JP6633717B1 - 肝線維化の予防及び/または治療のための医薬組成物及びその応用 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明の別の目的は、牛樟芝の医薬運用を開発し、その産業価値を高めることである。
好ましくは、該化学式(I)の化合物が肝星細胞を抑制する活性を有する。
好ましくは、該医薬組成物が有効量の該化学式(I)の化合物及び医薬的に許容可能な添加剤を含む。
好ましくは、該医薬的に許容可能な添加剤が、担体、賦形剤、防腐剤、希釈剤、充填剤、結合剤、崩壊剤、吸収促進剤、甘味剤またはその組み合わせを含む。
好ましくは、該化学式(II)の化合物が、牛樟芝の抽出物を分離して得られる。
好ましくは、該医薬組成物が有効量の該化学式(II)の化合物及び医薬的に許容可能な添加剤を含む。
好ましくは、該医薬的に許容可能な添加剤が、担体、賦形剤、防腐剤、希釈剤、充填剤、結合剤、崩壊剤、吸収促進剤、甘味剤またはその組み合わせを含む。
好ましくは、該医薬組成物が、錠剤、カプセル、注射剤、粉類、顆粒剤または飲料である。
好ましくは、該医薬組成物が、5〜95重量%の該化学式(I)及び/または該化学式(II)の化合物を含み、そのうち、該重量%は該医薬組成物の総重量を基礎とする。
好ましくは、該工程(b)が25〜65℃で行われる。
好ましくは、該工程(b)の後さらに、該第1牛樟芝抽出物を乾燥させて粉末形態の該第1牛樟芝抽出物を取得する工程を含む。
好ましくは、該工程(c)の後さらに、該第2牛樟芝抽出物を乾燥させて粉末形態の該第2牛樟芝抽出物を取得する工程を含む。
好ましくは、該工程(d)の後さらに、第4牛樟芝抽出物を取得する工程(e)を含み、該工程(e)が、メタノール水溶液を溶離液として使用し、該第3牛樟芝抽出物を逆相C18シリカカラムに通過させ、該第4牛樟芝抽出物を取得し、そのうち該メタノール水溶液は体積比1:1の95〜100体積%のメタノールと水である。
好ましくは、該工程(e)の後さらに、第5牛樟芝抽出物と、第6牛樟芝抽出物を取得する工程(f)を含み、該工程(f)が、該第4牛樟芝抽出物に薄層クロマトグラフィーを行い、メタノール水溶液を展開溶媒として使用して、該第5牛樟芝抽出物と該第6牛樟芝抽出物を取得し、そのうち該メタノール水溶液は体積比1:1の95〜100体積%のメタノールと水である。
好ましくは、肝線維化の予防・治療のための該第2牛樟芝抽出物の有効量が、0.02〜2.0g/60 kg 体重/日である。
好ましくは、該医薬組成物が5〜95重量%の該牛樟芝抽出物を含み、そのうち該重量%は該医薬組成物の総重量を基礎とする。
上述をまとめると、本発明は、肝線維化の予防及び/または治療のための医薬組成物の製造における牛樟芝から抽出された化合物の応用及び該化合物を含む医薬組成物を提供する。本発明は牛樟芝から抽出した化合物を肝線維化の予防及び/または治療に使用する新規的な医薬的応用であり、牛樟芝の医薬分野における産業的価値を向上することができる。
好ましい一実施態様において、該樹脂はヒドロキシプロピル化デキストランゲル樹脂である。好ましい一実施態様において、商業的に取得可能なヒドロキシプロピル化デキストランゲル樹脂を選択して用いることができ、例えば、SEPHADEX LH−20(Ge Healthcare Life Sciences製)があるが、これに限らない。
好ましい一実施態様において、該第3牛樟芝抽出物をさらに逆相C18シリカカラムに通過させる。続いて、アルコール類水溶液で該カラムを溶離し、第4牛樟芝抽出物を取得する。好ましい一実施態様において、該アルコール類水溶液は、前述の段落中で該第3牛樟芝抽出物の取得に用いたものであり、ここでは説明を省略する。
実験1:本発明の第1牛樟芝抽出物及び第2牛樟芝抽出物の調製。
乾式粉砕または湿式粉砕を経た牛樟芝(科捷生物科技股▲ふん▼有限公司)を秤取し、該牛樟芝の10倍の量の95体積%エタノールを加え、30℃の温度下で3〜5日撹拌し、第1牛樟芝抽出物を取得する。続いて、吸引ろ過で該第1牛樟芝抽出物を濃縮し、抽出物中に残留するエタノールをできるだけ除去する。濃縮した該第1牛樟抽出物を防湿ケース内に入れて乾燥させ、粉末形態の該第1牛樟芝抽出物を取得する。計量結果に基づき計算した収率は18.53%である。
