CN111961024B - 一种制备表没食子儿茶素没食子酸酯的方法及其在抗糖产品中的应用 - Google Patents

一种制备表没食子儿茶素没食子酸酯的方法及其在抗糖产品中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及化学纯化技术领域，具体涉及一种制备表没食子儿茶素没食子酸酯的方法及其在抗糖产品中的应用，所述方法包括如下步骤：1)用水溶解茶多酚粗品，过滤，得到茶多酚溶液；2)将茶多酚溶液浓缩，用溶剂A进行萃取，收集有机层，浓缩干燥，用水溶解，得到混合溶液；3)将混合溶液加入层析柱中，以溶剂B作为流动相进行洗脱，收集洗脱液；4)利用大孔吸附树脂对洗脱液进行吸附，采用溶剂C进行洗脱，收集洗脱液，减压浓缩后，进行冷冻干燥，即得。本发明具有收率和纯度高、制备工艺简单、成本低的优点。

Description

一种制备表没食子儿茶素没食子酸酯的方法及其在抗糖产品 中的应用
技术领域
本发明涉及化学纯化技术领域，具体涉及一种制备表没食子儿茶素没食子酸酯的方法及其在抗糖产品中的应用。
背景技术
茶多酚(Green Tea Polyphenols，简写为GTP)，是茶叶中主要的活性成分之一，为茶叶中多羟基酚类化合物的复合物，由30种以上的酚类物质组成，其主体成分是儿茶素及其衍生物，是茶叶中具有保健功能的主要化学成分。茶多酚具有抗氧化、防辐射、抗衰老、降血脂、降血糖、抑菌抑酶等多种生理活性。
茶多酚中儿茶素类物质约占60-80％，而其中表没食子儿茶素没食子酸酯(简称EGCG)含量最高，约占儿茶素的50-60％。EGCG具备抗菌、抗病毒、抗氧化、抗衰老、修复电离辐射造成的皮肤损伤、降血脂、降血糖、抗癌、抑制心血管疾病等众多活性特征。
关于提纯制备EGCG的研究，主要还是以葡聚糖凝胶层析、色谱、树脂分离为主。原理是利用儿茶素各单体之间的性质差异，选择不同的吸脱附剂，使之得到分离。
例如中国专利申请CN101386614A公开了一种树脂吸附法制备表没食子儿茶素没食子酸酯的方法，利用吸附分离高分子材料对各儿茶素单体及色素吸附选择性的不同，进行柱色谱分离，并结合膜分离技术、凝胶色谱分离技术制备高纯度EGCG单体。
汪健等报道将粗制的茶多酚溶于未饱和的食盐水中，除去沉渣，然后再加食盐析出多酚类物质，再用乙醚抽提，冷冻干燥后可制得纯品(适用技术荟萃(工业)，1998：15)。严明潮、罗明志研究了盐析对儿茶素提取的影响。盐析纯化儿茶素的工艺流程为：茶多酚粗提液-盐析-过滤-(滤液)乙酸乙酯萃取回收-浓缩-干燥-成品。该研究发现：在乙酸乙酯萃取前的茶汤中作盐析处理，可对儿茶素制品的化学组成产生影响。在较低浓度(NaCl<5％)时，适当增加盐浓度有利于酯溶性儿茶素(如EGCG)及儿茶素总量的提高，但达到一定的盐浓度后，浓度的增加则不利于儿茶素纯度的提高(中国茶叶，1999，(4)：29～29)。
中国专利申请CN1367171A公开了一种高含量EGCG儿茶素的提取方法，经过一系列惰性溶剂多步逆流萃取后，调整溶液的pH值在2.5～7.5之间，进行二价或三价金属盐沉淀反应，沉淀经过滤、热水洗涤和酸溶后，用乙酸乙酯萃取，萃取的有机溶剂相进行水洗脱酸、减压浓缩、重结晶的结晶物经过滤、冷冻双重水洗涤，最后进行冷冻干燥。儿茶素中EGCg有效含量达90％以上，可直接用于药物原料。
