CN106905391B - 一种蓝莓花色苷提取、分离纯化方法 - Google Patents

一种蓝莓花色苷提取、分离纯化方法 Download PDF

Info

Publication number
CN106905391B
CN106905391B CN201710124483.XA CN201710124483A CN106905391B CN 106905391 B CN106905391 B CN 106905391B CN 201710124483 A CN201710124483 A CN 201710124483A CN 106905391 B CN106905391 B CN 106905391B
Authority
CN
China
Prior art keywords
blueberry
extraction
anthocyanin
blueberry anthocyanin
extracting
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201710124483.XA
Other languages
English (en)
Other versions
CN106905391A (zh
Inventor
丘敬华
陈思奇
何伟勤
梁勇
陈忻
陈晓刚
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Foshan Sanshui En Snow Foods Co ltd
Original Assignee
Foshan Sanshui En Snow Foods Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Foshan Sanshui En Snow Foods Co ltd filed Critical Foshan Sanshui En Snow Foods Co ltd
Priority to CN201710124483.XA priority Critical patent/CN106905391B/zh
Publication of CN106905391A publication Critical patent/CN106905391A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN106905391B publication Critical patent/CN106905391B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H17/00—Compounds containing heterocyclic radicals directly attached to hetero atoms of saccharide radicals
    • C07H17/04—Heterocyclic radicals containing only oxygen as ring hetero atoms
    • C07H17/06—Benzopyran radicals
    • C07H17/065—Benzo[b]pyrans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H1/00—Processes for the preparation of sugar derivatives
    • C07H1/06—Separation; Purification
    • C07H1/08—Separation; Purification from natural products
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • C09B—ORGANIC DYES OR CLOSELY-RELATED COMPOUNDS FOR PRODUCING DYES, e.g. PIGMENTS; MORDANTS; LAKES
    • C09B61/00—Dyes of natural origin prepared from natural sources, e.g. vegetable sources
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • C09B—ORGANIC DYES OR CLOSELY-RELATED COMPOUNDS FOR PRODUCING DYES, e.g. PIGMENTS; MORDANTS; LAKES
    • C09B67/00—Influencing the physical, e.g. the dyeing or printing properties of dyestuffs without chemical reactions, e.g. by treating with solvents grinding or grinding assistants, coating of pigments or dyes; Process features in the making of dyestuff preparations; Dyestuff preparations of a special physical nature, e.g. tablets, films
    • C09B67/0096—Purification; Precipitation; Filtration

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Medicines Containing Plant Substances (AREA)
  • Coloring Foods And Improving Nutritive Qualities (AREA)

Abstract

本发明涉及一种蓝莓花色苷提取、分离纯化的方法，该方法的提取步骤包括：S1、将蓝莓洗净、榨汁，待用；S2、将步骤S1所得蓝莓榨汁与提取剂按1:10‑1:25的料液比混合，在常温、压力为100～160Mpa的条件下均质提取1～4次，过滤，合并滤液，得到蓝莓花色苷粗提物。本发明所述方法使得使蓝莓原料中的功效成分更多地溶解到溶剂中，在受到高压作用时，天然产物功效成分会从生物细胞中释放出来，蓝莓花色苷的获得方法更加安全和快速。

