇回流 提取2h,过滤,合并两次浸提的滤液,减压浓缩至无醇;
(2)柱色谱:加入质量比为1:5的纯水加热至20℃搅拌回流60min,冷却 至8℃,离心,将离心液经陶瓷膜过滤,滤液上大孔吸附树脂,水洗除杂后,采 用浓度为15%的乙醇进行洗脱,洗脱的流速为每小时1-3柱床体积;
(3)制备提取物:将洗脱获得的洗脱液上脱酸树脂柱,并将流出液纳滤膜 浓缩至固体物含量15%,再真空浓缩至浸膏状,真空干燥、粉碎,制得粗品;将 粗品加入浓度为90%的乙醇,加热至20℃回流0.5h,冷却至室温,过滤后将滤 液真空浓缩、干燥、粉碎,制得不含银杏酸的水溶性银杏叶提取物,该银杏叶提 取物的收率为0.25%。
成品检测:该实施例制备的银杏叶提取物为淡黄色,易溶于水,水溶液澄清 透明。并且经HPLC检测,所含银杏黄酮醇为5.1%,银杏总内酯2.0%,银杏酸 含量为零。
实施例5
本发明不含银杏酸的水溶性银杏叶提取物的制备方法,包括如下步骤:
(1)浸提:将银杏绿叶烘干、粉碎,先加入质量体积比为1:10、浓度为10% 的乙醇回流提取2h,过滤;再加入质量体积比为1:5、浓度为10%的乙醇回流提 取2h,过滤,合并两次浸提的滤液,减压浓缩至无醇;
(2)柱色谱:加入质量比为1:5的纯水加热至20℃搅拌回流60min,冷却 至10℃,离心,将离心液经陶瓷膜过滤,滤液上大孔吸附树脂,水洗除杂后, 采用浓度为10%的乙醇进行洗脱,洗脱的流速为每小时1-3柱床体积;
(3)制备提取物:将洗脱获得的洗脱液上脱酸树脂柱,并将流出液纳滤膜 浓缩至固体物含量10%,再真空浓缩至浸膏状,真空干燥、粉碎,制得粗品;将 粗品加入浓度为90%的乙醇,加热至20℃回流0.5h,冷却至室温,过滤后将滤 液真空浓缩、干燥、粉碎,制得不含银杏酸的水溶性银杏叶提取物,该银杏叶提 取物的收率为0.2%。
成品检测:该实施例制备的银杏叶提取物为淡黄色,易溶于水,水溶液澄清 透明。并且经HPLC检测,所含银杏黄酮醇为4%,银杏总内酯1.5%,银杏酸含 量为零。
通过上述实施例可知,本发明的制备方法能够有效提取不含银杏酸的水溶性 淡黄色银杏叶提取物,将其单独或与其他活性物质合用,能赋予化妆品以消除炎 症,抗花粉过敏,美白,抗蓝光等功效。
Claims (8)
1.一种不含银杏酸的水溶性银杏叶提取物的制备方法,其特征在于包括如下步骤:
(1)采用浓度为10-45%的乙醇对银杏叶进行多次浸提后,过滤、合并滤液并减压浓缩至无醇;
(2)采用纯水加热搅拌溶解、冷却至2-10℃,离心、经陶瓷膜过滤,采用5-30%的乙醇洗脱,获得的洗脱液上脱酸树脂柱,浓缩、真空干燥制得粗品;
(3)采用浓度为90-95%的乙醇对粗品加热回流后,经冷却、过滤,浓缩、干燥、粉碎,制得不含银杏酸的水溶性银杏叶提取物。
2.根据权利要求1所述不含银杏酸的水溶性银杏叶提取物的制备方法,其特征在于:步骤(1)中,所述多次浸提为两次浸提,先采用与银杏叶质量体积比为1:7-10、浓度为10-45%的乙醇进行回流提取2-3h,再采用与银杏叶质量体积比为1:5-10、浓度为10-45%的乙醇进行回流提取2-3h。
3.根据权利要求1所述不含银杏酸的水溶性银杏叶提取物的制备方法,其特征在于:步骤(2)中,所述加热搅拌溶解的温度为20-50℃,时间为30-60min。
4.根据权利要求1所述不含银杏酸的水溶性银杏叶提取物的制备方法,其特征在于:步骤(2)中,所述乙醇洗脱的流速为每小时1-3柱床体积。
5.根据权利要求1所述不含银杏酸的水溶性银杏叶提取物的制备方法,其特征在于:步骤(2)中,所述浓缩是经脱酸树脂柱后的流出液纳滤膜浓缩至固体物含量10-20%,再真空浓缩至浸膏状。
6.根据权利要求1所述不含银杏酸的水溶性银杏叶提取物的制备方法,其特征在于:步骤(3)中,所述加热回流的温度为20-50℃,时间为30-60min。
7.根据权利要求1所述不含银杏酸的水溶性银杏叶提取物的制备方法,其特征在于:制备的所述水溶性银杏叶提取物中银杏黄酮醇质量分数为4-10%,银杏总内酯质量分数为1.5-4%,银杏酸的质量分数为0。
8.根据权利要求7所述不含银杏酸的水溶性银杏叶提取物的制备方法,其特征在于:所述水溶性银杏叶提取物应用于化妆品。
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