上述方法在一定程度上提供了获得高纯度EGCG的技术，但是还存在一些问题，比如，如何同时提高EGCG的收率和纯度；如何降低制备成本；如何减少废液的产生，结果导致EGCG国际价格一直居高不下。
糖化反应是指体内没有被消耗掉的糖和蛋白质相互作用进行糖化反应产生AGEs(糖化终产物)的过程。蛋白质是生命基础，它存在于皮肤、肌肉、血管等全身各个部位，正常成年人身体中有60％是水分，17-18％是由蛋白质构成，而紧致的皮肤则是由真皮层中的胶原蛋白和弹性蛋白构成的。一旦滞留体内的糖分与这些蛋白质结合，就会形成劣质蛋白质AGEs。糖化过后的胶原蛋白与弹性蛋白将无法正常发挥作用，以致皮肤逐渐松弛。此外，真皮层的糖化会使皮肤逐渐变黄，角质层糖化后，肌肤的保湿能力也会下降，导致肌肤干燥、暗黄。除此之外，AGEs还会诱发炎症反应，减少细胞增殖、增加凋亡和衰老，并且会和光老化互相交叉协作，加速皮肤的衰老过程。而且，AGEs还会导致糖尿病、心脑血管病、肾病、免疫力低下等疾病的产生。
因此，利用开发一种能解决上述技术问题的制备表没食子儿茶素没食子酸酯的方法及其在抗糖产品中的应用是非常必要的。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足而提供一种收率和纯度高、制备工艺简单、成本低的制备表没食子儿茶素没食子酸酯的方法，及其制备得到的表没食子儿茶素没食子酸酯在抗糖产品中的应用，抗糖效果显著。
本发明是通过以下技术方案予以实现的：
一种制备表没食子儿茶素没食子酸酯的方法，包括如下步骤：
1)用水溶解茶多酚粗品，过滤，得到茶多酚溶液；
2)将茶多酚溶液浓缩，用溶剂A进行萃取，收集有机层，浓缩干燥，用水溶解，得到混合溶液；
3)将混合溶液加入层析柱中，以溶剂B作为流动相进行洗脱，收集洗脱液；
4)利用大孔吸附树脂对洗脱液进行吸附，采用溶剂C进行洗脱，收集洗脱液，减压浓缩后，进行冷冻干燥，即得。
优选地，步骤1)中所述茶多酚粗品与水的质量体积比为1:30-80g/mL。
优选地，步骤1)中所述溶解的温度为30-70℃，时间为1-2h。
优选地，步骤2)中所述茶多酚溶液浓缩至茶多酚粗品的2-10倍量。
优选地，步骤2)中所述溶剂A为茶多酚粗品的4-10倍量。
优选地，步骤2)中所述水为茶多酚粗品的4-10倍量。
优选地，步骤2)中所述溶剂A为乙酸乙酯、异丙醇和正丁醇的混合溶剂。
更优选地，所述乙酸乙酯、异丙醇和正丁醇的体积比为1-3:1-2:1。
优选地，步骤3)中所述层析柱吸附采用的树脂为HP-20、HPD-600、PA、LX-8、RS-24中的一种。
优选地，步骤3)中所述溶剂B洗脱的流速为1-2BV/h，洗脱的体积为4-6BV。
优选地，步骤3)中所述溶剂B为40-60％乙醇与丙酮的混合溶剂。
更优选地，40-60％乙醇与丙酮的体积比为2-4:1。
优选地，步骤4)中所述大孔吸附树脂为HPD450树脂、AB-8树脂、D180树脂中的一种，进一步优选AB-8树脂。
优选地，步骤4)中所述溶剂C为45-60％乙醇溶液。
优选地，步骤4)中所述溶剂C洗脱体积控制在1-3BV，洗脱流速为0.8-2BV/h。
优选地，所述方法包括如下步骤：
1)用水溶解茶多酚粗品，茶多酚粗品与水的质量体积比为1:30-80g/mL，溶解温度30-70℃，溶解时间为1-2h，过滤，得到茶多酚溶液；