Description

一种蓝莓花色苷提取、分离纯化方法
技术领域
本发明属于分离纯化技术领域，具体地涉及一种从蓝莓中提取、分离纯化花色苷的绿色化学工艺技术，更具体地涉及一种采用常温高压均质技术提取、分离纯化蓝莓花色苷的方法。
背景技术
蓝莓又称越橘、蓝浆果，属杜鹃花科越橘属多年生落叶或常绿灌木，其主要有矮丛、高丛、兔眼和半高丛四大类型。果实扁圆形，成熟后为深蓝色。蓝莓果实含有丰富的花色苷，另外还含有碳水化合物、有机酸、纤维素、Vc、黄酮、钾、钙、磷等矿物质。由于蓝莓果富含花青甙、低糖、低脂肪，抗氧化能力强，因此被国际粮农组织列为人类5大健康食品之一。随着人们生活水平的提高，蓝莓以独特的风味、较强的营养保健功能日益受到人们关注，被列入世界第3代水果行列。
受品种、种植条件等各方面的影响，蓝莓果实中各成分含量为：总糖约8.0％-12.0％，总酸0.20％-1.0％(柠檬酸计)，蛋白0.20％-0.70％，脂肪0.20％-0.60％。此外，由于蓝莓含有较高的多酚类物质0.30％-0.50％，花色苷0.10％-0.20％，黄酮0.05％-0.20％，以及大量的纤维素，维生素C，果胶和超氧化物歧化酶等，使其具有较高的生理活性和药用保健价值。据报道，蓝莓果实具有以下保健功能：(1)增强人体的免疫力，延缓衰老；(2)保护血管，降低心血管疾病的发病率，同时可降低糖尿病的发病危险及并发症的产生；(3)改善退行性老年痴呆；(4)激活巨噬细胞，保护细胞内基因不被攻击；(5)降低癌症的发病率；(6)降低低密度脂蛋白(LDL)的氧化，避免动脉硬化；(7)抗发炎，对非菌性炎症(如关节炎等疾病)有防治作用；(8)增强皮肤的弹性，促进皮肤的健康；(9)预防尿道感染；(10)促进视红素再合成、预防视力受损。
要充分、高效、精细的利用好蓝莓资源，首先要解决蓝莓“有效成分提取”问题，大量实验证明天然产物具有很好的生物和药理活性，但有效成分低，在高温下热敏性的物质容易受到破坏。因此如何实现既能高效提取又能避免有效成分的破坏，成为蓝莓有效成分提取要解决的首要问题。
目前，花色苷的纯化方法中主要有柱色谱法、膜分离法、重结晶法和分级醇沉淀法。
柱色谱法：目前大多数采用凝胶、聚酰胺、硅胶、离子交换树脂、大孔树脂等填料。经典方法是采用AB-8等非极性大孔树脂对花色苷粗提物进行柱分离，喷雾干燥得到花色苷产品。
膜分离法：利用滤膜孔径的大小而通过或截留不同的物质，达到分离、提纯的目的。花色苷纯化过程中常用超滤(UF)、反渗透(RO)、电渗析(ED)等膜分离技术。
重结晶法：向含有花色苷的溶液中加入5％醋酸铅，使色素沉淀，再用盐酸酸化的乙醇溶解花色苷并去除形成的氯化铅沉淀，得到较高纯度的花色苷。
分级醇沉淀法：通过多次、反复的调整乙醇浓度使得多糖、蛋白质和淀粉等大分子物质沉淀，达到纯化的目的。
蓝莓果实化学成分复杂，既含有易溶于乙醇等极性溶剂的酚类活性成分，也含有易溶于水或缓冲液的蛋白质、酶、多糖等水溶性生物大分子杂质和鞣质、有机酸、低聚糖等不溶性生物小分子杂质。显然上述有关蓝莓果花色苷的提取、分离纯化方法虽能制备具有一定纯度和得率的蓝莓花色苷提取物，但由于受到技术手段的限制以及加工过程中使用了大量的有毒有机溶剂或化学制剂，使得产品明显存在安全性欠佳或纯度与得率不高、设备成本过高、产品的品质和市场竞争力不足等缺陷。
发明内容
为了解决现有技术中存在的上述问题，本发明提供一种蓝莓花色苷提取、分离纯化方法，该方法使得使蓝莓原料中的功效成分更多地溶解到溶剂中，在受到高压作用时，天然产物功效成分会从生物细胞中释放出来，该方法保持高提取率的前提下，有效成分不被高温破坏。
本发明的技术目的是通过以下技术方案实现的：
本发明所述的蓝莓花色苷的提取、分离纯化方法，该方法的提取步骤包括：
S1、将蓝莓洗净、榨汁，待用；
S2、将步骤S1所得蓝莓榨汁与提取剂按1:10-1:25的料液比混合，在常温、压力为100～160Mpa的条件下均质提取1～4次，过滤，合并滤液，得到蓝莓花色苷粗提物。
本发明优选地，所述步骤S2中的提取剂为pH＝1～2的80％乙醇溶液。
本发明优选地，所述步骤S2中蓝莓榨汁与提取剂的料液比为1:20g/mL。
本发明优选地，所述步骤S2提取的压力为150MPa，提取的次数2次。
本发明进一步地，所述的分离纯化步骤包括：