続いて、高速液体クロマトグラフィー法(HPLC)で該第1牛樟芝抽出物及び該第2牛樟芝抽出物を分析する。メタノール、純水またはイソプロピルアルコールとアセトニトリルの混合溶液(混合割合は約1:1)で被測定物を再溶解する。被測定物の溶液を濃度5mg/mLに調整した後、回転速度13500rpmで遠心分離を10分間行う。該被測定物溶液の上清液を取り、試料とする。本実施例で用いるHPLCの具体的な条件は次のとおりである:
ポンプ:Spectra SYSTEM P1000;
オートサンプラー:Spectra SYSTEM AS1000;
検出器:FINNIGAN SURVEYOR PDA Plus;
カラム(固定相):Agilent、XDB−C18、4.6mm×150mm、5μm;
検出器:PDA(紫外線(UV)254nm);
注入体積:5μl;
流速:0.8mL/min;
溶剤(移動相)勾配;
さらに、液体クロマトグラフィータンデム質量分析法(LC/MS)で、取得した該第1牛樟芝抽出物及び該第2牛樟芝抽出物を分析する。メタノールまたは純水で被測定物を再溶解する。被測定物の溶液を濃度10mg/mLに調整した後、回転速度13500rpmで遠心分離を10分間行う。被測定物溶液の上清液を取り、試料とする。本実施例で用いるLC/MSの具体的な条件は次のとおりである:
質量分析装置:Autosampler(Thermo AS3500);
検出器:UV6000LP及びLCQ Fleet mass;
ポンプ:Thermo P1000;
カラム:Thermo Hyper Carb、4mm×100mm、5μm;
検出器:ESI mass(陽イオンモードまたは陰イオンモード)/UV254nm;
注入体積:10μl;
流速:1.0mL/min;
勾配;
(1)抽出物の調製。
ヒドロキシプロピル化デキストランゲルを通じ、該第2牛樟芝抽出物中から第3牛樟芝抽出物を取得する。まず、ヒドロキシプロピル化デキストランゲル顆粒(SEPHADEX LH−20、Ge Healthcare Life Sciences製)をオープンカラム内に入れ、メタノール水溶液でカラムを洗浄する。続いて、別のメタノール水溶液で粉末形態の第2牛樟芝抽出物を再溶解する。再溶解した該第2牛樟芝抽出物を該オープンカラム内に入れ、該メタノール水溶液を溶剤として溶離を行う。カラム溶離で得た溶出液を収集し、これが即ち本実施例の第3牛樟芝抽出物である。第3牛樟芝抽出物を防湿ケース内に入れて乾燥させ、粉末形態の該第3牛樟芝抽出物を取得する。
(1)抽出物の調製。
逆相C18シリカカラム(C18 reversed phase silica gel;Agilent,XDB−C18)で該第3牛樟芝抽出物中から第4牛樟芝抽出物を取得する。まず、メタノール水溶液を溶剤として該カラムを洗浄し、カラム中に該メタノール水溶液を充満させる。続いて、粉末形態の該第3牛樟芝抽出物を少量のメタノールで再溶解して、該カラム内に導入し、該メタノール水溶液で溶離を行う。
実験4:本発明の第5及び第6牛樟芝抽出物の調製。
薄層クロマトグラフィー法(Thin Layer Chromatography)で該第4牛樟芝抽出物中から本発明の第5、第6牛樟芝抽出物を分離する。粉末形態の該第4牛樟芝抽出物を微量の100体積%メタノールで再溶解する。20×20cmの薄層プレート上(TLC aluminium sheets,silica gel 60 F254,MercK)で、メタノール水溶液(100体積%メタノール:=1:1)で再溶解した該第4牛樟芝抽出物を展開させる。短波254ナノメートル紫外線ライトを展開後の薄層プレートに照射すると、2つの色帯を観察することができる。薄層プレート上の2つの色帯を切り取り、メタノール中に10分間浸漬して、色帯上の成分をメタノール中に溶出させる。さらに、吸引ろ過で該メタノールをろ過する。続いて、上述の色帯をメタノールに浸漬する工程を3回繰り返し、2つの区分物を取得し、これらが即ち本実施例の第5及び第6牛樟芝抽出物である。
液体クロマトグラフィータンデム質量分析法で、取得した該第5及び第6牛樟芝抽出物を分析する。実験条件は前述の実験1に記載されているため、ここでは説明を省略する。