2)将茶多酚溶液浓缩至茶多酚粗品的2-10倍量，用茶多酚粗品4-10倍量的溶剂A进行萃取，收集有机层，浓缩干燥，用茶多酚粗品4-10倍量的水溶解，得到混合溶液；
3)将混合溶液加入层析柱中，以溶剂B作为流动相进行洗脱，洗脱的流速为1-2BV/h，洗脱的体积为4-6BV，收集洗脱液；
4)利用大孔吸附树脂对洗脱液进行吸附，采用溶剂C进行洗脱，洗脱体积控制在1-3BV，洗脱流速为0.8-2BV/h，收集洗脱液，减压浓缩后，进行冷冻干燥，即得。
本发明还涉及一种抗糖产品，包括上述的方法制备得到的表没食子儿茶素没食子酸酯。
所述抗糖产品包括如下组分：白芸豆提取物，L-阿拉伯糖，表没食子儿茶素没食子酸酯，苦荞提取物，紫花苜蓿提取物，酵母抽提物。
优选地，所述抗糖产品按照重量份数计，包括如下组分：白芸豆提取物20-50份，L-阿拉伯糖5-30份，表没食子儿茶素没食子酸酯3-8份，苦荞提取物5-10份，紫花苜蓿提取物10-20份，酵母抽提物5-10份。
优选地，所述抗糖产品还包括调味剂0.1-2份。
更优选地，所述调味剂包括柠檬酸钠、柠檬酸、食用香精、三氯蔗糖中的至少一种。
优选地，所述L-阿拉伯糖、表没食子儿茶素没食子酸酯与酵母抽提物的质量比为2-4:0.5-1.5:1。
本发明还涉及上述抗糖产品的制备方法，包括如下步骤：
(1)将酵母抽提物，L-阿拉伯糖和表没食子儿茶素没食子酸酯混合，得物质1；
(2)将苦荞提取物，紫花苜蓿提取物和白芸豆提取物混合，得物质2；
(3)将物质1、物质2与调味剂混合，即得。
本发明的有益效果是：
本发明依次对茶多酚溶液进行萃取和多次吸附，并优化了溶剂A、B、C的组成以及具体的洗脱条件，显著提高了表没食子儿茶素没食子酸酯的收率和纯度。
本发明制备得到的表没食子儿茶素没食子酸酯用于制备抗糖产品，效果显著。
本发明的白芸豆提取物、苦荞提取物和紫花苜蓿提取物，三者之间协同作用，显著提高了产品的抗糖作用。
本发明的L-阿拉伯糖、表没食子儿茶素没食子酸酯与酵母抽提物共同作用，并优化了三者的配比，显著提高了产品的抗糖作用。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
本发明各实施例和对比例中的茶多酚粗品购自江苏天晟药业股份有限公司。
本发明各实施例和对比例中的白芸豆提取物购自美国Pharmachem公司的
Figure BDA0002658851300000041
品牌，苦荞提取物购自陕西新天域生物科技有限公司，紫花苜蓿提取物购自陕西斯诺特生物技术有限公司，酵母抽提物购自安琪酵母股份有限公司。
实施例1
一种制备表没食子儿茶素没食子酸酯的方法，包括如下步骤：
1)用水溶解茶多酚粗品，茶多酚粗品与水的质量体积比为1:30g/mL，溶解温度30℃，溶解时间为1h，过滤，得到茶多酚溶液；
2)将茶多酚溶液浓缩至茶多酚粗品的2倍量，用茶多酚粗品4倍量的溶剂A进行萃取，收集有机层，浓缩干燥，用茶多酚粗品4倍量的水溶解，得到混合溶液；
3)将混合溶液加入HP-20层析柱中，以溶剂B作为流动相进行洗脱，洗脱的流速为1BV/h，洗脱的体积为4BV，收集洗脱液；
4)利用HPD450树脂大孔吸附树脂对洗脱液进行吸附，采用45％乙醇溶液进行洗脱，洗脱体积控制在1BV，洗脱流速为0.8BV/h，收集洗脱液，减压浓缩后，进行冷冻干燥，即得。