S3、以HPD600大孔树脂为柱填料，采用湿法装柱得到均匀分散的大孔树脂分离柱，将步骤S3得到的蓝莓花色苷粗提物湿法上样，然后用低度乙醇(20％乙醇)冲洗上样后的分离柱,依次用不同浓度梯度的乙醇溶液顺序进行洗脱、点板、收集并合并薄层图谱相同的洗脱液、浓缩。
本发明优选地，所述步骤S3前还需进行预处理：将蓝莓花色苷粗提物在乙醇溶液下回流。
本发明更优选地，所述预处理步骤中乙醇溶液的体积浓度为80％～95％，回流时间为1.5h～2h。
本发明进一步地，还包括步骤S4：将步骤S3所得浓缩物进行干燥、结晶、重结晶、纯化即得。
本发明优选地，所述步骤S3中低度乙醇的体积浓度为20％；所述步骤S3中纯化条件还包括：吸附流速0.5－2.0mL/min，洗脱流速1.0mL/min，反应温度为30℃，吸附平衡时间4-5h，解析时间2-3h。
本发明优选地，所述步骤S3中依次用体积浓度为20％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％进行洗脱。
本发明的有益效果：
1、以常温高压提取技术，将预处理过的原料置于高压设备中进行高压处理，使原料中的功效成分更多地溶解到溶剂中，在受到高压作用时，蓝莓功效成分会从生物细胞中释放出来，解决了蓝莓有效成分在保持高提取率的前提下，有效成分不被高温破坏。
2、本发明所述的蓝莓花色苷提取、分离纯化方法相对其他方法更加快速、高效。
说明书附图
图1a是正交实验设计中压强对蓝莓花色苷提取效果的影响。
图1b是正交实验设计中料液比对蓝莓花色苷提取效果的影响。
图1c是正交实验设计中高压次数对蓝莓花色苷提取效果的影响。
图2是单因素条件试验中压强对蓝莓花色苷提取效果的影响。
图3是单因素条件试验中料液比对蓝莓花色苷提取效果的影响。
图4是单因素条件试验中高压次数对蓝莓花色苷提取效果的影响。
图5是不同提取方法对提取蓝莓花色苷的含量比较。
图6a是溶剂浸取法提取蓝莓花色苷HPLC色谱图。
图6b是超声提取法提取蓝莓花色苷HPLC色谱图。
图6c是常温高压均质法提取蓝莓花色苷HPLC色谱图。
图7是不同提取方法提取蓝莓花色苷HPLC色谱图比较。
图8a是以硅胶为柱填料的洗脱液薄层图谱。
图8b是以聚酰胺为柱填料的洗脱液薄层图谱。
图8c是以HPD600大孔吸附树脂为柱填料的洗脱液薄层图谱。
图9是不同柱填料所得纯化品的吸光度。
图10是纯化品制备的工艺流程图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案和优点更加明确，下面对本发明的优选实施例进行详细的描述。
常温高压连续提取技术，是将预处理过的原料置于高压设备中进行高压处理，使原料中的功效成分更多地溶解到溶剂中，在受到高压作用时，天然产物功效成分会从生物细胞中释放出来。
实施例中所用到的仪器和材料如下：
实验仪器：超声波清洗仪、UNICO-2000型紫外可见分光光度计、电控温水浴加热器、JN-02C型高压均质机、Odyssil C18色谱柱、榨汁机、Lc-10Atvp液相色谱仪、SHZ-DⅢ型循环水真空泵。
原料及主要试剂：蓝莓原果、无水乙醇、浓盐酸、氯化钾磷酸氢二钠、柠檬酸、乙腈、甲酸、磷酸。
一、前处理
1、样品前处理及萃取液配制
蓝莓样品：用蒸馏水洗净晾干备用。
80％酸化乙醇的配制：量取400mL无水乙醇用蒸馏水定容至500mL，然后滴加几滴浓盐酸调节pH＝1～2。
2、缓冲溶液的配制
pH＝1.0的HCl-KCl缓冲溶液的配制：以25:67的比例量取0.2mol/L盐酸和0.2mol/L KCl溶液，混合摇匀备用。
pH＝5.0的Na2HPO4-柠檬酸缓冲溶液的配制：准确称取17.9070g Na2HPO4固体和5.2525g柠檬酸固体，分别用蒸馏水定容至250mL，混合摇匀备用。
二、蓝莓花色苷含量分析方法的建立
利用pH示差法建立起蓝莓花色苷含量的分析方法：
C(mg/100g)＝100×(A0-A1)×V×n×M/(ε×m)
式中：A0、A1分别为pH1.0、pH5.0时蓝莓花色苷在520nm处的吸光值；V为提取液总体积(mL)；n为稀释倍数；M为Cy-3-Glu(矢车菊色素-3-葡萄糖苷)的相对分子质量(449)；ε为Cy-3-Glu的消光系数((29600)；m为样品质量(g)。