さらに質量分析装置で第5牛樟芝抽出物の保持時間9.66分の成分と、第6牛樟芝抽出物の保持時間12.98分の成分をそれぞれ分析する。第5牛樟芝抽出物には、Bruker DMX−500 SB Spectrometerを採用し、500MHzの電磁波を加え、重水素化メタノール(CD3OD)を溶剤としてNMR測定を行う。
[MTT細胞毒殺アッセイ]
まず、ラット肝星細胞(HSC−T6)を細胞培養フラスコ(75T)中で培養し、該培養フラスコを二酸化炭素濃度5%、温度37℃のインキュベータに2〜3日放置する。続いて、0.5%トリプシン(trypsin)で細胞を収集し、収集液を遠心分離する。細胞を96ウェルプレートに播種し(1.5−2.0×104細胞個数/ウェル)、その後該細胞を二酸化炭素濃度5%、温度37℃のインキュベータで培養する。翌日、異なる濃度の牛樟芝抽出物試料を加えて24または48時間後、再びMTT(3−(4,5−Dimethylthiazol−2−yl)−2,5−diphenyltetrazolium bromide)還元法で細胞活性を測定する。96ウェルプレートに各ウェルに12μlのMTT試薬(5mg/ml)を添加した後、37℃のインキュベータ内に入れ、2.5〜3.0時間作用させる。MTT試薬を除去し、100μlの溶解緩衝液(lysis buffer)を加える。該溶解緩衝液の成分組成は50%のN,N−ジメチルホルムアミド(N,N−DMF)と20%のドデシル硫酸ナトリウム(SDS)である。再び96ウェルプレートを37℃のインキュベータ内に入れ、細胞中の紫色結晶を溶出させる。最後に、マイクロプレートリーダーで570nmの吸光値を測定する。処理を経ていない対照群と比較し、牛樟芝抽出物試料を加えた実験群の細胞毒殺割合を計算して得る。下表1に本発明の牛樟芝抽出物のラット肝星細胞に対するIC50濃度を示す。
ピクロシリウスレッド染色定量法(Picro−Sirius red(PSR)staining and spectrophotometric analysis)で本発明の第1牛樟芝抽出物及び第2牛樟芝抽出物のラット肝星細胞の細胞内線維状蛋白含有量に対する影響を測定する。異なる濃度(25、50、100μg/ml)の牛樟芝抽出物でラット肝星細胞を24時間処理する。続いて、メタノールで細胞を固定し、−20℃の冷蔵庫に入れ、一晩置く。リン酸塩緩衝溶液で細胞を2回洗浄した後、適量の0.1%PSR染色剤を加えて室温下で3時間放置する。0.1%ギ酸で余剰染色剤を3回洗い流した後、各ウェルに100μlの0.1N水酸化ナトリウムを加えて線維状蛋白と結合した染色剤を溶出する。最後に、マイクロプレートリーダー(Dynex Technologies MRX spectrophotometer)で540nmの吸光値を測定する。処理を経ていない対照群と比較し、実験群の細胞中の線維状蛋白の含有量割合を算出する。
表2に示す割合で本発明の牛樟芝抽出物と添加剤を使用し、それらを無菌水中で充分に混合して、液体剤形の本発明の医薬組成物を得る。調合した医薬組成物を4℃下で保管する。
Claims (7)
- 次の化学式(I)を有する化合物を含有することを特徴とする肝線維化の予防及び/または治療用医薬組成物。
- 前記化学式(I)の化合物が、5−メチル−ベンゾール[1,3]ジオキソール−4,7−ジオール(5−methyl−benzo[1,3]dioxole−4,7−diol,MBDD)であることを特徴とする、請求項1に記載の医薬組成物。
- 前記化学式(I)の化合物が、牛樟芝の抽出物を分離して得られることを特徴とする、請求項1に記載の医薬組成物。
- 前記化学式(I)の化合物が、肝星細胞を抑制する活性を有することを特徴とする、請求項1に記載の医薬組成物。
- 前記医薬組成物が、有効量の該化学式(I)の化合物及び医薬的に許容可能な添加剤を含むことを特徴とする、請求項1に記載の医薬組成物。
- 前記医薬組成物が、錠剤、カプセル、注射剤、粉類、顆粒剤または飲料であることを特徴とする、請求項5に記載の医薬組成物。
- 前記医薬的に許容可能な添加剤が、担体、賦形剤、防腐剤、希釈剤、充填剤、結合剤、崩壊剤、吸収促進剤、甘味剤またはその組み合わせを含むことを特徴とする、請求項5に記載の医薬組成物。
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