溶剂A为乙酸乙酯、异丙醇和正丁醇的混合溶剂，乙酸乙酯、异丙醇和正丁醇的体积比为1:1:1；
溶剂B为40％乙醇与丙酮的混合溶剂，40％乙醇与丙酮的体积比为2:1。
一种抗糖产品，按照重量份数计，包括如下组分：白芸豆提取物20份，L-阿拉伯糖5份，表没食子儿茶素没食子酸酯3份，苦荞提取物5份，紫花苜蓿提取物10份，酵母抽提物5份，柠檬酸钠0.1份。
抗糖产品的制备方法，包括如下步骤：
(1)将酵母抽提物，L-阿拉伯糖和表没食子儿茶素没食子酸酯混合，得物质1；
(2)将苦荞提取物，紫花苜蓿提取物和白芸豆提取物混合，得物质2；
(3)将物质1、物质2与柠檬酸钠混合，即得。
实施例2
一种制备表没食子儿茶素没食子酸酯的方法，包括如下步骤：
1)用水溶解茶多酚粗品，茶多酚粗品与水的质量体积比为1:80g/mL，溶解温度70℃，溶解时间为2h，过滤，得到茶多酚溶液；
2)将茶多酚溶液浓缩至茶多酚粗品的10倍量，用茶多酚粗品10倍量的溶剂A进行萃取，收集有机层，浓缩干燥，用茶多酚粗品10倍量的水溶解，得到混合溶液；
3)将混合溶液加入RS-24层析柱中，以溶剂B作为流动相进行洗脱，洗脱的流速为2BV/h，洗脱的体积为6BV，收集洗脱液；
4)利用D180大孔吸附树脂对洗脱液进行吸附，采用60％乙醇溶液进行洗脱，洗脱体积控制在3BV，洗脱流速为2BV/h，收集洗脱液，减压浓缩后，进行冷冻干燥，即得。
溶剂A为乙酸乙酯、异丙醇和正丁醇的混合溶剂，乙酸乙酯、异丙醇和正丁醇的体积比为3:2:1；
溶剂B为60％乙醇与丙酮的混合溶剂，60％乙醇与丙酮的体积比为4:1。
一种抗糖产品，按照重量份数计，包括如下组分：白芸豆提取物50份，L-阿拉伯糖30份，表没食子儿茶素没食子酸酯8份，苦荞提取物10份，紫花苜蓿提取物20份，酵母抽提物10份，三氯蔗糖2份。
抗糖产品的制备方法，包括如下步骤：
(1)将酵母抽提物，L-阿拉伯糖和表没食子儿茶素没食子酸酯混合，得物质1；
(2)将苦荞提取物，紫花苜蓿提取物和白芸豆提取物混合，得物质2；
(3)将物质1、物质2与三氯蔗糖混合，即得。
实施例3
一种制备表没食子儿茶素没食子酸酯的方法，包括如下步骤：
1)用水溶解茶多酚粗品，茶多酚粗品与水的质量体积比为1:55g/mL，溶解温度50℃，溶解时间为1.5h，过滤，得到茶多酚溶液；
2)将茶多酚溶液浓缩至茶多酚粗品的6倍量，用茶多酚粗品7倍量的溶剂A进行萃取，收集有机层，浓缩干燥，用茶多酚粗品7倍量的水溶解，得到混合溶液；
3)将混合溶液加入HPD-600层析柱中，以溶剂B作为流动相进行洗脱，洗脱的流速为1.5BV/h，洗脱的体积为5BV，收集洗脱液；
4)利用AB-8大孔吸附树脂对洗脱液进行吸附，采用55％乙醇溶液进行洗脱，洗脱体积控制在2BV，洗脱流速为1.4BV/h，收集洗脱液，减压浓缩后，进行冷冻干燥，即得。
溶剂A为乙酸乙酯、异丙醇和正丁醇的混合溶剂，乙酸乙酯、异丙醇和正丁醇的体积比为2:1.5:1；
溶剂B为50％乙醇与丙酮的混合溶剂，50％乙醇与丙酮的体积比为3:1。
一种抗糖产品，按照重量份数计，包括如下组分：白芸豆提取物35份，L-阿拉伯糖18份，表没食子儿茶素没食子酸酯5份，苦荞提取物7份，紫花苜蓿提取物15份，酵母抽提物8份，三氯蔗糖1份。