三、蓝莓花色苷提取、分离纯化工艺研究
实施例1蓝莓花色苷提取工艺研究
以蓝莓花色苷作为测定指标，以提取压力、料液比、提取次数三个因素作为考察指标因素，对蓝莓花色苷提取效率进行系统考察，首先进行压力、料液比、提取次数对花色苷提取含量单因素实验，然后进行L9(33)含量正交实验设计，优化常温高压提取的工艺。找出蓝莓花色苷提取率影响的主次顺序，提出最优的提取方案。
3.1正交实验
固定蓝莓榨汁样质量为10.0g、溶液pH为1.0、萃取剂为80％乙醇溶液。选取压强、料液比、实验次数为考察影响因素，设计正交实验L9(33)(如表1所示)进行高压均质处理后抽滤。再分别移取2mL并用pH＝1.0的HCl-KCl缓冲溶液和pH＝5.0的Na2HPO4-柠檬酸缓冲溶液各自定容至25mL后，用紫外分光光度计测定其吸光度值，记录最大吸收波长及该波长下的吸光度，通过pH示差法计算花色苷含量。平行测定3次，求均值。
表1正交实验L9(33)实验因素与水平选择表
Figure BDA0001238037300000051
表2正交实验结果表
Figure BDA0001238037300000061
由表1～2可以看出，高压法对蓝莓花色苷提取效果的主要影响因素是高压压强，其次是料液比以及高压次数。分别绘制压强、料液比、高压次数趋势图(如图1a～1c)，可大致推测提取率随三个因素的变化情况：在一定范围内，提取率随着压强和高压次数的增大而升高，随着料液比的增大先升高再降低。
3.2单因素条件实验
根据正交实验结果，设计以下单因素实验条件，分别考察压强，料液比和高压次数对提取效果的影响，并且得出最佳高压提取条件。
3.2.1压强
固定蓝莓榨汁样质量为10.0g，溶剂为pH＝1.0的80％乙醇溶液，提取温度为25℃，料液比为1:10，高压次数2次，分别于120MPa、140MPa、150MPa、160MPa下进行高压均质提取。分别移取1mL滤液并用pH＝1.0的HCl-KCl缓冲溶液和pH＝5.0的Na2HPO4-柠檬酸缓冲溶液各自定容至25mL，用紫外分光光度计测定其吸光度值，记录最大吸收波长及该波长下的吸光度，通过pH示差法计算花色苷含量。平行测定3次，求均值，如表3所示。
表3压强对蓝莓花色苷提取效果的影响
Figure BDA0001238037300000071
由表3及图2可知，在一定范围内，蓝莓花色苷的提取量随着压强的增大而显著增大，但当压强到了140MPa以上，提取效果受压强的影响开始减小。而当压强超过150MPa以后，蓝莓花色苷随压强增大不增反降。由此可见，常温高压提取蓝莓花色苷的最佳压力条件为150MPa。
因为在一定范围内较高的压强更有利于蓝莓细胞的破碎，使得蓝莓花色苷能更好地从细胞中被释放出来溶解在溶剂中，从而提高了花色苷的提取效果。但是压强过大时(>1500MPa)，花色苷提取量变少，推测原因为高压条件导致机器温度升高，使得热稳定差的花色苷受热部分分解。
3.2.2料液比
固定蓝莓榨汁样质量为10.0g、溶剂为pH＝1.0的80％乙醇溶液，提取温度为25℃、提取压强为150MPa、高压次数为2次，分别配制料液比为1:10、1:15、1:20、1:25的蓝莓溶液，进行高压均质提取。分别移取1mL滤液并用pH＝1.0的HCl-KCl缓冲溶液和pH＝5.0的Na2HPO4-柠檬酸缓冲溶液各自定容至25mL，用紫外分光光度计测定其吸光度值，记录最大吸收波长及该波长下的吸光度，通过pH示差法计算花色苷含量。平行测定3次，求均值，结果如表4所示。
表4料液比对蓝莓花色苷提取效果的影响
Figure BDA0001238037300000072
由表4及图3可见，随着液料比的增加，料液比为1:20时蓝莓花色苷提取效果明显好于1:10或者1:15，这是因为液料比的增加有利于花色苷的溶出。但当从1:20增加到1:25时，蓝莓花色苷的提取量则没有明显的变化，甚至提取量有所下降。综合蓝莓花色苷提取量和提取成本两个因素进行考虑，可确定蓝莓质量：提取剂体积＝1:20g/mL为最佳液料比。
3.2.3高压次数
固定蓝莓榨汁样质量为10.0g、溶剂为pH＝1.0的80％乙醇溶液，提取温度为25℃、提取压强为150MPa、料液比为1:10，分别过高压均质机1、2、3、4次进行提取。分别移取1mL滤液并用pH＝1.0的HCl-KCl缓冲溶液和pH＝5.0的Na2HPO4-柠檬酸缓冲溶液各自定容至25mL，用紫外分光光度计测定其吸光度值，记录最大吸收波长及该波长下的吸光度，通过pH示差法计算花色苷含量。平行测定3次，求均值，结果如表5所示。
表5高压次数对蓝莓花色苷提取效果的影响
Figure BDA0001238037300000081
由表5和图4可知，蓝莓花色苷的提取量随着高压次数的增多而增加，但当高压次数达到2次以上，则增幅不明显，花色苷提取效果几乎不再随高压次数的变化而变化。这说明高压2次就足以将绝大部分的花色苷从蓝莓中提取出来，综合考虑提取效果和成本因素，确定常温高压提取蓝莓花色苷的最佳高压次数条件为2次。
综上所述，我们可得出常温高压均质法提取蓝莓花色苷的最佳工艺参数为：压强150MPa，料液比1:20(g/mL)，高压次数2次。在这样的条件下提取蓝莓花色苷含量可高达238.314mg/100g。
3.3不同提取方法提取蓝莓花色苷的HPLC色谱图比较
3.3.1样品处理
用溶剂浸取法、超声提取法、常温高压均质法提取蓝莓花色苷(样品均在三种方法的最佳条件下制备)，再用10％磷酸溶液稀释，得到3组样品。具体操作如下：
(1)、称量5.0g蓝莓，量取50mL pH为3.5的50％酸化乙醇，两者混合至于搅拌机中搅拌5min，然后置于电控温水浴加热器中，50℃避光提取60min后抽滤，保留滤液。加10％磷酸稀释至4倍，得到样品1。
(2)、称量5.0g蓝莓，量取100mLpH为1的60％酸化乙醇，两者混合至于搅拌机中搅拌5min，然后置于40℃避光超声40min，抽滤，保留滤液。加10％磷酸稀释至2倍，得到样品2。
(3)、称量5.0g蓝莓，量取100mLpH为1的80％酸化乙醇两者混合至于搅拌机中搅拌5min，然后在150MPa的压力下常温高压两次。加10％磷酸稀释至2倍，得到样品3。
表6不同提取方法提取蓝莓花色苷的含量比较
Figure BDA0001238037300000091
由图5可见，相比于溶剂浸取法和超声提取法，常温高压法提取蓝莓花色苷有明显优势：
1.高压均质法提取蓝莓花色苷在常温下操作即可，无须水浴加热，简单方便又节约成本；
2.相比于其他两种方法，常温高压均质法提取蓝莓花色苷时间极短，大大减少了生产时间；
3.常温高压均质法提取蓝莓花色苷效果最好，提取量远远高于浸取法和超声法。
综上所述，常温高压均质法是提取蓝莓花色苷的最佳方法。
3.3.2色谱条件
Odyssil C18色谱柱(5μm,
Figure BDA0001238037300000092
4.6*250mm)；
流动相：乙腈(A)-10％甲酸水溶液(B)；
梯度洗脱：0-10min:5％-20％A
10-15min:20％-35％A
15-30min:35％-50％A
进样体积：20μL；
流速：1mL/min；
检测波长：520nm
由图6a～6c及图7可见，常温高压均质法提取的蓝莓花色苷样品色谱图各峰明显高于溶剂浸取法和超声提取法，由此进一步证明常温高压均质法是提取蓝莓花色苷的极佳方法。
实施例2蓝莓花色苷分离纯化方法的研究
分别以硅胶、聚酰胺树脂、HPD600大孔吸附树脂作为柱层析的填料，纯化蓝莓花色苷粗提物。以不同树脂所得到的各梯度洗脱液中花色苷含量和花色苷得率为衡量指标，筛选纯化花色苷的柱层析填料，本实验采用乙醇溶液作为洗脱剂。
4.1树脂的预处理
硅胶：层析硅胶应是中性无色颗粒，但由于制作过程常带有酸性，此外还应检查其中是否含有铁离子。a.铁离子的检查：取适量硅胶，混悬于盐酸中，搅拌，如含有铁离子则与盐酸结合成复合物而现黄色，此时就需以盐酸洗涤处理，后以水洗至中性；b.硅胶pH值的检测：取适量硅胶，于蒸馏水中浸泡过夜，过滤，测定浸泡液pH值，如为酸性，水洗至中性。
聚酰胺树脂：聚酰胺树脂吸附属于氢键吸附。常用的聚酰胺为聚己内酰胺，预处理方法为：取适量聚酰胺树脂，用乙醇溶液回流提取一段时间，后用蒸馏水洗至澄清，备用。
大孔吸附树脂：根据花色苷的极性，选用了中极性的HPD600大孔吸附树脂作为柱层析填料。大孔吸附树脂可能含有分散剂、致孔剂、惰性溶剂等化学残留，所以使用前按以下步骤进行预处理：