抗糖产品的制备方法，包括如下步骤：
(1)将酵母抽提物，L-阿拉伯糖和表没食子儿茶素没食子酸酯混合，得物质1；
(2)将苦荞提取物，紫花苜蓿提取物和白芸豆提取物混合，得物质2；
(3)将物质1、物质2与三氯蔗糖混合，即得。
对比例1
与实施例3的区别仅在于溶剂A的体积不变，组成不同，乙酸乙酯、异丙醇和正丁醇的体积比为0.5:3:1，其余条件均相同。
对比例2
与实施例3的区别仅在于溶剂A的体积不变，组成不同，为乙酸乙酯，其余条件均相同。
对比例3
与实施例3的区别仅在于溶剂B的组成不同，50％乙醇与丙酮的体积比为1:1，其余条件均相同。
对比例4
与实施例3的区别仅在于55％乙醇溶液替换为等体积的30％乙醇溶液，其余条件均相同。
对比例5
与实施例3的区别仅在于表没食子儿茶素没食子酸酯制备过程中树脂的提取顺序不同，其余条件均相同，具体如下：
一种制备表没食子儿茶素没食子酸酯的方法，包括如下步骤：
1)用水溶解茶多酚粗品，茶多酚粗品与水的质量体积比为1:55g/mL，溶解温度50℃，溶解时间为1.5h，过滤，得到茶多酚溶液；
2)将茶多酚溶液浓缩至茶多酚粗品的6倍量，用茶多酚粗品7倍量的溶剂A进行萃取，收集有机层，浓缩干燥，用茶多酚粗品7倍量的水溶解，得到混合溶液；
3)利用AB-8大孔吸附树脂对混合溶液进行吸附，采用55％乙醇溶液进行洗脱，洗脱体积控制在2BV，洗脱流速为1.4BV/h，收集洗脱液；
4)将洗脱液加入HPD-600层析柱中，以溶剂B作为流动相进行洗脱，洗脱的流速为1.5BV/h，洗脱的体积为5BV，收集洗脱液；减压浓缩后，进行冷冻干燥，即得。
对比例6
与实施例3的区别仅在于抗糖产品组成不同，白芸豆提取物35份，苦荞提取物7份，紫花苜蓿提取物15份替换为白芸豆提取物42.5份，苦荞提取物14.5份，其余条件均相同。
对比例7
与实施例3的区别仅在于抗糖产品组成不同，白芸豆提取物35份，苦荞提取物7份，紫花苜蓿提取物15份替换为紫花苜蓿提取物57份，其余条件均相同。
对比例8
与实施例3的区别仅在于L-阿拉伯糖、表没食子儿茶素没食子酸酯与酵母抽提物的总质量不变，质量比不同，为0.4:2:1，其余条件均相同。
测试例1
实施例1-3和对比例1-5制备得到的表没食子儿茶素没食子酸酯的收率和纯度测试，结果如表1所示。
表1表没食子儿茶素没食子酸酯的收率和纯度测试结果
Figure BDA0002658851300000071
Figure BDA0002658851300000081
测试例2
实施例1-3和对比例6-8抗糖产品的抗糖效果测试。具体测试方法如下：
参考现有技术中检测的方法，建立BSA-fructose模拟反应体系，具体参照Phytochemicals from berries and grapes inhibited the formation of advancedglycation end-products by scavenging reactive carbonyls。将用磷酸缓冲液(50mmol/L，pH7.4，含有0.02％的叠氮化钠)溶解的1mL1.5mmol/L果糖和1mL抗糖产品溶液混合，在37℃生化培养箱中孵育2h后加入1mL30mg/mL BSA，在37℃条件下反应6d。