a.于吸附柱内加入相当装填树脂一定体积的水，然后将新大孔树脂投入柱中，把过量的水从柱底放出，并保持水面高于树脂层表面一定距离。
b.从树脂低部缓缓加水，逐渐增加水的流速使树脂床接近完全膨胀，保持这种反冲流速直到所有气泡排尽，所有颗粒充分扩展，小颗粒树脂冲出。
c.分别用一定柱体积的乙醇，以一定流速通过树脂层，并保持液面高度，浸泡过夜。
d.用去离子水以一定流速通过树脂层，洗净乙醇。
f.分别用一定浓度的HCl、NaOH溶液，以一定流速通过树脂层，并浸泡一段时间，而后用去离子水以同样流速洗至水洗液呈中性。
4.2纯化树脂的选择
4.2.1从薄层图谱上来看
蓝莓花色苷粗提物上柱后，分别用蒸馏水(可选步骤)、20％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％的乙醇溶液(体积浓度)梯度洗脱，同时，每0.1BV(柱体积)取样，跑板，合并薄层图谱相同的洗脱液，得到不同柱填料洗脱过程的薄层图谱如图8a～图8c所示。其中1－0％乙醇洗脱液；2－20％乙醇洗脱液；3－40％乙醇洗脱液；4－50％乙醇洗脱液；5－60％乙醇洗脱液；6－70％乙醇洗脱液；7－80％乙醇洗脱液；8－90％乙醇洗脱液；9－95％乙醇洗脱液；10－蓝莓花色苷粗提物。
从薄层图谱中可以看出：以硅胶为柱层析填料时，粗提物中大部分物质被硅胶所吸附，洗脱剂不易将各部分洗脱下来，各组分间难以分离。以聚酰胺为柱层析填料时，各物质间的分离效果好，成点性佳。但当用蒸馏水洗脱时，部分花色苷类物质先被洗脱下来，然后是部分黄酮类化合物。花色苷类化合物主要在洗脱剂乙醇浓度为20％到50％的范围内，在此范围内，各种花色苷类物质也得到了较好的分离。当洗脱剂浓度大于50％时，大部分黄酮类化合物被洗脱下来，无花色苷类物质，观察柱顶端填料，发现颜色较浅。以HPD600大孔吸附树脂为柱层析填料时，各物质间的分离效果较好，成点性较佳，花色苷类物质在蒸馏为洗脱剂下被洗脱出来，观察洗脱液，发现其颜色不深，柱顶端填料颜色较深，由此可知，花色苷类物质部分被洗脱下来。
4.2.2从花色苷含量上来看
据薄层图谱，将含有花色苷类物质的洗脱液合并，干燥。取一定量的纯化品，溶于pH3.0磷酸氢二钠－柠檬酸缓冲液溶解中，测定其在510nm下的吸光度，得出的数据见图9。从图中可以看出，分别以硅胶，HPD600大孔吸附树脂、聚酰胺为柱填料对花色苷粗提物进行纯化时，硅胶得到的花色苷类物质最少，聚酰胺较多，HPD600大孔吸附树脂最多,分别是硅胶的7.94倍和聚酰胺的1.5倍。同时可以得出，大部分花色苷类化合物在乙醇浓度为20％到50％的范围内被洗脱下来，工艺流程如图10。
花色苷含量的测定：
花色苷含量(％)＝(SODpH1.0－SODpH5.0)W标M标V标/△A标W样V标
＝(0.907－0.175)×5×0.99/0.78×10
＝46.45％
纯化品花色苷的含量为46.45％，符合国际上规定花色苷含量需达到25％以上的要求。
4.3最终确定的蓝莓花色苷分离纯化方法
将常温高压得到的蓝莓花色苷在95％乙醇下回流2小时以便进一步将分散粗提物，因为花色苷粗提物中可能存在膏状物，也可以使用溶剂直接溶解所述花色苷粗提物来分散所述粗提物。此预处理步骤为优选步骤。同时，将HPD600大孔树脂采用湿法装柱，得到均匀分散的大孔树脂分离柱，将得到的蓝莓花色苷粗提物湿法上样，然后用20％体积浓度的乙醇(少量低浓度乙醇溶液即可)冲洗上样后的柱子。然后采用乙醇从低浓度到高浓度的顺序进行洗脱，乙醇的浓度区间为20％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％，并点板，合并薄层图谱相同的洗脱液，并浓缩、干燥、结晶、重结晶、纯化，得到分离纯化的蓝莓花色苷。其中纯化条件还包括：吸附流速0.5－2.0mL/min，最佳吸附流速为1.0mL/min，洗脱流速1.0mL/min，反应温度为30℃，吸附平衡时间4-5h，解析时间2-3h。若有其他未涉及的参数，采用常规参数即可。
显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无法对所有的实施方式予以穷举。凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。

Claims (7)

1.一种蓝莓花色苷的提取、分离纯化方法，其特征在于，该方法的提取步骤包括：
S1、将蓝莓洗净、榨汁，待用；
S2、将步骤S1所得蓝莓榨汁与提取剂按1:10-1:25的料液比混合，在常温、压力为100～160Mpa的条件下均质提取1～4次，过滤，合并滤液，得到蓝莓花色苷粗提物；
所述步骤S2中的提取剂为pH＝1～2的80％乙醇溶液；
所述的分离纯化步骤包括：
S3、以HPD600大孔树脂为柱填料，采用湿法装柱得到均匀分散的大孔树脂分离柱，将步骤S2得到的蓝莓花色苷粗提物湿法上样，然后用低度乙醇冲洗上样后的分离柱,依次用不同浓度梯度的乙醇溶液顺序进行洗脱、点板、收集并合并薄层图谱相同的洗脱液、浓缩；所述步骤S3中低度乙醇的体积浓度为20％；所述步骤S3前还需进行预处理：将蓝莓花色苷粗提物在乙醇溶液下回流。
2.根据权利要求1所述的蓝莓花色苷的提取、分离纯化方法，其特征在于，所述步骤S2中蓝莓榨汁与提取剂的料液比为1:20g/mL。
3.根据权利要求1所述的蓝莓花色苷的提取、分离纯化方法，其特征在于，所述步骤S2提取的压力为150MPa，提取的次数2次。
4.根据权利要求1所述的蓝莓花色苷的提取、分离纯化方法，其特征在于，所述预处理步骤中乙醇的体积浓度为80％～95％，回流时间为1.5h～2h。
5.根据权利要求1所述的蓝莓花色苷的提取、分离纯化方法，其特征在于，还包括步骤S4：将步骤S3所得浓缩物进行干燥、结晶、重结晶、纯化。
6.根据权利要求1所述的蓝莓花色苷的提取、分离纯化方法，其特征在于，所述步骤S3中纯化条件还包括：吸附流速0.5－2.0mL/min，洗脱流速1.0mL/min，反应温度为30℃，吸附平衡时间4-5h，解析时间2-3h。
7.根据权利要求1所述的蓝莓花色苷的提取、分离纯化方法，其特征在于，所述步骤S3中依次采用体积浓度为20％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％进行洗脱。
CN201710124483.XA 2017-03-03 2017-03-03 一种蓝莓花色苷提取、分离纯化方法 Active CN106905391B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710124483.XA CN106905391B (zh) 2017-03-03 2017-03-03 一种蓝莓花色苷提取、分离纯化方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710124483.XA CN106905391B (zh) 2017-03-03 2017-03-03 一种蓝莓花色苷提取、分离纯化方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN106905391A CN106905391A (zh) 2017-06-30
CN106905391B true CN106905391B (zh) 2020-06-12