根据抗糖产品的选择，分别设置实施例组、对比例组和对照组，实施例组分别加入实施例1-3的抗糖产品溶液(所述的组合物为经过本领域常规的溶解手段处理)，质量浓度设置15μg/mL；对比例组分别加入对比例6-8的抗糖产品溶液(所述的组合物为经过本领域常规的溶解手段处理)，质量浓度设置15μg/mL；以不加抑制剂的1mL的缓冲液为空白对照组，同质量浓度的氨基胍为阳性对照组。孵育结束后利用AGEs的荧光性质，在激发波长370nm、发射波长440nm调节下测定体系的荧光强度，以荧光强度AU表示AGEs含量。
AGEs抑制率(％)＝(1-实验组荧光强度/空白对照组荧光强度)*100％。
结果如表2所示。
表2抗糖产品的抗糖效果测试结果
Figure BDA0002658851300000082
Figure BDA0002658851300000091
上述详细说明是针对本发明其中之一可行实施例的具体说明，该实施例并非用以限制本发明的专利范围，凡未脱离本发明所为的等效实施或变更，均应包含于本发明技术方案的范围内。

Claims (6)

1.一种抗糖产品，其特征在于，所述抗糖产品按照重量份数计，包括如下组分：白芸豆提取物35份，L-阿拉伯糖18份，表没食子儿茶素没食子酸酯5份，苦荞提取物7份，紫花苜蓿提取物15份，酵母抽提物8份；
所述白芸豆提取物购自美国Pharmachem公司的Phase2®品牌，所述苦荞提取物购自陕西新天域生物科技有限公司，所述紫花苜蓿提取物购自陕西斯诺特生物技术有限公司，所述酵母抽提物购自安琪酵母股份有限公司；
所述表没食子儿茶素没食子酸酯的制备方法，包括如下步骤：
1）用水溶解茶多酚粗品，过滤，得到茶多酚溶液；
2）将茶多酚溶液浓缩，用溶剂A进行萃取，收集有机层，浓缩干燥，用水溶解，得到混合溶液；
3）将混合溶液加入层析柱中，以溶剂B作为流动相进行洗脱，收集洗脱液；
4）利用大孔吸附树脂对洗脱液进行吸附，采用溶剂C进行洗脱，收集洗脱液，减压浓缩后，进行冷冻干燥，即得；
步骤2）中所述溶剂A为乙酸乙酯、异丙醇和正丁醇的混合溶剂，三者体积比为1-3:1-2:1；
步骤3）中所述层析柱吸附采用的树脂为HP-20、HPD-600、PA、LX-8和RS-24中的一种；
步骤3）中所述溶剂B为40-60%乙醇与丙酮的混合溶剂，两者体积比为2-4:1；
步骤4）中所述溶剂C为45-60%乙醇溶液；所述溶剂C洗脱体积控制在1-3BV，洗脱流速为0.8-2 BV/h。
2.根据权利要求1所述的抗糖产品，其特征在于，步骤1）中所述茶多酚粗品与水的质量体积比为1g:30-80mL；所述溶解的温度为30-70℃，时间为1-2h。
3.根据权利要求1所述的抗糖产品，其特征在于，步骤2）中所述茶多酚溶液浓缩至茶多酚粗品的2-10倍量；所述溶剂A为茶多酚粗品的4-10倍量；所述水为茶多酚粗品的4-10倍量。
4.根据权利要求1所述的抗糖产品，其特征在于，步骤3）中所述溶剂B洗脱的流速为1-2BV/h，洗脱的体积为4-6BV。
5.根据权利要求1所述的抗糖产品，其特征在于，步骤4）中所述大孔吸附树脂为HPD450树脂、AB-8 树脂和D180 树脂中的一种。
6.根据权利要求5所述的抗糖产品，其特征在于，步骤4）中所述大孔吸附树脂为AB-8树脂。
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