Family

ID=59186611

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201710124483.XA Active CN106905391B (zh) 2017-03-03 2017-03-03 一种蓝莓花色苷提取、分离纯化方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN106905391B (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109507353A (zh) * 2019-01-04 2019-03-22 安徽农业大学 一种黑小麦麸皮中花色苷的高效液相色谱检测方法

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2002017732A2 (en) * 2000-08-31 2002-03-07 Tempesta, Michael, S. Efficient method for producing compositions enriched in anthocyanins
CN101549008A (zh) * 2009-05-21 2009-10-07 华南师范大学 高压连续提取的决明子提取物在降血脂药物制备中的应用
CN102285953A (zh) * 2011-07-01 2011-12-21 湖南农业大学 以hp2mgl大孔树脂分离纯化蓝莓花色苷的方法
CN103145780A (zh) * 2012-12-20 2013-06-12 天津科技大学 一种蓝莓花色苷的制备方法与所制备的蓝莓花色苷的应用
CN105175463A (zh) * 2015-08-31 2015-12-23 桂林茗兴生物科技有限公司 蓝莓花色苷的提取工艺

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2002017732A2 (en) * 2000-08-31 2002-03-07 Tempesta, Michael, S. Efficient method for producing compositions enriched in anthocyanins
CN101549008A (zh) * 2009-05-21 2009-10-07 华南师范大学 高压连续提取的决明子提取物在降血脂药物制备中的应用
CN102285953A (zh) * 2011-07-01 2011-12-21 湖南农业大学 以hp2mgl大孔树脂分离纯化蓝莓花色苷的方法
CN103145780A (zh) * 2012-12-20 2013-06-12 天津科技大学 一种蓝莓花色苷的制备方法与所制备的蓝莓花色苷的应用
CN105175463A (zh) * 2015-08-31 2015-12-23 桂林茗兴生物科技有限公司 蓝莓花色苷的提取工艺

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"大孔树脂纯化蓝莓果中花色苷的研究";李颖畅，等;《食品与生物技术学报》;20090731;第28卷(第4期);第496-500页 *
"高压均质提取山楂叶有效成分";钟汉左，等;《精细化工》;20070930;第24卷(第9期);第890-894页 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN106905391A (zh) 2017-06-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR101653899B1 (ko) 징코라이드의 추출 분리 방법
EP2212004B1 (en) Method to recover bioactive compounds
CN105998109B (zh) 一种芒果核多酚提取物及其制备方法
CN105777697A (zh) 一种从紫薯中提取高纯花青素方法
EP3689360A1 (en) Method for producing purified salacia genus plant extract, and purified salacia genus plant extract
CN103183616B (zh) 一种从红腺忍冬叶制备绿原酸的方法
CN106905391B (zh) 一种蓝莓花色苷提取、分离纯化方法
CN105153253B (zh) 紫甘薯花色苷的提取工艺
ITRM20060233A1 (it) Metodo per la preparazione e l uso di un estratto arricchito in cianidina 3 o beta glucopiranoside e suoi derivati da frutti e vegetali conenti detta antocianina e per la purificazione e l uso di cianidina 3 o beta glucopiranoside e suoi derivati da
CN106928309B (zh) 一种螺旋甾碱烷型糖苷生物碱及其制备方法与用途
CN110563584B (zh) 提取纯化胎菊中绿原酸的方法
CN106138130B (zh) 一种芒果核黄酮提取物及其制备方法
JP2004210682A (ja) カンキツ機能性成分高含有組成物の製造方法
CN109912582A (zh) 从芒果叶中提取芒果苷的方法
CN106187975B (zh) 一种提高米糠酚类物质生物活性的制备及纯化方法
CN113214233A (zh) 一种从芒果核中提取纯化芒果苷的方法
CN1334267A (zh) 三七总甙的制备方法
CN110354155A (zh) 一种赶黄草中黄酮类物质的提取方法
KR100883340B1 (ko) 고농도의시아니딘­３­ｏ­（２ｇ­ｏ­자일로실루티노사이드）를오미자로부터 추출하는 방법
WO2022264600A1 (ja) 羅漢果抽出物とその製造方法
CN108690103B (zh) 一种以莱菔子为原料制备高纯度萝卜苷提取物的方法
CN113024616A (zh) 一种芒果核单宁酸的制备方法
KR20030010011A (ko) 녹차로부터 얻어진 에피갈로카테킨 갈레이트의 추출방법
CN105884842B (zh) 从红枣叶中制备槲皮素-3-O-α-L-阿拉伯糖-(1→2)-α-L-鼠李糖苷及其应用
CN115417848A (zh) 一种从黑豆中同时提取分离异黄酮、原花青素和水溶性多糖的方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant